棉花nodulin-like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA 5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18(Gossypium arboreum L.Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列.结果表明,该基因全长为2 353 bp,具有5个内含子和6个外显子.cDNA全长1480 bp,含有一个1125 bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733 bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性.Nodulin-like基因的启动子全长1 969 bp,启动子区域具有Initiator、TATA box、CAAT-like box和富含AT序列等启动子特征序列.Southern blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝.Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达.本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉"前期抗虫性强、后期抗虫性弱"这一生产实际问题提供有效的表达调控元件.     

棉花nodulin—like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA　5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18　(Gossypium　arboreum　L.　Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长为2　353　bp,具有5个内含子和6个外显子。cDNA全长1　480　bp,含有一个1　125　bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank　nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733　bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性。Nodulin-like基因的启动子全长1　969　bp,启动子区域具有Initiator、TATA　box、CAAT-like　box和富含AT序列等启动子特征序列。Southern　blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝。Northern　blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉“前期抗虫性强、后期抗虫性弱”这一生产实际问题提供有效的表达调控元件。     

剪接因子1N端1-320氨基酸片段的原核表达及纯化

目的:通过扩增剪接因子1(SF1)的N端1-320氨基酸(aa)片段对应的cDNA,构建His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),在大肠杆菌中诱导表达并进行亲和纯化。方法:PCR扩增SF1的1-320 aa片段对应的cDNA,扩增产物和载体pET-28a(+)经酶切回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,挑取克隆、酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和West-ern印迹分析蛋白表达情况,亲和纯化His-SF1(1-320aa)。结果:SF1片段以正确的读框插入pET-28a(+),IPTG可以诱导大肠杆菌表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western印迹证实得到相对分子质量约为40×103的蛋白,亲和纯化得到高纯度蛋白质。结论:构建了His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),并获得His-SF1(1-320aa)融合蛋白,为进一步研究SF1和U2AF65之间的相互作用及对剪接体形成的影响提供了基础。     

棉花LIM结构域基因(GhLIM1)的克隆和表达分析

LIM结构域蛋白是一个重要的发育调控因子,参与基因转录,细胞骨架建成和信号传导等许多发育调控过程,胞质骨架是形成和稳定细胞形态以及传递物质,能量和信息的重要成分。为研究棉花纤维细胞发育过程中胞质骨架的形成和作用机理,通过棉花纤维EST序列整合,从陆地棉徐州142胚珠（含纤维）中扩增并克隆出棉花LIM结构域基因的编码区段。该棉花LIM结构域基因（GhL1M1)长848bp,包含一个570bp的开放阅读框,推导的氨基酸序列（189个氨基酸）与拟南芥,烟草和向日葵的LIM结构域蛋白有极高的同源性,而且两个LIM结构域完整,RT-PCR和Northerm杂交分析表明,该基因（GhL1M1）在陆地棉的根,茎尖,上胚轴,叶片,花蕾,花药,胚珠和不同发育时期的陆地棉纤维（4DPA、12DPA、18DPA）以及海岛棉纤维（18DPA）和中棉纤维（12DPA）中均有表达,但GhL1M1基因在茎尖,纤维和有纤维的胚珠中表达量更高,因此GhL1M1基因应与棉花纤维发育有密切关系。     

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .     

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .     

棉花MADS-box蛋白基因(GhMADS-13)的克隆和表达分析

一组具有MADS-box结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重要作,以中棉所36(CCRI)均一化全长cDNA文库为基础,结合EST测序分析,分离获得一个棉花的MADS-box基因全长cDNA.该基因cDNA全长1 079 bp,包含一个732 bp的完整的开放阅读框,编码234个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域和完整的K区,命名为GhMADS-13(GenBank:FJ409870).与拟南芥、葡萄等植物的AGL6类基因具有高度的同源性.实时定量RT-PCR分析表明,GhMADS-13在CCR136的花器官发育中早期表达量逐步增加,后期有下降趋势.推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用.     

几个棉花核不育抗虫杂交种(F1)的抗虫性及经济性状分析

用两个不抗虫和一个抗虫的核不育系为母本,用抗虫品系为父本,配制3个杂交组合(GA×HB、GA5×R27、GA18×HB),研究分析杂交种的抗虫性、产量性状和纤维品质.结果表明3个杂交组合均高抗棉红铃虫,GA5×R27和GA18×HB以及GA×HB分别抗、中抗棉铃虫;3个组合的产量和纤维品质均优于对照.用核不育系作母本,特别是用抗虫核不育系作母本生产抗虫杂种,比用人工去雄生产杂种种子成本低,且有较好的抗虫性和丰产性,因而在棉花生产上具有更加广阔的应用前景.     

