部队军人及其驻地人群结核菌分离株分子标记分析

目的：探讨部队军人与驻地地方人群之间结核病的传播关系。方法：应用结核分支杆菌DNA插入序列IS6110作为引物，扩增结核分支杆菌参考株H37RV DNA，以同位素^32P-dCTP标记纯化的245bp扩增片段作探针，应用Southern免疫转印技术，与预先用限制性内切酶PvuⅡ消化的结核分支杆菌DNA杂交，得到限制性片段长度多态性图谱，结合患者的一般流行病学资料进行分析。结果：146株从部队和地方分离到的结核分支杆菌分离株，拷贝数在5以上的有138株，将这部分菌株按IS6110指纹特征分型可分为14个类型，部队和驻地患者分离株均以3个型别为主。且部队和地方分离菌株在各型中的分布无统计学差异。而耐药菌株指纹特征在三个主要型别中的分布与敏感菌株有显著性差异。结论：部队结核病与驻地地方结核病在传播中有密切的关系。提示部队结核病防治应与驻地地方结核病防治措施紧密结合。     

福建宁德市少数民族地区结核病分子流行病学研究

目的 了解福建省宁德市少数民族地区结核分枝杆菌的基因型特征。方法采用基于IS6110的PCR分型方法,对宁德市少数民族地区的73株结核分支杆菌进行检测,用Gel—Pro analyzer4．0软件和NTSYSpc2．10e软件对DNA指纹图谱进行聚类分析。结果根据IS6110-PCR指纹图谱,73株结核分支杆菌共分为两个主要类型,其中Ⅰ型48株占65．8％,Ⅱ型（北京基因型）25株占34．2％。汉、畲两族病例菌株指纹均为Ⅰ、Ⅱ型,但在两型中的分布差异有显著性（P〈0．01）,畲族以Ⅰ型居多,占78．9％。Ⅰ、Ⅱ型菌株耐药率分别为39．6％（19／48）、28．0％（7／25）。结论宁德市少数民族地区结核分支杆菌北京基因型呈一般水平的流行,汉、畲两族之间结核病存在近期传播关系,但畲族人群病例以Ⅰ型（非北京基因型）流行为主,且耐药率较高。     

应用PCR方法扩增IS6110保守片段快速鉴定结核分支杆菌

目的：了解PCR方法快速鉴定结核分支杆菌的可靠性，探索快速诊断结核病的实验方法。方法：应用PCR方法扩增149株结核分支杆菌临床分离株的IS6110保守片段，并与结核分支杆菌H37Rv标准株进行比较。结果：149株临床分离株中，140株可以扩增出与结核分支杆菌H37Rv标准株相同的123bp DNA片段(敏感性达93．9％)，而阴性对照均不能扩增出该片段。结论：应用PCR方法扩增IS6110保守片段来鉴定结核分支杆菌，结果准确可靠，且具有方便和快速等优点，有较大的临床应用价值。     

RAPD技术用于结核病交叉感染的鉴别

目的：调查RAPD技术用于结核菌株DNA指纹鉴定的效果。方法：采用多重PCR方法对一组2例母女同时发病的肺结核患者和一组2例先后发病的兄妹肺结核患者的病原菌进行了菌种鉴定。采用RAPD技术对它们的基因组DNA进行指纹多态性分析。结果：4株病原菌均为结核分支杆菌。经RAPD分型，其中母女组2菌株的DNA指纹图谱完全相同，兄妹组2菌株的DNA指纹图谱有所不同。证明母女组所染病原菌的同源性很好，很可能为同一感染源，母女之间交叉感染的可能性很大；兄妹组病原菌的同源性较差，为非交叉感染。结论：RAPD技术适用于结核分支杆菌流行病学调查，特别是交叉感染的鉴别。     

肺结核暴发流行的指纹鉴定及临床意义

目的了解结核菌的分子流行病学特征。方法采用随机引物PCR扩增方法（RAPD）对两组6例暴发流行的肺结核患者的痰结核分支杆菌DNA进行了指纹多态性分析。结果6株病原菌均为结核分支杆菌。经RAPD分析，其中例1和例2菌株的DNA指纹图谱完全相同，例3-例6菌株的DNA指纹图谱有所不同。证明例1和例2所染病原菌的同源性很好，很可能为同一感染源，母女间交叉感染的可能性很大；例3-例6病原菌的同源性较差，为非交叉感染。结论RAPD方法可获得较好的DNA指纹多态图谱。是一种简便、实用且相对比较便宜的DNA指纹技术，适于临床实验室进行分支杆菌的分子流行病学调查。     

