脐血CD3AK细胞治疗恶性肿瘤的临床应用研究

目的:研究用脐血单个核细胞制备CD3AK细胞的抗肿瘤作用,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标.方法:分离脐血单个核细胞,分别用IL-2和IL-2 CD3Ab诱导LAK和CD3AK细胞,并测其扩增数量和对K562细胞的杀伤活性;测定肿瘤患者用CD3AK细胞治疗前后外周血T淋巴细胞亚群绝对计数的变化情况和外周血单核细胞(PBMC)的NK杀伤活性.结果:脐血LAK细胞和脐血CD3AK细胞均于培养后11天时扩增倍数最高,分别是培养前的18倍、24倍,对K562的杀伤活性分别是培养前的2.6倍和3.2倍;肿瘤患者输注CD3AK细胞一疗程后,其外周血T淋巴细胞亚群绝对计数有明显升高:总T升高66.0%,Th升高68.0%,Ts升高58.0%;其PBMC的NK杀伤活性由63.0%升高到81.0%,平均升高28.0%.结论:1)脐血单个核细胞是LAK细胞和CD3AK细胞良好的前体细胞.2)LAK和CD3AK细胞的数量和杀伤能力在培养的11天时达高峰,而且CD3AK细胞数量和杀伤活性明显优于LAK细胞.3)CD3AK细胞输注能明显提高肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群绝对计数和PBMC的NK活性.4)肿瘤患者的外周血T淋巴细胞计数和PBMC的NK活性测定可望成为肿瘤生物治疗的一个近期疗效参数.     

选择性扩增人自然杀伤细胞的实验研究

背景与目的:自然杀伤(naturalkiller,NK)细胞具有很强的杀瘤活性,但体外扩增NK细胞的数量难以达到治疗肿瘤的目的。本实验探讨由人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)和附壁Wilms肿瘤细胞株HFWT混合培养能否有效地诱导NK细胞。方法:采用PBMCs和HFWT细胞混合培养诱导扩增NK细胞,51Cr释放法和结晶紫染色法测定NK细胞的杀瘤活性;流式细胞计数仪检测培养细胞中CD3 、CD4 、CD8 、CD16 和CD56 细胞的比例。结果:HFWT对人NK细胞特别敏感,它比不表达MHC-Ⅰ类分子的K562细胞和其他附壁生长的肿瘤细胞株更有效地刺激PBMCs,从而选择性扩增NK细胞。健康人PBMCs在HFWT细胞中培养10～21天后,CD56 CD16 细胞占细胞总数50%以上。当效靶比为2∶1时,NK细胞杀伤80%的HFWT细胞,NK细胞的扩增需要HFWT细胞反复刺激PBMC。结论:从HFWT细胞株中可选择性扩增人NK细胞,将有助于开展临床肿瘤过继免疫疗法。     

树突状细胞和自然杀伤细胞与肿瘤细胞端粒酶的研究进展

树突状细胞(DC)将人端粒酶逆转录酶(hTERT)提呈给T淋巴细胞,可激发特异性的细胞毒性T细胞和CD4+T细胞反应.自然杀伤(NK)细胞与肿瘤细胞端粒酶的相关研究较少,而DC和NK细胞共同作用可以增加抗肿瘤活性,有可能与端粒酶共同参与抗肿瘤免疫反应.     

人SCF基因转染NK细胞系的生物学特性研究

目的；研究SCF基因转染NK细胞系的生物学特性。方法：利用LipofecTAMINE将SCF真核表达载体pcDNA3-hSCF转染NK－92细胞系，RT－PCR鉴定表达SCF的细胞克隆并以SCF依赖细胞株TF－1激活，MTT法检测增殖和杀伤活性。流式细胞术检测细胞表面分子CD3，CE16和CD56。结果：建立表达hSCF基因的NK－92－hSCF细胞株，在IL－15培养条件下，其增殖能力显著高于NK－92，并且低剂量的IL－15可以维持其较高的杀伤活性流式细胞术检测细胞表面分子CD3，CD16和CD56。结论：可以通过SCF基因修饰NK－92，改变其生物学特性，提高其增殖能力，使NK细胞系有更实用的应用价值。     

