成年兔坐骨神经雪旺细胞的分离纯化培养

目的：探讨从成年新西兰兔坐骨神经分离培养获得大量雪旺细胞的有效手段,方法：利用成年免发生Wallerian变性的坐骨神经用植块法进行培养,通过相差显微活细胞计数和S－100细胞化学标记相结合鉴定了雪旺细胞增值和纯化程度。结果：通过上述方法获得大量雪旺细胞纯度达95％,并绘制其生长曲线,体外培养的雪旺细胞倍增时间为8d。结论：本方法能获得大量高纯度的雪旺细胞,为组织工程修复周围神经缺损打下基础。     

改良消化复合植块法培养新生大鼠雪旺细胞

目的探讨改良的单酶消化法与组织贴块法相结合的培养雪旺细胞(SCs)的方法,并与经典植块法和普通消化复合植块法进行比较。方法取新生3~5 d的SD大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经,分别采用经典植块法、普通消化复合植块法、改良消化复合植块法培养SCs。培养7 d后进行细胞消化和传代,在显微镜下计数并计算细胞总量。用S-100免疫荧光染色法检测所获细胞的纯度。结果改良消化复合植块法培养的SCs生长增殖速度最快,可获取(1.85±0.13)×106个细胞;普通消化复合植块法次之,可获取(1.10±0.10)×106个细胞;经典植块法所获SCs的生长增殖速度最慢,可获取(0.77±0.03)×106个细胞,3种方法比较差异均有统计学意义(P<0.01)。S-100免疫荧光染色结果显示,改良消化复合植块法细胞纯度为(95.73±1.51)%,普通消化复合植块法为(84.66±2.68)%,经典植块法为(74.50±4.23)%,3种方法比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论改良消化复合植块法可以在短时间内获得大量高纯度的SCs,为研究周围神经修复再生奠定良好的基础。     

新生大鼠雪旺细胞体外培养及纯化的方法比较

目的：比较体外培养及纯化雪旺细胞的两种方法。方法：用显微镜观察摄像及S－100免疫细胞化学染色的方法对Ara-c杀灭纯化培养法及分级沉淀培养法细胞的生长态势和纯化率作一比较，结果：分级沉淀培养及纯化SC细胞，生长态势良好且纯化率可达85％－90％，总体效果优于Ara-C杀灭纯化培养法。结论：分级沉淀培养SC可以达到SC体外扩增的目的且可达到一定的纯化率，如要提升纯化率，可再结合Ara-c 杀灭纯化方法或其它方法。     

新生大鼠雪旺细胞的体外培养和纯化

目的:探索简单有效获取大量高纯度雪旺细胞的新方法。方法:分离出生3d的新生SD大鼠坐骨神经,使用胰蛋白酶及I型胶原酶混合消化,结合差速贴壁法和G418纯化。四氮唑盐(MTT)比色法测定细胞的生长增殖情况,免疫细胞化学方法计算雪旺细胞的纯度。结果:胰酶和胶原酶混合消化后的活细胞率为94.6±3.4%,纯化后的雪旺细胞纯度为95.6±2.5%。结论:胰酶和胶原酶混合消化结合差速贴壁和G418纯化是获取大量高纯度雪旺细胞的简单有效方法。     

