大鼠耳蜗血管纹边缘细胞原代培养及心钠素的表达

目的探讨心钠素（atrial natriuretic peptide,ANP）在原代培养大鼠耳蜗血管纹边缘细胞（marginal cell,MC）中是否表达。方法应用细胞培养技术原代培养MC,并进行鉴定、纯化,应用免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测原代培养的MC中ANP及其mRNA的表达情况。结果培养细胞经免疫细胞化学检测其CK-18蛋白表达阳性,证明其为上皮来源的MC。免疫细胞化学检测在原代培养的边缘细胞胞体内发现ANP免疫反应阳性颗粒,RT-PCR方法扩增出编码ANP的目的条带。结论本实验表明原代培养的边缘细胞具有合成和分泌ANP的能力,提示边缘细胞在维持内耳微环境稳定方面具有调节作用。     

嗅感觉神经细胞的分离与培养

目的 建立哺乳动物嗅感觉神经细胞体外培养的方法。方法取成年家兔的嗅区粘膜,用胰酶和胶原酶消化法进行嗅感觉神经细胞的分离与原代培养,并应用抗神经微丝蛋白(NFP)抗体、抗嗅觉标记蛋白(OMP)抗体进行免疫细胞化学染色,同时采用甲苯胺蓝神经特异性染色和扫描电镜对其进行鉴定。结果 从嗅粘膜分离以及原代培养得到的嗅感觉神经元,光镜、电镜下为典型的双极神经元,OMP、NFP阳性,神经元特异性染色阳性。分离的嗅感觉神经元可在体外存活数小时,其细胞形态、生存数量和存活时间均能满足体外实验的基本要求。结论 本实验在家兔建立了较稳定、可靠的嗅感觉神经细胞分离和原代培养方法。为深入开展嗅感觉神经细胞的离体研究,提供了较为理想的材料来源和技术保障。     

α2-肾上腺素能受体在水杨酸钠诱导大鼠耳蜗螺旋神经节神经元兴奋毒性中的表达变化

目的 观察α₂-肾上腺素能受体(α₂-adrenergic receptor, α₂-AR)在大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron, SGN)中的分布，以及水杨酸钠(sodium salicylate, SS)作用SGN不同时间点后α₂-AR各亚型的表达改变，以探讨其在SGN兴奋毒性中的作用。方法 将新生SD大鼠随机分成：对照组、SS处理6 h组、SS处理12 h组和SS处理24 h组，每组2只。急性分离各组SGN后进行原代培养48 h,对照组用新的培养基培养，不做处理，余三组分别用5 mM水杨酸钠处理6 h、12 h、24 h,用免疫荧光染色技术检测SGN中α₂-AR各亚型的表达情况；采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot方法检测SS作用不同时间后α₂-AR各亚型的mRNA和总蛋白表达改变情况。结果 (1)免疫荧光染色表明SGN上存在α_2A-AR、α_2B     

嗅感觉神经细胞的分离与培养

目的 建立哺乳动物嗅感觉神经细胞体外培养的方法。方法 取成年家兔的嗅区粘膜，用胰酶和胶原酶消化法进行嗅感觉神经细胞的分离与原代培养，并应用抗神经微丝蛋白(NFP)抗体、抗嗅觉标记蛋白(OMP)抗体进行免疫细胞化学染色，同时采用甲苯胺蓝神经特异性染色和扫描电镜对其进行鉴定。结果 从嗅粘膜分离以及原代培养得到的嗅感觉神经元，光镜、电镜下为典型的双极神经元，OMP、NFP阳性，神经元特异性染色阳性。分离的嗅感觉神经元可在体外存活数小时，其细胞形态、生存数量和存活时间均能满足体外实验的基本要求。结论 本实验在家兔建立了较稳定、可靠的嗅感觉神经细胞分离和原代培养方法。为深入开展嗅感觉神经细胞的离体研究，提供了较为理想的材料来源和技术保障。     

新生大鼠耳蜗前体细胞的培养及鉴定

目的对新生大鼠耳蜗前体细胞进行分离、培养和鉴定。方法从出生7天的大鼠耳蜗中分离、培养前体细胞,用免疫细胞化学的方法对前体细胞进行鉴定;血清诱导分化后鉴定分化潜能,进一步了解其多向分化特性。结果原代培养的细胞,培养1d后即可见"细胞球"。细胞球内大部分细胞呈nestin、musashi1、pax2和BrdU阳性,表明其具有自我更新及有丝分裂的能力。细胞球经诱导分化14d后,对分化细胞行免疫细胞化学鉴定,发现分化细胞表达毛细胞标志物myosin VIIA和phalloidin,表达成熟神经元标志物NeuN,表达不成熟神经元标志物Tuj1,表达星形胶质细胞标志物GFAP,表达少突胶质细胞标志物galactocerebroside,以及谷氨酸能神经元标志物GluR-1,证明其具有多向分化潜能。结论本实验证明耳蜗前体细胞具有神经干细胞的多向分化潜能,为研究通过基因治疗的方法促进耳蜗神经细胞增殖提供了一种体外模型。     

神经元核心抗原在小鼠嗅球和嗅上皮发育中的表达

目的：探讨神经元核心抗原（NeuN）在嗅球和嗅上皮发育过程中的表达特性和意义。方法：在小鼠胚胎发育9．5、11．5、14．5、17．5d，出生当天和3个月成年个体的头部切片标本中，以免疫荧光染色方法检测NeuN的表达。结果：刚出生小鼠嗅球内层状结构尚不明显，NeuN表达于嗅球周边区域。在3个月大成年小鼠，嗅球的层状结构已清晰可见，NeuN表达阳性的成熟神经元主要聚集于接近嗅球中心的颗粒细胞层。位于嗅上皮的双极嗅感觉神经元在小鼠胚胎和成年个体中均未见NeuN表达。结论：NeuN通常被认为表达于几乎所有部位的成熟神经元。但在嗅球和嗅上皮中，NeuN只表达于成熟嗅球中的颗粒细胞层。小鼠出生到发育为成熟个体的过程中，NeuN表达阳性的成熟神经细胞由周边逐渐向嗅球中心迁移，可能与气味模式的形成有关。     