固原地区结核分子流行病学的特点

目的　探讨宁夏固原地区结核分子流行病学的特点。方法　提取结核分枝杆菌基因组DNA ,经限制性内切酶PvuⅡ切割、琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后 ,用荧光标记的IS6 110DNA序列中 2 45bp探针杂交 ,以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号 ,比较各菌株指纹的IS6 110拷贝数和带型 ,分析流行菌株的特点。结果　固原地区流行结核分枝杆菌临床分离株DNA指纹图谱带型相似 ,IS6 110拷贝数较多。结论　固原地区流行的结核分枝杆菌多态性程度较低 ,在基因上具较近的亲缘关系。     

随机扩增DNA指纹分型分析耐利福平结核分支杆菌的传播

目的 对临床分离菌株进行鉴定,分析耐利福平结核分支杆菌是人群中传播。方法 采用一对随机引物（P15′－CCGGGGCGGTTC,P2,5′－CCGCCGACCGAC）,对从重庆地区肺结核病人痰标本中分离到的100株耐利福平结核发支杆菌的DNA进行随机PCR扩增,根据扩增产物的DNA电泳指纹进行分型。结果 100株耐利福平结核分枝杆菌的DNA指纹可分为6种类型,以Ⅱ、Ⅰ和Ⅲ型为主,它们分别占40％、31％和25％;这3型菌株有1／4是从初治结核病人的痰标本中分离,而地20－39岁年龄段则有1／3是从初治结核病人的痰标本中分离。结论 随机护增DNA指纹是一种简便、敏感、重复性好的菌株分型方法,可用于耐药性结核病流行监测。重庆地区结核病的流行很可能与耐利福平结核分支杆菌的传播有关。     

青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测

目的 了解青岛地区结核分支杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）分离株pncA基因突变的情况，探讨其与耐PZA之间的关系。方法 应用BACTEC-460培养系统对76例结核分支杆菌临床分离株进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测，聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测pncA基因的突变。结果 76株结核分支杆菌临床分离株均经PCR扩增出结核分支杆菌复合群保守序列IS6110基因片段，69株扩增出pncA基因的特异序列。后者包括：SSCP泳动异常者18株，其中耐药株13株，敏感株5株；SSCP泳动正常者51株，其中耐药株14株，敏感株37株。结论 青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA主要分子机制之一为pncA基因的突变；PCR—SSCP技术能快速准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA的突变，可弥补常规药敏试验的不足。     

RD105基因缺失法和双重PCR法对125株结核分枝杆菌菌株基因分型检测

目的 为明确比较RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力，同时掌握辽宁地区结核杆菌中北京家族菌株的流行情况而进行该项研究。方法 选取2011—2013年间辽宁省内各地市临床分离菌株，随机抽取经传统方法菌种鉴定为结核分枝杆菌的菌株，共计125株。选用超声破碎法提取菌株DNA，应用RD105基因缺失法和双重PCR法，同时对收集到的125株结核分枝杆菌进行特异性扩增，最后使用琼脂糖凝胶水平电泳对扩增的结果进行判断。结果 两种方法判断标准为：RD105基因缺失法结果中，出现283 bp大小片段的为北京家族菌株，不出现特异性条带的为非北京家族菌株；双重PCR法结果中，只出现393 bp大小片段的为北京家族菌株，而只出现570 bp大小片段为非北京家族菌株。使用上述两种方法鉴定本研究的125株结核分枝杆菌，结果完全相同，其中北京家族菌株有110株（88%），非北京家族菌株有15株（12%）。结论 RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力相当，并且北京家族菌株在辽宁地区流行的结核分枝杆菌中为绝对优势株；两种方法相对于传统的Spoligotyping法更简单、更省时，检测成本也较低，更适合在我国多数实验室推广应用。     

利用PCR结合膜芯片技术检测结核分支杆菌的实验研究.

