沼泽红假单胞菌蛋白Rhp-PSP对烟草花叶病毒的系统抗性诱导及互作蛋白筛选

本文研究了蛋白Rhp-PSP诱导烟草抗TMV过程中相关防御酶的活性以及丙二醛（MDA）含量的变化,同时测定了抗病相关基因的表达情况。试验证明,蛋白Rhp-PSP处理烟草后,叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性显著提高,但降低了MDA含量。同时基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2表达显著上调,证明了蛋白Rhp-PSP具有诱导烟草产生抗TMV的活性。为阐明诱导抗性机制,利用酵母双杂交系统从烟草cDNA文库进行互作蛋白的筛选并验证,结果表明GPI锚定蛋白、VAN3结合蛋白及叶绿素结合蛋白A与蛋白Rhp-PSP互作。     

利用酵母双杂交技术筛选与苹果褪绿叶斑病毒运动蛋白互作的西方烟蛋白

苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)是蔷薇科果树上的一种重要病毒,其致病机制尚不清楚。以具有基因沉默抑制子功能的运动蛋白(movement protein, MP)为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选与其互作的西方烟37B(Nicotiana occidentalis 37B)蛋白。构建了库容量为9.6×10⁶ CFU、平均插入片段>1 kb的西方烟cDNA文库,从中筛选到15种蛋白,涉及植物光合作用、ATP合成代谢、过氧化物代谢、氨基酸代谢、抗逆等过程,可为解析ACLSV的致病机制提供依据和方向。     

基于酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内与大麦黄条点花叶病毒核衣壳蛋白互作的蛋白质

 为了获取影响大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)在灰飞虱体内增殖、积累和传播的相关介体因子,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以BYSMV核衣壳蛋白(N)为诱饵对灰飞虱cDNA文库进行了筛选。 将BYSMV N基因构建到诱饵载体pDHB1上进行表达检测和功能验证,结果表明重组载体pDHB1-N能在酵母内正常表达并行使功能。利用诱饵载体筛选pPR3-N空文库对文库筛选条件进行优化,确定3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)浓度为12 mmol·L^-1的QDO平板为筛选文库培养基条件,去除可能存在的轻微筛库背景。在此筛选条件下以诱饵载体从灰飞虱cDNA文库中筛选得到57个阳性克隆,序列比对结果表明这些阳性克隆编码17种候选蛋白,包括表皮蛋白、泛素B、核糖体膜相关蛋白、细胞色素b5以及海藻糖转运蛋白等。 经酵母双杂交共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步确认了这17个候选蛋白与BYSMV N发生互作。本研究成功从灰飞虱分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库筛选到与BYSMV N互作的蛋白质,为进一步探索弹状病毒与介体昆虫的分子互作机制奠定了基础。     

应用GST pull-down技术筛选水稻抗稻瘟病蛋白PID3互作蛋白的研究

 Pid3是从水稻中克隆获得的编码CC-NBS-LRR类蛋白的稻瘟病抗病基因。为了更深入地研究Pid3编码蛋白PID3介导的稻瘟病抗性的分子调节机制,我们应用GST pull-down结合质谱技术,对水稻抗稻瘟病蛋白PID3的互作蛋白进行了鉴定和分析。首先,成功构建了带有GST标签且能够表达PID3的CC-NBS结构域的融合蛋白表达载体pGEX6P1-PID3^CC-NBS,经诱导表达和GST beads纯化后获得GST-PID3^CC-NBS融合蛋白。我们以Pid3的转基因水稻纯合株系Pid3-TP309为研究材料,分别用对其致病和不致病的稻瘟病菌生理小种ZB13和ZHONG-10-8-14接种,然后取叶片分别提取获得两组总蛋白。用纯化后的蛋白GST-PID3 ^CC-NBS分别与两组总蛋白共培养后,利用GST pull-down技术获得了分别在抗病、感病反应中能与PID3^CC-NBS互作的两组候选蛋白。通过质谱技术鉴定这些蛋白的氨基酸序列,比对分析其在抗病、感病途径中与PID3结合的差异性,我们共筛选出31个只在PID3介导的抗稻瘟病反应中能与其特异结合的PID3互作蛋白,这些互作蛋白包括受体激酶、LRR类蛋白、ATP酶、磷酸羧化酶和离子通道蛋白等,广泛参与了调控细胞程序化死亡、胁迫防御反应、物质与能量代谢和信号传导等多个生物学过程。本研究探寻了PID3介导的抗病信号转导过程的关键因子,研究结果为揭示PID3介导的稻瘟病抗病分子机理奠定了良好基础。     

酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选

 香蕉束顶病毒DNA2组分编码蛋白的功能尚不清楚,为了揭示其编码蛋白的功能,以本实验室保存的BBTV Haikou4分离物总DNA为模板进行PCR扩增,利用Gateway重组技术将BBTV DNA2 ORF构建到酵母双杂交系统(ProQuest^TM Two-Hybrid System, Invitrogen)的诱饵载体pDEST-32中,并通过酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证以及自激活验证。结果显示,转有pDEST32-DNA2 ORF质粒的MaV203酵母菌具有弱的自激活背景,在3-AT 浓度为25 mmol/L的SeC-Leu-Trp-His平板上生长较弱,但在3-AT 浓度为50 mmol/L SeC-Leu-Trp-His 平板上不生长,表明诱饵质粒背景自激活可被浓度为50 mmol/L的3-AT 所抑制。在该条件下共转pDEST32-DNA2 ORF和文库质粒到MaV203感受态细胞进行互作蛋白筛选,通过PCR和测序等手段最终鉴定35个候选蛋白基因,分别编码转录调控因子、生长发育相关蛋白、代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白和未知蛋白等。酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选,为揭示DNA2组分的蛋白功能提供了科学线索。     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。     

大丽轮枝菌及激素处理后棉花酵母双杂交文库的构建

大丽轮枝菌是引起棉花、马铃薯等重要作物黄萎病的土传病原真菌,其分泌的胞外蛋白是侵染寄主的重要毒力因子,因此研究胞外蛋白与寄主的相互作用具有重要意义.本研究旨在构建高效的棉花酵母双杂交cDNA文库,并通过已知大丽轮枝菌效应子VCR1互作蛋白的筛选来评价构建文库的质量.分别采用大丽轮枝菌及茉莉酸甲酯、水杨酸和乙烯处理海岛棉...     

利用酵母双杂交筛选与马铃薯Y病毒CKVNP互作的寄主蛋白

 马铃薯Y病毒坏死株系(Potato virus Y necrosis strain,PVY^N)侵染烟草后烟草表现叶脉坏死症状,但其致病的分子机制,特别是与病毒互作的宿主蛋白研究鲜有报道。PVY^N(JQ971975)的CKVNP编码区(CI-6K2-VPg-NIa-Pro区域,核苷酸5 540-6 491)与烟草表现叶脉坏死症状相关,研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染致烟草表现叶脉坏死症状的分子机制。本文将PVY^N的CKVNP编码区定向克隆到含有DNA结合功能域(DNA-binding Domain,BD)载体上,构建与激活功能域(Activation Domain,AD)融合表达的烟草cDNA文库,用CKVNP为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明:诱饵质粒插入的CKVNP编码区可读框和氨基酸序列均正确,对酵母菌株无自主激活能力;烟草cDNA文库容量为7.0×10⁶ CFU/mL,且插入片段平均大小在1.0 kb以上,质量符合筛选要求;经过筛选和共转化回转验证,有94个候选基因与CKVNP在酵母中互作。挑选22个酵母质粒进行测序得到这些基因的cDNA序列,BLAST分析结果表明,这些基因共编码14种蛋白。     

杨扇舟蛾颗粒体病毒经口侵染因子PIF0~PIF6间分子互作的酵母双杂交验证

为阐明杨扇舟蛾颗粒体病毒(Clostera anachoreta granulovirus,ClanGV)的口服侵染机制,利用酵母双杂交技术,通过双向互作方法研究了ClanGV的经口侵染因子PIF0、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5和PIF6之间的分子互作情况。自激活试验证明,PIF5的重组诱饵载体(B5)有自激活现象,其它重组诱饵载体均无自激活现象。酵母双杂交试验结果表明,ClanGV的4个经口侵染因子PIF1～PIF4之间存在双向互作现象,而且这4个蛋白均能同时与自身发生互作,暗示这4个经口侵染因子有可能是以二聚体或多聚体的形式存在并发挥功能。在ClanGV经口侵染因子间的6组单向互作中,PIF5作为捕获载体时分别能与PIF1、PIF3和PIF4发生互作,PIF6作为诱饵载体时分别能与PIF3和PIF4发生互作,PIF0作为捕获载体时能与PIF4发生互作。表明ClanGV的经口侵染因子像核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus,NPV)一样,在病毒粒子表面通过分子互作形成复合体并在病毒的经口侵染过程中发挥功能。     

