保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶基因的克隆及生物信息学分析

为了研究保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶基因的结构特征及编码蛋白的功能,根据GenBank中其基因的DNA序列设计引物,以保加利亚乳杆菌MN株的基因组为DNA模板,利用PCR技术扩增N-乙酰胞壁质酶基因,将其克隆到pMD-19T载体上,进行测序与生物信息学分析。结果表明,MN株N-乙酰胞壁质酶基因序列编码217个氨基酸,与GenBank中公开的N-乙酰胞壁质酶基因核苷酸序列的同源性为98.8%～100.0%;蛋白质的理论分子质量为24.55 ku,理论等电点为9.83;该蛋白属于亲水性蛋白,二级结构以α-螺旋为主;该蛋白的第16～38位氨基酸残基组成跨膜区,第56～216位氨基酸残基组成LYZ2结构域。研究结果为今后探讨N-乙酰胞壁质酶基因的生物学功能及其功能改造奠定了基础。     

N-乙酰胞壁质酶缺失对保加利亚乳杆菌LJJ自溶及形态的影响

【目的】乳酸菌自溶在发酵乳制品生产中广泛存在,自溶的速率和程度可以对产品的质量、风味、生产周期产生重要影响,在整个发酵过程中非常重要。N-乙酰胞壁质酶作为肽聚糖水解酶中的重要组成,可以破坏细胞壁完整性,在乳酸菌自溶过程中发挥着重要作用。论文旨在研究N-乙酰胞壁质酶缺失对保加利亚乳杆菌自溶的影响及对其形态的影响。【方法】分别以保加利亚乳杆菌基因组和pMG36e载体为参考序列设计引物,PCR分别扩增保加利亚乳杆菌中N-乙酰胞壁质酶的上下游同源臂基因m-up, m-down和pMG36e中的红霉素抗性基因。上述基因经过测序验证后,将经Kpn Ι,Xba Ι双酶切的红霉素抗性基因和pUC19相连接形成重组载体pUC:Emr并进行验证。随后,将经Kpn Ι,Sac Ι双酶切的m-down和重组载体pUC:Emr相连接形成重组载体pUC:Emr:m-down并进行验证。最后,将经Pst Ι,Xba Ι双酶切的 m-up与重组载体pUC:Emr:m-down相连接形成重组载体pUC:m-up:Emr:m-down并进行验证。以重组载体pUC:m-up:Emr:m-down作为N-乙酰胞壁质酶的同源重组敲除组件, 在电转化条件电压1.5 kV,电阻400 Ω和电容25 μF下,电转入保加利亚乳杆菌,在含有红霉素的MRS琼脂平板上筛选N-乙酰胞壁质酶基因敲除突变菌株并进行PCR验证。采用核酸溶出法检测基因缺失菌株与野生型菌株间的自溶度变化。扫描电子显微镜观察基因缺失菌株与野生型菌株间的形态变化。【结果】构建得到在N-乙酰胞壁质酶中间插入红霉素抗性基因为筛选标记的敲除组件用于保加利亚乳杆菌中N-乙酰胞壁质酶的基因敲除。获得带有红霉素抗性基因的N-乙酰胞壁质酶缺失的保加利亚乳杆菌突变菌株。突变菌株相比野生型菌株自溶特性及形态均发生显著变化,其中自溶度显著降低,37℃下自溶24 h,野生型菌株的自溶度约为73%,而突变菌株的自溶度约为35%,自溶度降为原来的1/2。野生型菌株的单个菌体细胞长度约10 μm,突变菌株的单个菌体细胞约30-40 μm,相比野生型菌株约增长了3-4倍。【结论】N-乙酰胞壁质酶在保加利亚乳杆菌自溶与细胞分裂过程中起着重要作用。保加利亚乳杆菌中N-乙酰胞壁质酶的缺失会导致菌体自溶的降低和菌体增殖过程中的细胞分裂受阻,产生菌体长度增长约3-4倍的菌体细胞。     