自然杀伤细胞与肿瘤细胞之间的免疫编辑

自然杀伤细胞(nature killer cell, NK)是机体天然免疫的主要承担者，NK细胞表面表达的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(inhibitory killer cell immunoglobulinlike receptor，KIR)和活化性受体NKG2D是调节NK细胞杀伤活性的主要受体。NK细胞通过其细胞表面的活化性受体和肿     

脐血CD_3AK细胞的制备、生物活性测定及临床应用初探

 目的　研究用脐血单个核细胞制备CD3 AK细胞的抗肿瘤作用 ,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标。方法　分离脐血单个核细胞 ,分别用IL 2和IL 2 +CD3 Ab诱导LAK和CD3AK细胞 ,并测其扩增数量和对K5 6 2细胞的杀伤活性 ;测定肿瘤患者用CD3 AK细胞治疗前后外周血单核细胞(PBMC)的NK杀伤活性。结果　脐血LAK细胞和脐血CD3 AK细胞均于培养后第 11天时扩增倍数最高 ,分别是培养前的 18倍、2 4倍 ,对K5 6 2的杀伤活性分别是培养前的 2 .6倍和 3.2倍 ;肿瘤患者输注CD3 AK细胞一疗程后 ,其PBMC的NK杀伤活性由 6 2 %升高到 82 % ,平均升高 32 %。结论　 (1)脐血单个核细胞是LAK细胞和CD3 AK细胞良好的前体细胞。 (2 )LAK和CD3 AK细胞的数量和杀伤能力在培养的第 11天时达高峰 ,而且CD3 AK细胞数量和杀伤活性明显优于LAK细胞。 (3)CD3 AK细胞输注能明显提高肿瘤患者PBMC的NK活性。 (4 )肿瘤病人PBMC的NK活性测定可望成为肿瘤生物治疗的一个近期疗效参数     

转录因子RORγt对肠道和皮肤中NKp46^＋CD3^-细胞发育和功能的影响

NK细胞存在不同的功能亚群虽然已知人和小鼠的肠道、皮肤中有NK细胞存在，但其具体的细胞亚群及相应功能特征尚未可知。为探讨这一问题，论文作者首先通过组织免疫荧光确认在人和小鼠的肠道固有层和皮肤的真皮层中存在NKp46^＋CD3^-细胞，通过表型分析证明该淋巴细胞不是T、B淋巴细胞，而是表达多种NK细胞表面受体的NK细胞群；进一步功能检测发现，真皮中的NKp46^＋CD3^-细胞与肠道中的该细胞群不同：真皮中NKp46^＋CD3^-细胞的表面分子表达与常规NK细胞类似，但是在功能方面具有未成熟NK细胞的特点，即较弱的分泌细胞因子和杀伤效应以及较强的增殖活性；     

肝癌患者自体CD3AK细胞与LAK细胞的杀伤活性比较

目的 比较肝癌患者自体CD3AK细胞和LAK细胞的杀伤活性,为临床是供依据。方法 以流式细胞仪检测细胞的杀伤活性。结果 原发性肝癌患者自体的CD3AK细胞的NK活性和LAK活性均高于LAK细胞。结论 CD3AK细胞效果稳定,抗瘤效应明显高于LAK细胞,CD3AK细胞可望作为一种新的生物治疗手段用于肿瘤治疗。     

HSP70-TKD诱导的NK细胞杀伤肝癌细胞的实验研究

目的:探讨从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中获得足够数量和高细胞毒活性的CD3-CD56 NK细胞的方法,并观察其对肝癌细胞HepG2杀伤效应.方法:以干细胞培养基(SCGM)为基础培养基,在不同浓度的抗CD3单抗、IL-2和PHA的培养条件下,从健康人PBMC中高效扩增获得CD3-CD56 NK细胞;以不同剂量的HSP70-TKD诱导NK细胞的活性,MTT法测定HSP70-TKD诱导的NK细胞对HepG2和榄香烯处理的HepGZ细胞的杀伤活性.结果:建立了从人PBMC体外扩增CD3-CD56 NK细胞体系:以SCGM为基础培养基,在600 U/mL IL-2、500 μg/L抗CD3单抗和50 mg/L PHA联合作用下,培养14 d细胞扩增了116倍,舍有(66.97±8.76)?3-CD56 NK细胞;HSP70-TKD诱导的NK细胞对HepG2杀伤活性低.与未经TKD诱导的NK细胞之间差异无统计学意义,P=0.298;而对税香烯处理过的HepG2杀伤活性高,诱导组与未诱导组之间差异有统计学意义,P=0.008;当TKD浓度为2.0 mg/L时,杀伤活性最高为(58.8±3.4)%.结论:以干细胞生长培养基为基础培养基,在抗CD3单抗和IL-2协同刺激下体外大量扩增NK细胞,HSP70-TKD诱导的NK细胞对细胞膜HSP70阳性的肿瘤细胞杀伤活性高,而对于细胞膜HSP70低表达的肿瘤细胞杀伤活性低.     