水稻与稻瘟病菌互作中S受体蛋白激酶的诱导表达

 细胞在生长、分化和感应各种环境因子刺激时,蛋白质的可逆磷酸化是一系列信号感受和转导过程中的重要反应。     

亚洲玉米螟表皮蛋白CPR9的表达纯化及与几丁质的相互作用

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我国玉米最重要的害虫,了解亚洲玉米螟表皮形成的机制将有助于对其开展生物防治。表皮蛋白和几丁质是构成昆虫表皮的两种主要成分,因此研究两者的相互作用对于阐明昆虫表皮形成机制具有关键意义。CPR9是亚洲玉米螟体壁表皮转录组中相对丰度最高的表皮蛋白基因。序列分析发现CPR9属于CPR家族中RR-1亚家族的表皮蛋白,含有R&R结构域,可能是通过结合几丁质来发挥功能。为了研究CPR9与几丁质的相互作用,本研究利用pET-SUMO载体实现了SUMO-CPR9融合蛋白的可溶表达,并通过SUMO蛋白酶处理及两次金属螯合亲和层析纯化了CPR9,平均收率为5 mg/L。几丁质结合试验发现,CPR9对不同类型的几丁质的结合具有选择性。CPR9对α-几丁质结合能力很强,对胶体几丁质结合能力较强,但不与β-几丁质结合。脱乙酰几丁质（壳聚糖）结合试验发现,CPR9能与脱乙酰几丁质结合并使其发生团聚。圆二色光谱分析表明,CPR9在结合脱乙酰几丁质后,其二级结构中平行β折叠和β转角比例上升,反平行β折叠及无规卷曲比例下降。本研究发现了CPR家族表皮蛋白与不同类型几丁质的结合存在特异性,而且在结合过程中会发生结构变化,有助于进一步了解昆虫表皮的形成机制。     

Investigation of rice blast development in susceptible and resistant rice cultivars using a gfp‐expressing Magnaporthe oryzae isolate

In this study, an isolate of Magnaporthe oryzae expressing the green fluorescent protein gene (gfp) was used to monitor early events in the interaction of M. oryzae with resistant rice cultivars harbouring a blast resistance (R) gene. In the resistant cultivars Saber and TeQing (Pib gene), M. oryzae spores germinated normally on the leaf surface but produced morphologically abnormal germ tubes. Germling growth and development were markedly and adversely affected in leaves of these resistant cultivars. Penetration of host cells was never seen, supporting the idea that disruption of germling development on the leaf surface might be one of the resistance mechanisms associated with Pib function. Thus, this particular R gene appeared to function in the absence of host penetration by the fungal pathogen. Confocal laser scanning microscopy of M. oryzae‐infected susceptible rice cultivars showed the dimorphic growth pattern that is typically observed during the biotrophic and necrotrophic stages of leaf colonization in susceptible cultivars. The suitability of the gfp‐expressing M. oryzae isolate for further research on R‐gene function and identification of resistant genotypes in rice germplasm collections is discussed.     

转录因子MoMsn2的核定位和核输出信号序列参与调控稻瘟病菌的生长发育和致病力

 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻上最重要的真菌病害之一,每年给水稻生产造成10%~30%的产量损失。从分子水平解析该病菌的致病机理,对稻瘟病防控新途径的挖掘具有重要的理论和实践指导意义。前期研究发现,转录因子MoMsn2定位于细胞质和细胞核,通过调控一系列下游基因的表达,控制稻瘟病菌的生长发育和致病性等多个生物学过程。对MoMsn2进行结构域分析,发现其含有2个核定位信号序列NLS1和NLS2、1个核输出信号序列NES和2个锌指蛋白结构域C2H2,但这些结构域的生物学功能尚不清楚。本研究通过构建结构域缺失载体和获得互补菌株的方法对5个结构域在稻瘟病菌的功能进行了分析。结果发现,同时缺失2个C2H2对MoMsn2的功能没有影响,ΔC2H2菌株的表型与野生型和全长互补菌株一致。缺失NLS1能完全恢复ΔMomsn2突变体的营养生长、菌落色素和胁迫应答;部分恢复其产孢量和致病力缺陷。缺失NES仅能部分恢复突变体的生长缺陷;而缺失NLS2完全不能恢复突变体的缺陷,其表型与突变体一致。荧光观察发现,缺失NES和NLS2改变了MoMsn2的核定位模式,而缺失C2H2和NLS1不影响MoMsn2的亚细胞定位。上述结果表明,NLS1、NLS2和NES是MoMsn2中3个重要的结构域,对MoMsn2在稻瘟病菌中行使正常的生物学功能具有重要的调控作用。     