成年兔雪旺细胞体外培养增殖和纯化的实验研究

目的探讨从成年大白兔周围神经体外分离、纯化、培养的条件，观察雪旺细胞在体外存活、生长情况，目的在于改进雪旺细胞的体外培养条件，寻找一种较好的获取雪旺细胞的方法。方法利用成年兔发生Wallerian变性的双侧坐骨神经，剪碎至1mm的植块，经改良后反复差速贴附法进行培养，应用b-FGF刺激SC增殖；采用相差显微镜下观察雪旺细胞状态计数和S-100细胞免疫组化染色相结合鉴定；绘制生长曲线，按照细胞倍增时间公式计算其倍增时间。结果采用发生Wallerian变性后的兔双侧坐骨神经，经改良后差速贴壁培养方法能够明显抑制成纤维细胞的生长，但对雪旺细胞的生长影响较小，可获得大量高纯度的雪旺细胞，经S-100蛋白免疫组化鉴定，雪旺细胞纯度达94％以上，细胞数量达1×10^6／mL以上；绘制其生长曲线，并计算得出体外培养的第三代雪旺细胞体外倍增时间为3d；一定浓度的b-FGF和NGF可促进雪旺细胞的增殖。结论①联合采用发生Wallerian变性后的神经、改良差速贴壁培养、b-FGF和NGF促进雪旺细胞增殖是一种较经济、简便、实用的方法，可获得较高纯度的雪旺细胞。②本培养方法能够获得大量高纯度的雪旺细胞，可作为周围神经组织工程实验研究的细胞来源。     

周围神经组织工程进展

20世纪80年代末材料工程的发展极大地促进了周围神经损伤修复的研究。人工神经是由具有良好生物相容性的可降解高分子载体，结合以雪旺细胞为主的活性细胞，形成的具有特定三维结构的复合体。该领域的研究目前还处于起步阶段，主要研究内容包括：种子细胞的分离纯化培养；支架材料的开发；人工神经的组织还原。     

自体静脉套管联合雪旺细胞移植对周围神经缺损再生的影响

目的观察自体静脉套管联合雪旺细胞移植对周围神经缺损再生的影响,以探索周围神经缺损修复的新的治疗方法。方法20只新西兰白兔随机分为实验组和对照组,每组10只。取兔自体股外静脉,套于神经两断端之间,制成静脉套管,实验组向静脉套管内注射雪旺细胞、对照组注射生理盐水,术后6周通过光镜及透射电镜观察神经再生情况,采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计分析,组间均值比较采用t检验,P〈0.05为差异有统计学意义。结果HE染色结果显示,实验组有髓神经和无髓神经数量较多,排列较整齐,髓鞘清晰可见,纤维数量较少。对照组有一定数量无髓神经,而有髓神经少见,纤维数量较多。t检验结果显示差异具有统计学意义（P〈0.05）。电镜观察实验组有髓神经纤维数量较多,排列较整齐,髓鞘清晰可见,纤维数量较少。可见雪旺细胞与有髓神经纤维相连。对照组有髓神经纤维和无髓神经纤维数量较少,排列不整齐,髓鞘不清晰,纤维数量较多,无雪旺细胞。结论本研究结果表明静脉套管可以促进周围神经再生;雪旺细胞注入神经缺损的静脉套管对周围神经再生的作用优于单纯使用静脉套管。     

GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠坐骨神经缺损的修复作用

目的应用携带胶质细胞源性神经营养因子基因的逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GDNF)对体外培养的雪旺细胞进行基因修饰,并结合细胞外基质凝胶及生物可降解聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)管构建神经移植复合体,用于大鼠坐骨神经缺损的修复,同时对其促轴突再生及神经元保护作用予以检测评价.方法 40只成年Wistar大鼠随机分为4组:A组(n=10) 细胞外基质凝胶-PLGA管桥接组;B组(n=10)雪旺细胞-细胞外基质凝胶-PLGA管桥接组;C组(n=10) GDNF基因修饰的雪旺细胞-细胞外基质凝胶-PLGA管桥接组;D组(n=10)自体神经桥接组.损伤各组12周时应用神经电生理及甲苯胺蓝染色和透射电镜观测神经再生情况,辣根过氧化物酶神经逆行示踪技术用于脊髓前角运动神经元再生评价.结果 12周时再生神经运动传导速度检测、甲苯胺蓝染色轴突形态计量学分析、透射电镜超微结构观察以及脊髓前角运动神经元再生评价结果提示:C组优于A、B组,而与D组相比无明显差异.结论雪旺细胞的转基因处理可能弥补单纯细胞移植神经营养因子含量的不足,而可能达到与自体神经移植相似的效果.     