CIK细胞的特点及其在肿瘤生物治疗中的作用

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK)是一种新型的免疫活性细胞,它是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞,由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T淋巴细胞,CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广及非MHC限制性杀瘤的优点.在基础及临床研究中对CIK的探讨在不断深入,以期获得更有效的肿瘤生物治疗方法,为临床治疗提供依据.     

同种异体NK细胞KIR2DL1表达差异对其杀伤KG1A细胞活性的影响

目的:研究同种异体自然杀伤(natural killer,NK)细胞对人急性髓系白血病细胞株KG1A的杀伤率,探讨供者NK细胞表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL1(killer immunoglobulin-like receptor 2DL1,KIR2DL1)表达差异对NK细胞杀伤KG1A细胞活性的影响。方法:自9名健康志愿供者分离外周血NK细胞,流式细胞术检测NK细胞表面KIR2DL1的表达率,LDH释放法测定NK细胞在效靶比为20∶1时对KG1A细胞的杀伤活性。结果:NK细胞表面KIR2DL1的表达率存在个体差异,9名供者的表达范围为(33.20±1.95)%～(92.69±1.47)%;9名健康供者NK细胞对KG1A细胞的杀伤活性不同,杀伤率范围为(44.40±1.97)%～(93.70±1.12)%。不同个体NK细胞KIR2DL1表达率与其对KG1A细胞的杀伤率呈负相关(r=-1.00,P=0.00)。结论:不同个体NK细胞其表面KIR2DL1表达率与NK细胞对KG1A细胞的杀伤率呈负相关。     

CIK细胞联合树突状细胞治疗恶性肿瘤的研究进展

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytok ine induced k iller cells,C IK)是由多种细胞因子如IL-2、IFN-γ和CD3单克隆抗体等诱导而成的对多种肿瘤具有杀伤活性的细胞毒性T细胞,其溶瘤活性具有非MHC限制性[1,2]。C IK细胞在体内归巢于脾脏、淋巴结等,可特异地聚集于肿瘤局部发挥抗肿瘤作用;树突状细胞(DC)是功能强大的主要的抗原递呈细胞,分布于除脑和睾丸以外身体各部的任何组织。DC通过受体的方式摄取外来抗原,并能与这些抗原表面的MHC I类和II类分子结合,刺激初始型CD8 T细胞和CD4 T细胞活化。DC除了诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴…     

贲门癌、胃癌患者红细胞C3b受体与CD4+/CD8+比值、NK细胞活性的相关性研究

背景与目的:研究贲门癌、胃癌患者红细胞C3b受体(RBC-C3bR)与CD4 /CD8 比值、NK细胞活性的相关性。材料与方法:利用酵母菌花环试验、克隆抗体致敏花环法和MTT法对53例贲门癌、51例胃癌患者及30例正常人外周血RBC-C3bR阳性率、T细胞CD3 、CD4 百分率、CD4 /CD8 比值及自然杀伤细胞(NK)活性进行测定。结果:贲门癌组、胃癌组RBC-C3bR阳性率、CD3 、CD4 细胞百分率、CD4 /CD8 比值和NK细胞杀伤活性均比正常对照组低,差异具有统计学意义(F=28.68,P<0.01),而贲门癌与胃癌组间比较,差异无统计学意义(t=0.081～0.871,P均>0.05);经统计学相关性分析显示,贲门癌、胃癌组RBC-C3bR阳性率与CD4 /CD8 比值、NK细胞杀伤活性间呈正相关(贲门癌RBC-C3bR阳性率与CD4 /CD8 比值:r=0.431,P<0.01;RBC-C3bR阳性率与NK细胞活性:r=0.347,P<0.05;胃癌RBC-C3bR阳性率与CD4 /CD8 比值:r=0.429,P<0.01;RBC-C3bR阳性率与NK细胞活性:r=0.528,P<0.01)。结论:贲门癌、胃癌患者红细胞免疫与白细胞免疫功能均受到抑制。     