目的:探讨聚合酶链反应(PCR)结合膜芯片技术用于检测结核分支杆菌的方法.方法:标记生物素的特异性引物,扩增17株菌标本IS6110插入序列的245 bp目的基因,结合膜芯片杂交检测结核分支杆菌基因.结果:15株结核分支杆菌标本中有12株扩增出245 bp目的基因,2株大肠杆菌及阴性对照标本PCR扩增结果为阴性.经膜芯片杂交,12株结核分支杆菌标本中有11株显色结果为阳性,其余显色结果为阴性.PCR结合膜芯片检测结核分支杆菌的灵敏度为73.3%,特异度为100%.结论:PCR结合膜芯片技术是一种具有发展潜力的检测结核分支杆菌的方法.     

2000年中国结核病流行病学抽样调查菌株分子流行病学特征

目的　从分子流行病学角度探讨中国结核分枝杆菌的分布特征。方法　样本的获得采用全国范围等比例分层整群随机抽样 ;构建以IS6 110RFLPDNA指纹方法和以DR为基础的SpoligotypingDNA指纹方法 ;采用Gelcompare4 1软件对DNA指纹图谱进行数字化 ,比较其相似性 ;同时应用该软件行聚类 (cluster)分析 ;用 χ2 检验比较不同组别病人的分离菌株成簇率 (clustering)的差别 ,利用公式 1和 2计算影响结核病近期传播的危险因素 (OR值 )。结果　共获得 4 0 2株可进行DNA指纹分析的结核分枝杆菌 ;其中 5 0 75 % (2 0 4 / 4 0 2 )为“北京基因型”菌株 ;发现 3簇指纹图谱相同的菌株 ,其中 1簇对应的病人来源于同一家庭 ;分组统计显示 :男性组与女性组、年龄≥ 4 0岁组与<4 0岁组成簇率之间差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,近期传播的危险因素男性为OR1:2 0 4 95 %CI(1 0 7～ 3 96 ) ,OR2 :4 96 95 %CI(2 77～ 9 0 0 ) ;<4 0岁为OR1:1 6 895 %CI(1 0 1～ 2 80 ) ,OR2 :1 30 95 %CI(0 2～ 0 4 4 ) ,其他各组之间差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　北京基因型结核分枝杆菌在中国呈较高水平的流行 ;男性和年长 (≥ 4 0岁 )可能为结核病近期传播的危险因素。利用结核分枝杆菌的DNA指纹图谱 ,可以实现结核分枝杆菌传染源     

Identification of a W variant outbreak of Mycobacterium tuberculosis via population-based molecular epidemiology

CONTEXT: Typing of Mycobacterium tuberculosis could provide a more sensitive means of identifying outbreaks than use of conventional surveillance techniques alone. Variants of the New York City W strain of M tuberculosis were identified in New Jersey. OBJECTIVE: To describe the spread of the W family of M tuberculosis strains in New Jersey identified by molecular typing and surveillance data. DESIGN: Population-based cross-sectional study. SETTING AND SUBJECTS: All incident culture-positive tuberculosis cases reported in New Jersey from January 1996 to September 1998, for which the W family was defined by insertion sequence (IS) IS6110 DNA fingerprinting, polymorphic GC-rich repetitive sequence (PGRS) typing, spacer oligotyping (spoligotyping), and variable number tandem repeat (VNTR) analysis. MAIN OUTCOME MEASURE: Identification and characterization of W family clones supplemented by surveillance data. RESULTS: Isolates from 1207 cases were analyzed, of which 68 isolates (6%) belonged to the W family based on IS6110 and spoligotype hybridization patterns. The IS6110 hybridization patterns or fingerprints revealed that43 patients (designated group A) shared a unique banding motif not present in other W family isolates. Strains collected from the remaining 25 patients (designated group B), while related to W, displayed a variety of IS6110 patterns and did not share this motif. The PGRS and VNTR typing confirmed the division of the W family into groups A and B and again showed group A strains to be closely related and group B strains to be more diverse. The demographic characteristics of individuals from groups A and B were specific and defined. Group A patients were more likely than group B patients to be US born (91 % vs 24%, P<.001), black (76% vs 16%, P<.001), human immunodeficiency virus positive (40% vs 0%, P = .007), and residents of urban northeast New Jersey counties (P<.001). Patients with group B strains were primarily non-US born, of Asian descent, and more dispersed throughout New Jersey. No outbreak had been detected using conventional surveillance alone. CONCLUSIONS: The implementation of multiple molecular techniques in conjunction with surveillance data enabled us to identify a previously undetected outbreak in a defined geographical setting. The outbreak isolates comprise members of a distinct branch of the W family phylogenetic lineage. The use of molecular strain typing provides a proactive approach that may be used to initiate, and not just augment, traditional surveillance outbreak investigations.     