有翅桃蚜蚜群中新蚜虫疠霉和烟蚜茧蜂的互作关系初探

虫霉目真菌和蚜茧蜂是蚜虫的重要专性生防因子,在田间生态系统中存在“共位共处”的现象。本文开展了以新蚜虫疠霉和烟蚜茧蜂为代表的虫霉目真菌和蚜茧蜂在有翅蚜蚜群中的互作研究。有翅蚜“孢子浴”接种新蚜虫疠霉后不同时间间隔（0 d,1 d,2 d）再进行蚜茧蜂处理,试验结果表明：各处理间的蚜虫感病率差异显著,且均高于60%;处理间的僵蚜率则差异不显著,且均低于15%。而有翅蚜先经寄生再“孢子浴”接种的5组不同间隔时间（1 d,2 d,3 d,4 d,5 d）处理试验的结果表明,组间有翅蚜的僵蚜率呈极显著差异,感病率也呈极显著差异,且僵蚜率和感病率在间隔4 d组出现明显分界。因此,在实验室条件下的有翅蚜蚜群中,新蚜虫疠霉的侵染比烟蚜茧蜂的寄生更具竞争优势,但它们之间的互作关系不是取代关系,而是迭代关系。本试验为蚜虫专性病原真菌（特别是虫霉目真菌）更好地联合蚜茧蜂在蚜虫生物防治中开展应用提供科学依据。     

斜纹夜蛾化学感受蛋白SlitCSP2的表达模式定位及配体结合特性分析

研究斜纹夜蛾Spodoptera litura化学感受蛋白Slit CSP2的表达模式、组织定位及与配体结合特性,为揭示SlitCSP2在化学通讯中的功能提供理论依据。利用RT-qPCR检测了SlitCSP2在蛹及雌、雄成虫各组织的基因表达水平;Westernblot方法检测了SlitCSP2在幼虫期和雄成虫头部、触角和足部的蛋白表达水平;利用免疫组织化学技术对Slit CSP2在幼虫各龄期的分布情况进行定位分析;利用荧光竞争结合试验检测Slit CSP2与13种非挥发性化合物的结合特性。RT-qPCR结果表明,SlitCSP2在3龄幼虫表达量最高,3～6龄表达量逐渐降低;成虫阶段雄成虫足部及胸部和雌成虫头部及翅的表达量最高,且雄成虫头部、足部和胸部的表达量显著高于雌成虫。Western blot结果显示,SlitCSP2在3龄幼虫头部（去触角）的蛋白表达水平较高。免疫组化结果表明,Slit CSP2在幼虫阶段主要分布于头部、口器和胸足;在雄成虫中,Slit CSP2主要分布于足部前跗节和足部外骨骼内侧。荧光竞争结合试验表明,Slit CSP2与单宁（Ki=1.77）、花青素（Ki=2...     

Bt稻Cry1Ab蛋白的表达和降解及对采后季节土表灰橄榄长角跳虫发生的影响

Bt水稻及其植株残体中的Bt杀虫蛋白对土壤跳虫具有潜在的生态风险。作者以Bt杂交稻东龙(DL)及非亲本对照汕优46(XY)和西农优1号(XN)为材料,采用ELISA法分析了DL各植株组织中Cry1Ab蛋白的田间表达和采后残留,并评价了采后季节DL植株秸秆还田对稻田土表跳虫发生量的影响。结果表明,在测定的各生长阶段,DL Cry1Ab在叶、茎和根系中的表达量为2.49~16.13μg/g FW;在采后季节,DL各秸秆还田植株残体中的Cry1Ab可残留较长时间,在试验第132天地表茎叶、稻桩和根系中的残留量分别为0.072、0.074和0.033μg/g DW;DL秸秆还田未对采后季节稻田土表发生量大的灰橄榄长角跳虫Entomobrya griseoolivata (Packard) 种群数量产生显著影响,该跳虫种群密度动态在DL与对照XY和XN稻田基本相似,多数调查日期发生量无显著差异。     