TLR9在人鼻黏膜上皮细胞中的表达及意义

目的:利用RT-PCR、免疫组织化学及流式细胞术检测原代培养的人鼻黏膜上皮细胞TLR9的表达水平及意义.方法:原代培养人鼻黏膜上皮细胞,设计TLR9的引物,RT-PCR检测TLR9 mRNA在鼻黏膜上皮细胞中的表达.免疫组织化学及流式细胞术检测原代培养的人鼻黏膜上皮细胞中TLR9的表达水平.结果:400倍光镜下观察结果显示,原代培养的鼻黏膜上皮细胞呈圆形或不规则形,饱满贴壁.RT-PCR结果显示,鼻黏膜上皮细胞有TLR9 mRNA的表达.通过与内参照物GAPDH进行灰度分析比较,发现鼻黏膜上皮细胞中TLR9的表达高于外周血单个核细胞阳性对照组,差异有统计学意义.结论:人鼻黏膜上皮细胞中有TLR9的表达,TLR9 mRNA在人鼻黏膜上皮细胞中的表达高于外周血单个核细胞.     

腺相关病毒AAV2/Anc80L65对原代培养的螺旋神经元形态标记效能的探究

目的 探究含有神经元特异性启动子(human synapsin promoter, hSyn)及绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记的AAV2/Anc80L65-hSyn-eGFP病毒对体外培养的螺旋神经元(spiral ganglion neuron, SGN)形态的标记效果。方法 向体外培养的SGNs中加入一定量的AAV2/Anc80L65-hSyn-eGFP病毒,通过荧光显微镜在低倍镜下计数荧光神经元的比例以评估其对螺旋神经元细胞的转染的特异性和效率,在高倍镜下观察荧光神经元胞体及神经突的精细形态。并通过膜片钳实验验证该病毒在活体SGNs中的实际应用。结果 AAV2/Anc80L65-hSyn-eGFP病毒对体外培养的SGNs具有很高的特异性和转染率,且不会产生明显的细胞毒性。同时,该病毒可以快速清晰地标记螺旋神经元胞体和神经突的形态且对神经元形态没有明显损伤。相比Tuj1荧光染色还可以标记更加精细的神经突结构,如丝状伪足。当应用于膜片钳实验中时,AAV2/Anc80L65-hSyn-eGFP病毒有助于神经元识别和定...     

补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗螺旋神经节神经元5-HT1B、2C受体表达的影响北大核心CSCD

目的探讨补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons,SGN)中5羟色胺(serotonin,5-HT)1B、2C受体的表达及意义。方法 60只健康SPF级雄性大鼠随机分为正常组10只(生理盐水组),耳鸣模型组50只(采用水杨酸钠腹腔注射联合"饮水抑制"大鼠行为学实验方法建立大鼠耳鸣模型),耳鸣模型组造模成功后再分为水杨酸钠组10只、中药组30只(补肾活血化痰开窍方低、中、高剂量组各10只)、西药组(卡马西平组)10只,除水杨酸钠组给予生理盐水灌胃外,各组给予相应药物干预8周,造模成功后运用免疫组化法检测各组耳蜗SGN中5-HT1B、2C受体的表达。结果耳鸣造模成功并给予相应药物干预8周后,各组大鼠耳蜗SGN中均有5-HT1B、2C受体的表达,与生理盐水组相比,水杨酸钠组中5-HT1B表达减少,5-HT2C表达明显增多;与水杨酸钠组相比,中药各剂量组耳蜗SGN中5-HT1B表达增多,2C表达均明显降低。结论耳鸣大鼠耳蜗SGN中的5-HT1B受体表达减少、5-HT2C表达增加,应用补肾活血化痰开窍方后5-HT1B表达增多而5H2C表达降低,产生了拮抗作用,该方可能应用于耳鸣的治疗。     

EGCG对阿米卡星诱导大鼠螺旋神经元诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG］对阿米卡星（amikacin,Amk）诱导的大鼠耳蜗螺旋神经元(spiral ganglion neuron;SGN) 诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）表达的影响。方法将30只SD大鼠分为生理盐水对照组、Amk（450?mg/kg·d×14d）损伤组和Amk加EGCG（50?mg/kg·d×14d）保护组。各组动物均经深度麻醉后,半身灌注固定处死,取右侧耳蜗标本固定、脱钙、石蜡轴位包埋、轴位切片,近中轴位切片行iNOS免疫组化染色,光学显微镜下检测耳蜗SGN表达情况,并通过切片图像分析进行半定量处理比较。结果对照组SGN胞浆及细胞核基本上不着色（SGN iNOS染色平均灰度值为111.04±3.15）,损伤组SGN部分神经元胞浆内有棕黄色或黄色颗粒或斑片（SGN iNOS染色平均灰度值为90.32±5.26）,保护组胞浆及细胞核无明显着色（SGN iNOS染色平均灰度值为109.35±4.89）,图像分析结果显示,损伤组与对照组、损伤组与保护组之间的SGN iNOS染色平均灰度值差异有统计学意义。结论iNOS参与Amk耳中毒时耳蜗螺旋神经元的氧化损伤,EGCG可以减弱Amk耳中毒时耳蜗螺旋神经元iNOS的表达,从而减轻Amk耳毒性。