Determination of drug susceptibility and DNA fingerprint patterns of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Kampala, Uganda

This study was undertaken to determine the rate of initial drug resistance and transmission patterns of Mycobacterium tuberculosis (TB) in Kampala, Uganda. Using a radiometric BACTEC 460 TB system, 215 M. tuberculosis isolates from previously untreated patients (aged 17-48 years, mean age = 28 years; 56% males and 69% HIV-seropositive) were analyzed for susceptibility to isoniazid, rifampin, streptomycin, and ethambutol. Isolates from 73 patients were examined for strain diversity or relatedness using the insertional sequence 6110 (IS6110) DNA fingerprinting technique. The study revealed the following drug resistance rates: isoniazid, 7.9%; streptomycin, 6.1%; rifampin, 1.4%; and ethambutol, 0.9%. Resistance to at least one of the first line drugs tested were developed by 12% of the strains, while 4.7% showed multiple resistance. However, no significant differences in resistance rates were found between patients with and without HIV infection. Using the number and size of DNA fragments containing IS6110, only three clusters of isolates with identical patterns were found out of the 73 isolates tested (8.2%). Each cluster contained two isolates, and three isolates had less than 7 copies of IS6110. These findings suggest that initial drug resistance to anti-tuberculosis agents in this region is low and similar to other countries in sub-Saharan Africa and that multiple strains of M. tuberculosis have been transmitted within the community.     

结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR检测体系的建立和应用

目的 建立结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测体系,并用于不同类型临床样本的检测.方法 常规提取13株结核分枝杆菌和14株非结核分枝杆菌临床分离株DNA,9例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和4例其他肺部疾病患者痰DNA,12例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和7例健康者血浆DNA.设计合成IS6110和IS1081扩增引物和检测探针,建立ddPCR检测体系.应用该体系检测分枝杆菌、痰和血浆3种DNA样本中靶标拷贝数,进行统计学分析.结果 建立了能同时检测IS6110和IS1081的ddPCR体系,该体系检测2个靶标的线性范围分别为0.5～8 733和0.2～2 893拷贝/μl反应体系.该体系具有较好的重复性(r＞0.95),以非结核分枝杆菌为对照检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度均为100％.在痰和血浆DNA样本检测中,2个靶标拷贝数在肺结核组均显著高于对照组.结论 结核分枝杆菌特异性核酸的ddPCR体系,可用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测,对提高结核病病原学诊断能力有重要意义.     

北京基因型结核分枝杆菌感染THP-1细胞系表达谱的研究

目的通过分析不同结核分枝杆菌感染巨噬细胞后表达谱的改变,探讨结核病(tuberculosis,TB),尤其是北京基因型结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis M.tb)感染的结核病免疫发病机制。方法具有IS6110 DNARFLP和Spoligotyping基因分型结果的265株北京基因型结核分枝杆菌(简称M.tb Beijing genotype)鉴定自2000年中国结核病流行病学抽样调查(简称2000年流调),采用平均连锁方法计算北京基因型结核分枝杆菌中心菌。结核分枝杆菌(M.tb H37Rv)、牛分枝杆菌(M.bovis)标准菌株和M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞,采用基因芯片分析其表达谱的改变。结果输入MAS系统,行进一步的分析。结果依据计算原则,相似系数最大为0.514,其对应菌株为结核分枝杆菌北京基因型中心菌株。分枝杆菌感染THP-1细胞后相应的芯片结果具有可靠性和可分析性。M.tb H37Rv、M.bovis、M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞的共同表达293个基因。共同表达基因的GO和pathway分析,发现一些不为人特别关注,但对结核免疫有一定作用的信号通路,例如B细胞受体信号通路。M.tb H37Rv、M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞差异表达基因包括:tnf,tnfrsf9,pim-1,icam-1和cd48。结论 2000年结核病流调以中国人口为整体,采用分层整群随机抽样。因此获得的M.tb Beijing genotype中心菌株具有中国代表性。293个基因可作为筛选用于菌阴结核病诊断的候选靶标。对这些差异表达基因涉及的信号通路,例如:JAK-STAT信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性以及TNF的深入分析,将对理解M.tb Beijing genotype免疫毒性特征有益。     