骨髓间充质干细胞在软骨细胞培养条件下生物学特点的观察

目的 观察骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs)在软骨细胞培养条件下传代培养的主要生物学特性。方法 梯度离心分离幼兔骨髓有核细胞，培养分离MSCs并进行传代培养，观测在体外软骨细胞培养条件下MSCs形态，生长特点及Ⅰ型和Ⅱ型胶原，蛋白多糖聚集体合成分泌以及碱性磷酸酶活性等方面的变化。结果 （1）MSCs原代细胞呈可见的均匀分布的簇状生长，呈长梭形，在传代培养中形态特性无明显变化，均质性明显提高。（2）各代Ⅰ型胶原免疫组化均为阳性，Ⅱ型胶原免疫组化均为阴性。（3）在各代培养中碱性磷酸酶染色均为阴性，对甲苯胺蓝存在极弱的异染性反应；（4）细胞外基质中硫酸糖胺多糖含量亦很低。结论 传代培养中骨髓MSCs保持了常规低糖培养条件下的基本生物学特点，说明常用的软骨细胞基础培养条件同样适合骨髓MSCs的培养。     

昆明小鼠胰腺干细胞分离培养及特性鉴定

目的：分离培养昆明小鼠胰腺干细胞并进行鉴定和观察其分化胰岛细胞的能力。方法：用酶消化法分离生后不同时期昆明小鼠胰腺干细胞，用细胞角质蛋白19（Cytokeratin19,CK19）、胰岛素（Insulin）和胰高血糖素（Glucagon）抗体进行免疫细胞化学染色，鉴定细胞各类和分化特性。结果：分离初，可见少量上皮样细胞存活，更换含有生长因子的培养基后，可见细胞分裂增殖，呈长梭形，逐渐形成集落。传代后鉴定呈CK19阳性。高糖诱导分化后，细胞形成胰岛样结构，免疫细胞化学染色显示大部分细胞胰岛素阳性，少数细胞呈胰高血糖素阳性。结论：昆明小鼠胰腺干细胞能在体外培养条件下增殖，具有分化形成胰岛β细胞和α细胞的能力。     

PDLLA-T3对体外培养雪旺细胞影响的实验研究

目的观察甲状腺激素人工神经(PDLLA-T3)对体外培养雪旺细胞的影响.方法体外纯化、培养雪旺细胞后,在雪旺细胞培养板中加入PDLLA-T3(C组),混合培养6d,实验采用MTT法每天观察细胞活性的高低,用血球计数板对雪旺细胞进行计数,并用ELISA方法测定每天培养液中NGF含量的变化.另有不合T3的支架材料PDLLA(B组)、空白组(A组)作为实验对照组.结果培养的雪旺细胞纯度达到94.63%.PDLLA-T3比PDLLA和空白组明显增加雪旺细胞的数量,提高细胞活性,刺激雪旺细胞产生更多的NGF.结论 PDLLA-T3和雪旺细胞有较好的组织相容性,对培养的雪旺细胞有较好的正性促进作用,是一种良好的组织工程支架.     

周围神经组织工程种子细胞的研究进展

周围神经组织工程的研究目前还处在起步阶段，主要研究包括：种子细胞的分离和培养，支架材料的开发，人工神经的组织还原。体外构建工程组织的核心方法是首先分离自体或异体组织的细胞，经体外扩增达一定数量后，将这些细胞种植到预先构建好的三维支架上，在适宜的条件下，细胞沿着支架迁移、铺展、生长和分化，最终发育成为具有特定形态功能的工程组织。本文从组织工程方面对种子细胞的研究进展做一综述。     

骨组织工程中种子细胞与细胞支架复合培养的研究进展

骨组织工程的研究热点主要集中在种子细胞、支架材料和骨组织构建3个方面,其中种子细胞与细胞支架复合体的体外培养既是骨组织工程的基础,也是其研究的重点。细胞只有有效与支架材料充分的黏附,并在支架中良好的迁移、扩增和分化,才能形成具有骨组织修复功能的细胞-支架复合体。文章对骨组织工程中细胞-支架复合体的体外构建作一综述,为骨组织工程的研究及细胞的三维立体培养提供参考。     