右旋糖酐酶酶学性质研究

右旋糖酐酶专一性水解右旋糖酐中的α-1,6糖苷键,使右旋糖酐高效水解为一定分子量的右旋糖酐用于医药等领域。右旋糖酐酶酶学性质研究表明,酶作用的最适pH和温度分别为pH 5.0和55℃,最适底物浓度为2%右旋糖酐;在50℃以下相对稳定;在pH 2.2～9.6范围内相对稳定,具有良好的酸碱稳定性;酶对底物的亲和力随底物分子量的增加而增强;Mn~(2+)具有显著的激活作用,Cu~(2+)对酶具有较强抑制作用。     

米糠过氧化物酶的酶学性质研究

以邻苯二胺、过氧化氢为底物,采用分光光度计测定氧化产物的方法对米糠过氧化物酶的性质进行了研究,结果表明:过氧化物酶活性在35℃达到最大值,最适pH值为6.5,在反应5 min时,达到酶的最大反应活度;金属离子钾、钠、钙对过氧化物酶有不同程度的抑制作用,抑制作用表现为钙离子>钠离子>钾离子,木瓜蛋白酶和抗坏血酸在不同范围下呈现出不同的抑制和促进作用。由Linewear-Burk方程,得到过氧化氢Vmax=9.708×10-3△A/min,Km=15.135×10-3mol/L;邻苯二胺的Vmax=12.346×10-3△A/min,Km=19.247×10-3mol/L。     

米糠过氧化物酶的酶学性质研究

以邻苯二胺、过氧化氢为底物,采用分光光度计测定氧化产物的方法对米糠过氧化物酶的性质进行了研究,结果表明:过氧化物酶活性在35℃达到最大值,最适pH值为6.5,在反应5 min时,达到酶的最大反应活度;金属离子钾、钠、钙对过氧化物酶有不同程度的抑制作用,抑制作用表现为钙离子>钠离子>钾离子,木瓜蛋白酶和抗坏血酸在不同范围下呈现出不同的抑制和促进作用。由Linewear-Burk方程,得到过氧化氢Vmax=9.708×10-3△A/min,Km=15.135×10-3mol/L;邻苯二胺的Vmax=12.346×10-3△A/min,Km=19.247×10-3mol/L。     

氟磺胺草醚降解酶的定位及其酶学性质的研究

[目的]对氟磺胺草醚降解菌提取的降解酶进行定位,探讨其最适的酶促反应条件。[方法]通过采用紫外分光光度法测定酶活力来对氟磺胺草醚降解菌株F12提取的降解酶进行定位,并研究其酶学性质。[结果]氟磺胺草醚降解菌株F12降解酶属于胞外酶,最适的酶促反应时间为30 min,最佳的酶浓度为1.0 ml,最适pH为7.5,最适反应温度为35℃,最适添加药浓度为150 mg/L。[结论]试验结果为规模化生产氟磺胺草醚降解酶制剂及治理污染土壤提供了理论依据。     

蒜氨酸酶动力学性质研究

[目的]研究蒜氨酸酶的动力学性质。[方法]分别测定温度、pH值、底物浓度及金属离子对蒜氨酸酶活性的影响,并计算最大反应速度及米氏常数。[结果]蒜氨酸酶为热不稳定性酶,其最适反应温度为29℃,最适pH值为6.1;以其天然抽提物为底物测得最大反应速度及米氏常数分别0.492IU/mg、0.483mmol/L;K+、Mg2+、Ca2+、Na+和Cd2+对蒜氨酸酶活性有一定的激活作用,Cu2+对酶活性有抑制作用。[结论]该研究可为开发应用蒜类药用产品提供依据。     

多氯联苯降解酶的分离纯化及酶学性质研究

采用硫酸铵盐析浓缩、透析、Sephdex G-150凝胶过滤层析,对表皮葡萄球菌产生的多氯联苯(PCBs)降解酶进行分离纯化.粗酶经30%～80%饱和度硫酸铵沉淀法纯化后比酶活可提高到442.29 U/mg;经透析后的比酶活可提高到480.75 U/mg;最后经凝胶层析法纯化后的比酶活可提高到6 903.57 U/mg...     