鼻型结外自然杀伤-T细胞淋巴瘤研究进展

鼻型结外自然杀伤(NK)-T细胞淋巴瘤(NKTCL)起源于成熟NK细胞或NK样T细胞,常表达CD3ε和CD56,Epstein-Barr病毒(EBV)常阳性并在发病机制中起重要作用.已经建立了多种NKTCL的细胞株和动物模型并用于实验研究.NKTCL存在多种染色体畸变,最常见的是6q-,但无明显特异性.瘤细胞还存在多种基因表达异常及表观遗传学异常,为将来的靶向治疗提供了潜在的治疗靶点.     

CD80-链亲和素融合蛋白锚定的鼻咽癌CNE2细胞增强T细胞的杀伤活性

目的：制备CD80-链亲和素（streptavidin,SA）融合蛋白,研究CD80-SA锚定的鼻咽癌CNE2细胞对T细胞杀伤活性的影响。方法：pET21a-CD80-SA-6His质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导CD80-SA融合蛋白的表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后透析复性。流式细胞仪检测CD80-SA融合蛋白在CNE2细胞表面的锚定效率;LDH释放法检测CD80-SA锚定的CNE2细胞对T细胞杀伤活性的影响。结果：成功制备和纯化了CD80-SA融合蛋白。CNE2细胞表面低表达CD80分子\[（2.2±0.18）％\]。CD80-SA融合蛋白可有效地锚定于生物素化的CEN2细胞表面,锚定效率可达73%。CD80-SA锚定的CNE2细胞可有效激活T细胞的杀伤作用,效靶比在1∶1、1∶20、1∶40时T细胞的杀伤率分别约为(37±3.12)%、(51±263)%和(58±2.47)%,均显著高于对照CNE2细胞激活的T细胞（均P<0.01)。结论：CD80-SA融合蛋白可有效锚定于生物素化的CNE2细胞表面,从而增强T细胞对CNE2细胞的杀伤活性。     

CD_3单克隆抗体激活细胞的体外抗肿瘤作用

目的:观察CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3AK)的体外杀伤肿瘤作用。方法:采用MTT法测定不同时期CD3AK细胞的杀伤活性。结果:培养到第4天的CD3AK细胞已有明显的杀伤活性,第10天达高峰;CD3AK对K562、H7402和MNK45肿瘤细胞的杀伤活性显著高于LAK和NK细胞(P<0.05),对Hela-3肿瘤细胞的杀伤活性略低于LAK细胞。结论:CD3AK是一种广谱、高效的肿瘤杀伤细胞,但它对不同种类的肿瘤细胞的杀伤效应又存在着较大的差异。     

乳腺癌患者可溶性MICA对自然杀伤细胞受体的影响

目的观察乳腺癌患者外周血自然杀伤（NK）细胞杀伤活性及受体的变化,探讨可溶性MICA（sMICA）对NK细胞受体及杀伤活性的影响。方法ELISA法检测外周血血清sMICA的含量。流式细胞术（FCM）检测NK细胞百分比、NK细胞活化性受体NKG2D、抑制性受体KIR（CD158b）表达。MTT法检测NK细胞对乳腺癌细胞株MCF-7的杀伤活性。结果与健康人比较,乳腺癌患者中81．6％表达sMICA,含量为（205．36±71．27）ng／L,且sMICA含量与TNM分期呈正相关。乳腺癌患者外周血NK细胞所占百分比无明显差异,但血清sMICA阳性的乳腺癌患者中NK细胞杀伤活性明显降低,NKG2D表达下降,CD158b表达增高。当NK细胞培养体系中加入sMICA阳性的乳腺癌血清时,其杀瘤活性明显降低【（76．2±6．7）％与（48．4±4．1）％】,NKG2D的表达明显下调[（92．5±7．1）％与（62．5±6．4）％],而CD158b的表达明显上升【（10．6±3．2）％与（43．6±3．4）％】。sMICA阳性的乳腺癌患者NK细胞与细胞因子IL-15共培养,NK细胞的杀瘤活性、NKG2D的表达明显升高,KIR（CD158b）的表达明显下降。结论乳腺癌外周血血清中sMICA可通过下调NK细胞NKG2D表达以及上调KIR表达,降低NK细胞杀瘤活性。IL-15可逆转sMICA对NK细胞的免疫下调作用。     