培养的周围神经组织特殊三色染色法

目的；以特殊三角染色法显示培养的周围神经组织中轴索及雪旺氏细胞等结构。方法：大鼠背根神经体外培养后，用苏木素精，固绿ＦＣＦ，变色素２Ｒ及磷钨酸等配制三色染色液染色。结果：神经轴索呈蓝绿色，雪旺氏细胞核为红色或紫红色，胞质为浅灰色。结论：特殊的三色染色法能区别显示培养的周转神经组织中轴索及雪旺氏细胞。     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖影响的实验研究

目的观察羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖能力的影响。方法（1）取第四代兔视网膜Müller细胞以3×10^4个／ml接种于96孔板,200μl／孔,24h后加入不同浓度羊膜匀浆条件培养基（800、400、200、100μg／ml）,培养24、48、96h后,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测Müller细胞增殖率。（2）第四代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml密度接种于预置有盖玻片的6孔板中,24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基,继续培养48h后,免疫组化细胞核增殖抗原（PCNA）检测。（3）4代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml接种于6孔板中,24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基,继续培养48h,流式细胞仪观察细胞周期变化。结果随着条件培养基中羊膜匀浆浓度的增加,对兔视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐增强,800μg／ml时获得最大增殖效应,细胞增殖率为62．5％;细胞周期分析显示：进入S期的细胞数明显增加（56．49％）。在羊膜匀浆浓度恒定条件下,随着时间延长,其对视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐加强,在48h即达到较高的增殖效应,96与48h相比差异无统计学意义（F=0．233、0．007,P=0．492、0．729）。800μg／ml组和400μg／ml组PCNA阳性表达率（0．84±0．07;0．79±0．06）与对照组（0．54±0．12）相比差异具有统计学意义（x^2=-0．182、-0．151,P=0．002、0．015）。结论羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞具有促进增殖作用,且呈浓度和时间依赖性。     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPIF)原代培养的成功率,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块,获取细胞;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为77．8％。获得的细胞呈梭形,抗波形丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率,方法可行。     

改良酶消化法培养成骨细胞的研究

【目的】采用改良胶原酶法体外培养大鼠颅骨成骨细胞。【方法】取新生24 h SD大鼠颅骨,剔净后剪成碎块。依次以0.25%胰蛋白酶-0.02?TA和0.1%Ⅰ型胶原酶消化后,培养于-αMEM培养液中。倒置显微镜下观察形态学变化,钙钴染色法检测ALP活性,茜素红染色法观察矿化结节的形成。【结果】培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶呈阳性。【结论】采用改良胶原酶法培养的成骨细胞操作简便,成活率高,细胞具有典型的成骨细胞形态特征,且成分较单一。     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖影响的实验研究

目的观察羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖能力的影响。方法（1）取第四代兔视网膜Müller细胞以3×10^4个／ml接种于96孔板，200μl／孔，24h后加入不同浓度羊膜匀浆条件培养基（800、400、200、100μg／ml），培养24、48、96h后，用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测Müller细胞增殖率。（2）第四代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml密度接种于预置有盖玻片的6孔板中，24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基，继续培养48h后，免疫组化细胞核增殖抗原（PCNA）检测。（3）4代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml接种于6孔板中，24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基，继续培养48h，流式细胞仪观察细胞周期变化。结果随着条件培养基中羊膜匀浆浓度的增加，对兔视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐增强，800μg／ml时获得最大增殖效应，细胞增殖率为62．5％；细胞周期分析显示：进入S期的细胞数明显增加（56．49％）。在羊膜匀浆浓度恒定条件下，随着时间延长，其对视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐加强，在48h即达到较高的增殖效应，96与48h相比差异无统计学意义（F=0．233、0．007，P=0．492、0．729）。800μg／ml组和400μg／ml组PCNA阳性表达率（0．84±0．07；0．79±0．06）与对照组（0．54±0．12）相比差异具有统计学意义（x^2=-0．182、-0．151，P=0．002、0．015）。结论羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞具有促进增殖作用，且呈浓度和时间依赖性。