广东省结核分枝杆菌MIRU和RD105缺失基因分型研究

目的 了解广东省结核分枝杆菌(MTB)随时间、地区的动态流行分布特点.方法 应用24位点MTB散在分布重复单位(MIRU)分析广东省2013年455例MTB,筛选适合广东省分型的最佳MIRU组合,然后应用该最佳MIRU组合分析广东省2009年的173例、 2013年的455例及2015年的225例MTB,此外,结合RD105缺失基因法鉴定这些菌株中的北京家族菌株,比例法进行药物敏感性试验(DST),聚类分析采用BioNumerics(7.6).结果 2015年北京家族菌株比率(70.2%)高于2009年(59.5%)和2013年(59.3%),其中,中部地区比率最高(71.3%),东部地区最低(55.0%).MIRU-24位点的多态性存在差异, MIRU-12(HGI=0.999 1)能达到MIRU-15(HGI=0.999 2)相近的分辨率,MIRU-8分辨率较好(HGI=0.998 5).853例MTB的系统发生树(MST)主要包括1个北京家族和2个非北京家族复合群,可分为Ⅰ、Ⅱ两群,广东省MTB的主要流行群是Ⅱ群,Ⅰ群中2009、2013年菌株比率高于2015年,东部地区菌株比率高(43.069%),中部地区低(27.206%),Ⅱ群则与之相反,北京家族菌株的MST主要包括1个复合群,包含407个独特型和46个簇.非北京家族菌株的MST主要包括2个复合群,包含309个独特型和6个簇.另外,广东省不同年份多药耐药(MDR)(X2=2.176,P=0.337)和广泛耐药(XDR)(X2=1.468,P=0.480)耐药率差异无统计学意义(P>0.05).结论 北京家族菌株是广东省的主要流行株,且随时间存在上升趋势,中部地区比率最高,该省MDR和XDR耐药趋势相对稳定,MIRU分型用于广东省MTB的分子流行病学研究可取得满意结果.     

Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis in Gansu province of China

Background  Mycobacterial interspersed repetitive units-variable number tandem repeat (MIRU-VNTR) and Beijing family typing based on detecting the deletion of RD105 sequence are two common genotyping methods used to study the molecular epidemiologic characteristics of Mycobacterium (M.) tuberculosis. We collected 218 strains of M. tuberculosis between 2004 and 2006 in the Linxia Hui Autonomous Prefecture of Gansu province in Northwest China.

Methods  MIRU-VNTR analysis and Beijing family typing based on detecting the deletion of RD105 sequence were used to type the 218 strains, and their typing power was evaluated to look for practical and efficient genotyping methods suitable for the region.

Results  The MIRU typing yielded 115 distinct genotypes, including 98 unique isolates and 17 different clusters containing 120 isolates (55.05%); the cluster rate was 47.25%. By detecting the deletion of RD105 sequence, 188 of 218 (86.23%) isolates belonged to Beijing family. Combination of Beijing family typing and MIRU typing yielded 118 distinct patterns, including 101 unique isolates and 17 clusters containing 117 isolates (54.13%). The largest cluster contained 58 strains with MIRU genotype of 223325173533 which contained 50 strains belonging to Beijing family and 8 strains belonging to non-Beijing family.

Conclusions  The Beijing family strains occupied a large proportion and the Beijing family MIRU genotype 223325173533 is a dominant strain in Linxia of Gansu. Combining detecting the deletion of RD105 and MIRU typing together provides a simple, fast, and effective method which is low in cost and might be practical and suitable for M. tuberculosis genotyping in China.

     

分子信标荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌方法的初步研究

目的建立分子信标荧光定量PCR快速检测结核杆菌方法,为临床结核病的诊断提供特异性强、灵敏度高、可标准化、自动化的检测方法。方法根据GenBank数据库公布的结核分枝杆菌IS6110基因的保守序列,设计引物与分子信标探针,建立结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法;以10种细菌作对照分析该方法的特异性与灵敏度;应用已建立的方法检测结核分枝杆菌,评价其应用价值。结果所建立的分子信标荧光定量PCR检测10种细菌,只有结核分枝杆菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,4拷贝/PCR反应体系的结核分枝杆菌都能有效检出。对100株结核分枝杆菌的检测结果为阳性,单一检测时间仅需2h。结论分子信标荧光定量PCR检测方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于快速诊断结核病,为结核病的诊断与治疗提供新的检测手段。