HLA-G反义基因增强免疫效应细胞杀伤活性的研究

目的:研究HLA-G反义寡核苷酸逆转肿瘤细胞免疫逃逸,提高免疫效应细胞识别杀伤活性的作用和机制.方法:采用反义核酸技术合成HLA-G反义寡核苷酸(ASODN),硫代化修饰与脂质体形成复合物,转导入高表达HLA-G的绒毛膜癌细胞系JEG-3.采用RT-PCR方法检测HLA-G mRNA表达水平的变化;流式细胞术检测细胞表面HLA-G蛋白表达水平的变化;MTT法检测:NK杀伤活性、CD3AK杀伤、增殖活性的变化;ELISA方法探讨ASODN调节CD3AK细胞因子IFN-γ产生的变化.结果:HLA-G ASODN可显著抑制HLA-G mRNA和蛋白水平的表达,逆转可溶型HLA-G分子对NK细胞杀伤活性的抑制作用;可部分逆转HLA-G分子对CD3AK细胞产生IFN-γ的抑制作用,并增强CD3AK的增殖活性,增强JEG-3细胞对CD3AK的杀伤敏感性.结论:HLA-G ASODN通过抑制肿瘤细胞HLA-G mRNA和蛋白水平的表达,增强NK,CD3AK的杀伤作用和机制,发挥逆转肿瘤细胞免疫逃逸作用.     

雷公藤内酯醇对人宫颈癌细胞的凋亡诱导效应

目的:探讨腺病毒介导AFP基因修饰的DC(AFP-DC)瘤苗经不同途径免疫后机体抗肿瘤免疫应答反应.方法:采用皮下注射、静脉注射和瘤体注射三种途径回输AFP-DC瘤苗,比较观察AFP-DC瘤苗对荷瘤小鼠免疫治疗作用,应用4h51cr释放杀伤实验、T细胞与NK体内剔除实验等方法,观察AFP-DC瘤苗对荷瘤小鼠免疫治疗作用及保护性免疫反应.结果:皮下注射AFP-DC瘤苗治疗效果在抑制肿瘤生长、延长小鼠存活期方面都明显优于瘤体内注射或尾静脉注射(P＜0.05),AFP-DC瘤苗体内能更有效地诱导特异CTL细胞毒活性,能使免疫动物产生一定的免疫保护作用,抵抗肿瘤细胞的再攻击.在AFP-DC瘤苗诱导抗肿瘤免疫排斥反应过程中,必需有CD4 T和CD8 T细胞的参与;而在其效应阶段,则依赖于CD8 T细胞的参与,CD4 T细胞为非必需;在免疫诱导及效应阶段剔除NK细胞对抗肿瘤免疫应答无明显影响.结论:皮下注射AFP-DC瘤苗能有效诱导机体产生抗肿瘤免疫反应,为DC介导的肝癌免疫治疗开辟了新的途径.     

恶性实体瘤患者自体PHA-LAK细胞过继性免疫治疗对淋巴细胞表型及功能的影响

目的：研究回输自体PHA-LAK细胞对恶性实体瘤患者淋巴细胞表型及功能状态的影响．方法：入组204例实体瘤患者．并以10例健康成人作为对照．采集与分离外周血单个核细胞，体外扩增PHA—LAK蜘胞，采用流式细胞术分析淋巴细胞表型．MTT法榆测淋巴细胞杀伤活性。结果：实体瘤患者较正常人淋巴细胞亚群CD3 ^ ／CD4^ 细咆、CD、3^ /CD8^ 细胞、B细胞、NK细胞减少，淋巴细胞杀伤活性下降。扩增的PHA-LAK是以激活的淋巴细咆亚群CD.^ ／CD8^ 细胞、CD3^ ／CD56^ 细胞、CD4^ ／CD2^ 细胞为主的异质性群体，其数量及杀伤活性明显增加，激话淋巴细胞标记性抗原分子表达亦增加：PHA-LAK细胞回输冶疗后．患者外周血上述激活淋巴细胞亚群数量增加．淋巴细胞系伤活性增强。结论：实体瘤患者淋巴细胞亚群数量及功能低下．PHA-LAK细胞过继性免痉治疗使患者体时激活淋巴细胞亚群数量增加．杀伤活性增强。