普鲁兰酶产生菌的筛选及部分酶学性质研究

利用选择性培养基从淀粉加工厂附近土壤中分离出11株具有产普鲁兰酶能力的菌株,对其中产酶能力最高的PB1菌株所产酶进行了性质测定。结果显示:PB1所产普鲁兰酶活力为3.25U/mL;该酶最适反应温度为60℃,在低于70℃范围内热稳定性较好;最适反应pH值为5.0～6.0,在pH值为4.0～7.5范围内稳定;Fe3+对该酶活性有明显的促进作用,而Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+对该酶活性有强烈的抑制作用。     

普鲁兰酶产生茵的筛选及部分酶学性质研究

利用选择性培养基从淀粉加工厂附近土壤中分离出11株具有产普鲁兰酶能力的茵株,对其中产酶能力最高的PB1菌株所产酶进行了性质测定.结果显示:PB1所产普鲁兰酶活力为3.25U/mL;该酶最适反应温度为60℃,在低于70℃范围内热稳定性较好;最适反应pH值为5.0～6.0,在pH值为4.0～7.5范围内稳定;Fe3 对该酶活性有明显的促进作用,而Cu2 、AS 、Hg2 、Pb2 对该酶活性有强烈的抑制作用.     

不同质膜稳定剂对烟草原生质体细胞壁再生的影响

质膜稳定剂能增加完整原生质体数量,防止质膜破坏,促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。本研究拟在原生质体酶解液中分别加入CaCl2.2H2O、KH2PO4、MES 3种质膜稳定剂,或3种质膜稳定剂组合分离、提纯、培养原生质体,探讨3种质膜稳定剂对烟草原生质体细胞壁再生的影响。结果表明:3种质膜稳定剂对于解离出的原生质体的质量及原生质体细胞壁再生和原生质体细胞分裂都有一定影响,最佳浓度分别为CaCl2.2H2O 10 mM、KH2PO40.7 mM、MES 5 mM;3种质膜稳定剂组合以CaCl2.2H2O 5 mM、KH2PO40.35 mM与MES 2.5 mM的组合最佳,原生质体壁再生率达88.5%,细胞分裂率达77.5%,表明能最快促进烟草原生质体细胞壁再生及细胞分裂生长。     

桃品种间质地、水分及细胞壁组分的比较

为了探索桃果实的贮藏品质,利用生物力学、核磁共振影像、理化检测等分析手段,以北方晚熟桃品种为试材,研究桃品种间和贮藏期间质地、水分和细胞壁组分之间的差异及相互关系。结果表明:硬度从大到小依次是‘蟠桃’‘青州蜜桃’‘中华寿桃’和‘肥城桃’,‘蟠桃’硬度大,T_(23)弛豫时间长,水溶性果胶质量分数高,但纤维素质量分数低,而‘肥城桃’硬度最小,果胶、半纤维素和纤维素质量分数低,T_(23)弛豫时间短,自由水较多。相关性分析显示,桃果肉硬度与T_(23)、可溶性果胶、共价结合型果胶和半纤维素呈显著正相关,而粘附性与离子结合型果胶、半纤维素和纤维素呈显著负相关。T_(22)与T_(20)、T_(21)和T_(23)均呈显著正相关,T_(22)与可溶性果胶和半纤维素显著正相关,T_(23)与可溶性果胶、共价结合型果胶和半纤维素均呈显著正相关,桃品种间硬度的差异是细胞壁组分和水分共同起作用的结果。并且,通过贮藏试验进一步表明,‘肥城桃’果实硬度下降伴随着纤维素和半纤维素的降解,水溶性果胶显著增加,果实内紧密结合水(T_(20))逐渐消失,而自由水(T_(23)和M_(23))显著增加。     