黑尾叶蝉NcPGRP基因克隆及表达模式分析

为明确黑尾叶蝉肽聚糖识别蛋白(Nephotettix cincticeps peptidoglycan recognition protein,Nc PGRP)的功能,利用RT-PCR克隆长度为552 bp的Nc PGRP开放阅读框,其编码蛋白大小为19.9 k D,无信号肽,含3个锌离子结合/酰胺酶催化位点,1个二氨基庚二酸型(Dap型)肽聚糖识别位点。系统发育分析表明,Nc PGRP与其他昆虫亲缘关系较远。利用显微注射技术对黑尾叶蝉进行病原细菌诱导,定量PCR结果显示Nc PGRP在受大肠杆菌及藤黄微球菌刺激后,其转录水平显著上调。组织分布研究表明,Nc PGRP的m RNA在各组织中均有表达,且头部表达量最高。黑尾叶蝉取食感染水稻普通矮缩病毒RDV的水稻后,Nc PGRP转录水平受抑制。本文研究表明,Nc PGRP是一种诱导型表达的PGRP,黑尾叶蝉感染RDV能显著抑制其转录,进而削弱黑尾叶蝉免疫能力,这可能有利于RDV与黑尾叶蝉共生。     

拒食蛋白XnAFP2三个结构域片段的表达及其生物活性分析

嗜线虫致病杆菌北京变种Xenorhabdus nematophila var. pekingensis CB6菌株产生的蛋白XnAFP2对多种昆虫有拒食活性。生物信息学分析表明,XnAFP2包含DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ3个功能结构域。为确定其主效活性区域,分别对3个结构域进行了克隆、表达和生物活性测定。结果表明,3个蛋白片段对棉铃虫Helicoverpa armigera3龄幼虫的生长抑制率分别为17.4%、39.8%和20.2%,对玉米螟Ostrinia furnacalis3龄幼虫的生长抑制率分别为20.2%3、8.6%和21.7%,对小菜蛾Plutella xylostella3龄幼虫的非选择性拒食率分别为25.7%、44.1%和26.8%。研究结果表明,DomainⅡ是拒食蛋白XnAFP2的主效活性区域。     

Amino Acid 129 of Cucumber mosaic virus Coat Protein Determines Local Symptom Expression and Systemic Movement in Tetragonia expansa, Momordica charantia and Physalis floridana

Local symptom expression and systemic movement of Cucumber mosaic virus (CMV) in Tetragonia expansa, Momordica charantia and Physalis floridana were mapped to the amino acid at position 129 of CMV coat protein (CP), using pseudorecombinants, chimeric RNAs, a site-directed mutant of RNA 3 and four strains of CMV : pepo-, SO-, MY17- and Y-CMV. Local and systemic symptoms caused by three strains, pepo-, SO- and MY17-CMV, and those by Y-CMV differed in the three host species. The three strains expressed local chlorotic spots at 24°C and systemic chlorotic spots and ringspots at 36°C, whereas Y-CMV developed local necrotic spots at 24°C but no systemic symptoms at 36°C in T. expansa. In M. charantia the three strains caused systemic chlorotic spots, whereas Y-CMV caused local necrotic spots. The three caused systemic mosaic and Y-CMV systemic necrosis in P. floridana. With pseudorecombinants combined with pepo- and Y-CMV RNAs, CMV RNA 3 was responsible for symptom expression and systemic infection. Inoculation with Y-CMV RNA 1, RNA 2 and chimeric RNA 3s exchanged CP gene fragments between pepo- and Y-CMV showed that NruI-XhoI fragment of CP was essential for symptom expression. Comparative analysis of the NruI-XhoI fragments revealed that only the amino acid at position 129 was common among the three strains but different from that of Y-CMV. Inoculation with a point mutant constructed by substituting one nucleotide resulting in an amino acid change from Ser to Pro at position 129 in Y-CMV CP verified the previous experiments. These results indicate that the amino acid at position 129 of CMV CP is the determinant for local symptom expression and systemic movement in the three host species. CMV CP containing Ser at position 129 may induce resistant responses in these plants. Received 29 June 2001/ Accepted in revised form 28 August 2001