烟叶细胞壁物质研究进展

细胞壁物质是烟草的重要组成部分。作者总结了现阶段细胞壁物质在卷烟加工过程中的变化、与其他指标的关系以及细胞壁物质调控手段等方面的研究进展,并对其发展趋势进行了展望。     

Evaluating Kinetic Composing of Cell Wall for Low-Fiber Mutation Rice

The work compared the differences of low fiber mutation rice (LF, Nendao) that selectedthrough gamma-ray (γ) with parental variety Shuangkezao (CK) on their biologicaldevelopment and cell wall composing after rice heading stage. Comparing with parentalrice, LF rice revealed an advantage on its vegetative growing by increasing the yieldsof leave blade, leave sheath and stem for 27.77, 30.19 and 37.96% respectively. And thecellulose content of LF rice straw was decreased remarkably for 23.9%, the hemicellulose,lignin and biogenic silicon contents were increased contrarily for 11.94, 8.79 and 5.60%respectively. Moreover, the crude protein content was increased by 20.71% for LF rice andwith an improvement on its solubility for 63.49% concomitantly. The results indicatedthat the Iow-fiber mutation rice exhibited its potential as a fodder-rice variety or asdual-purpose rice to improve fiber degradability of straw.     

细胞壁分解酶与果实软化的关系研究进展

软化是影响果实采后寿命的重要因素.为了延长水果的货架期,各国植物生理学家对果实软化机理进行了长期不懈的探讨,作者综述了近几年最新研究进展.过去一直认为水果软化主要是果胶酯酶作用的结果.最近几年通过反义技术观察细胞壁酶与果实软化的关系,结果表明果实软化不是任何一个酶单独作用的结果,而是成熟过程一系列细胞壁酶有序作用的结果,这些细胞壁酶的作用通常还依赖于其他酶的活性.但各种酶在不同种类果实成熟与软化过程的表现各有特点,有的甚至完全相反.因此控制果实软化需要针对不同种类的果实控制不同的酶活性.这些结果对从事水果保鲜的研究人员具有一定的参考价值.     

小麦细胞壁糖蛋白的耐盐性保护作用与机制研究

 小麦盐胁迫处理后发现，强耐盐品种（961、R-025、鲁德1号和R-017）细胞壁结合的羟脯氨酸及糖蛋白合成显著高于盐敏感品种（东103和中国春）；品种间的游离脯氨酸含量与其耐盐性关系不明显。电镜观察结果表明：盐胁迫过程中强耐盐品种其细胞表面糖蛋白层明显增厚、致密，而盐敏感品种则变薄、脱落甚至完全消失，游离到细胞间隙中。细胞壁糖蛋白的积累是小麦品种耐盐性反应的重要生化机制，在小麦的耐盐生理活动中起着重要作用。     

两歧双歧杆菌PRL2010细胞壁蛋白预测和功能分析

[目的]运用生物信息学方法预测两歧双歧杆菌PRL2010锚定于细胞壁的蛋白和功能分析,为后续研究该菌与宿主相互作用的分子机制奠定基础。[方法]用Phobius和Signal P 4.0软件对两歧双歧杆菌PRL2010全基因组编码蛋白中细胞壁蛋白进行预测,同时采用COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)功能数据库对预测的细胞壁蛋白进行功能注释和聚类分析。[结果]两歧双歧杆菌PRL2010基因组1 706个编码蛋白中,28个蛋白含有细胞壁的锚定结构域。细胞壁蛋白功能分析结果显示,28个细胞壁蛋白中,21个蛋白没有功能注释,7个蛋白有功能注释,其中1个蛋白(exo-alpha-sialidase)参与碳水化合物代谢与转运,2个蛋白(bacteriophage endolysin和cell wall-associated protein)参与细胞壁和细胞膜的生物合成,2个蛋白(hypothetical protein BBPR_0440和Subtilisin family peptidase)参与蛋白质翻译后修饰,1个蛋白(beta-n-acetylhexosaminidase Nag Z)参与细胞内运输、分泌和囊泡运输,1个蛋白(metallophosphoesterase)功能只是预测的。[结论]两歧双歧杆菌PRL2010的大多数细胞壁蛋白功能未知,还需要在以后的研究中进一步分析和注释。     

动物双歧杆菌AD011细胞壁蛋白的预测和功能分析

[目的]运用生物信息学方法预测动物双歧杆菌AD011锚定于细胞壁的蛋白并进行功能分析,为后续研究该菌与宿主相互作用的分子机制提供基础资料。[方法]用Phobius和SignalP 4.0软件对动物双歧杆菌AD011全基因组编码蛋白中细胞壁蛋白进行预测,同时采用COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)功能数据库对预测的细胞壁蛋白进行功能注释和聚类分析。[结果]动物双歧杆菌AD011基因组1 518个编码蛋白中,11个蛋白含有细胞壁的锚定基序,6个蛋白含有LP×TG基序,1个蛋白含有Lys M基序,1个蛋白含有PG结合区域,2个蛋白含有SLH结构域,1个蛋白含有NLPC_P60结构域。细胞壁蛋白功能分析结果显示,11个细胞壁蛋白中,9个蛋白没有功能注释,2个蛋白(NLP/P60 protein和1,4-beta-N-acetylmuramidase)参与细胞壁和细胞膜的生物合成。[结论]动物双歧杆菌AD011大多数细胞壁蛋白功能未知,还需在以后的研究中进行进一步的功能注释。     

变异链球菌UA159细胞壁蛋白的预测和功能分析

[目的]对变异链球菌UA159细胞壁蛋白进行预测和功能分析,为后续研究该菌致病机制奠定基础。[方法]用Phobius和Signal P 4.0软件预测变异链球菌UA159的细胞壁蛋白,并采用COG功能数据库对细胞壁蛋白进行功能注释。[结果]变异链球菌UA159共含有22个细胞壁蛋白,其中含有LPx TG锚定基序的有12个,含有Lys M基序的有3个,含有CW基序的有5个,含有GW基序的有1个,含有PG锚定基序的有1个。功能分析结果显示,22个细胞壁蛋白中有18个蛋白没有具体的功能注释,4个蛋白有具体的功能注释,其中beta-lactamase与防御机制功能有关;exo-beta-D-fructosidase与碳水化合物代谢与转运有关;分子伴侣蛋白ATP-dependent protease Clp E与蛋白质翻译后修饰和蛋白质折叠有关;cell wall-associated protein Wap A与细胞壁和细胞膜的生物合成有关。[结论]变异链球菌UA159全基因组大多数的细胞壁蛋白功能未知,需在以后研究中进行进一步的功能注释。     

梅果采后软化与细胞壁组分及其降解酶活性的变化

 研究了青梅果实硬度和细胞壁组分及其降解酶活性变化。结果表明 ,采收 3d后果肉硬度开始急剧下降 ,5～ 7d下降最快 ,平均日下降 38.1% ,之后呈缓慢下降趋势。贮藏期间 ,碳酸钠可溶果胶 (SSP)和 4mol·L-1KOH可溶组分含量持续下降 ,与果肉硬度变化呈极显著正相关 (r分别为 0 .9887和 0 .8831) ,1mol·L-1KOH可溶组分含量持续上升 ,与硬度变化呈极显著负相关 (r =- 0 .7938) ,而螯合剂可溶果胶 (CSP)和 4mol·L-1KOH不溶组分含量变化缓慢。果胶甲酯酶 (PME)和 β 半乳糖苷酶活性分别在采后第 3、5天达最高值 ,而多聚半乳糖醛酸酶(PG)和羧甲基纤维素酶 (Cx)活性均在第 7天达最高值。相关性分析表明 ,β 半乳糖苷酶和PG活性可能是导致梅果水溶性果胶 (WSP)含量上升的主要原因 ,而Cx活性则可能引起难溶性的半纤维素 (4mol·L-1KOH可溶组分 )向易溶性的半纤维素 (1mol·L-1KOH可溶组分 )转化 ,从而导致了青梅果肉硬度的迅速下降。