小鼠核因子κB受体活化因子配基活性区的克隆、表达及生物活性分析

核因子κB受体活化因子配基是诱导破骨细胞分化、成熟的关键因子,在生物医学研究中应用广泛。本实验以小鼠的骨髓细胞cDNA为模板,采用PCR技术获得小鼠核因子κB受体活化因子配基活性区基因,并将该基因克隆至His标签的融合蛋白表达载体pET28a(+),经鉴定正确的质粒转化至BL21表达菌株中。通过调节诱导目的蛋白表达的培养温度、IPTG浓度及诱导时间,筛选出重组融合蛋白表达的最佳条件。将纯化后的重组蛋白稀释成不同浓度,刺激小鼠破骨前体细胞Raw264.7细胞分化,经抗酒石酸酸性磷酸酶染色后可见破骨细胞的形成,表明该重组蛋白具有较好的生物活性,可替代商品化的鼠源核因子κB受体活化因子配基。     

甜叶悬钩子(Rubus suavissimus S.Lee)中UDP-糖基转移酶基因的克隆、表达及序列分析

糖基化是植物次生代谢产物生物合成中重要的修饰反应。目前已报道的以二萜为底物的UDP-糖基转移酶(UGT)数量稀少。本研究基于甜叶悬钩子叶片的转录组数据,利用生物信息学分析手段,选定可能具有二萜类催化活性的UDP-糖基转移酶基因进行克隆。最终克隆得到18条UGT基因序列,在大肠杆菌中进行了异源表达,并对克隆的基因进行了初步的序列分析。本研究为进一步挖掘和验证甜叶悬钩子中UGT的功能奠定了基础。     

番茄MADS-box基因Lemads1的可变剪接与表达模式分析

可变剪接(alternative splicing) 是真核基因转录的普遍现象和重要调控方式,在生物体的各种生理过程中发挥着重要的作用。植物转录因子MADS box基因在植物生长发育中发挥重要作用。番茄(Solanum lycopersicum L.) SEPALLATA (SEP) 亚族基因Lemads1是1个在番茄果实成熟过程中具有关键作用的MADS box家族成员,但至今尚未见其转录剪接模式的详细报道。本研究发现,Lemads1基因在转录时存在可变剪接现象,并检测到4种Lemads1可变剪接转录本,其扩增长度依次为：699 bp、741 bp、1 404 bp和1 539 bp。剪接方式有外显子选择性切除和内含子保留两种。这4种转录本编码长度为232 aa、246 aa和266 aa的3种蛋白质。氨基酸序列比对和系统进化分析结果表明,这3种蛋白序列的差异主要集中在C区,但并不影响它们的系统进化地位。在进化上,它们仍属于SEP亚家族LOFSEP亚支中的FBP9/23分支,与它们亲缘关系最近的番茄SEP类蛋白是SLMBP21。Lemads1反义RNA转基因植株表型观察结果表明,该基因可能参与番茄果实成熟和萼片发育过程;而组织特异性表达分析表明,该基因的4种转录本具有相似但并不完全相同的表达模式,它们都在萼片和果实中高表达,但在这2个组织发育过程中的表达变化却有明显差异。暗示这些可变剪接转录本在萼片和果实发育过程中扮演了不同的角色。本研究提供了番茄Lemads1基因存在可变剪切的重要信息,对该基因功能的深度发掘具有指导意义。     

选择性剪接在低氧应答中的调控作用

细胞为适应低氧环境,其相关基因的表达方式发生了改变,其中选择性剪接在低氧应答调控过程中起到了重要的作用。低氧诱导因子介导的低氧应答信号通路在机体适应低氧环境过程中起到了十分重要的作用,低氧诱导因子剪接体通过此通路调控红细胞生成、血管生成、糖酵解等过程。而抑制性PAS蛋白质、脯氨酸羟化酶、促血管生长因子、芳香羟受体核转运蛋白剪接体则通过其它通路进行调控。选择性剪接不仅在低氧应答中起重要作用,而且与阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、癌症等常见人类疾病相关。     

基因选择性剪接的生物信息学研究概况

基因选择性剪接现象是真核生物基本而又重要的调控机制。由于基因的选择性剪接在形成生物复杂性和多样性上具有极其重要的作用,同时选择性剪接与许多人类疾病也密切相关。因此,研究基因选择性剪接是一项十分重要的工作。生物信息学作为一门新兴的学科在研究基因选择性剪接上起关键的作用,尤其在研究基因表达调控机制、选择性剪接基因预测以及选择性剪接基因进化上。本文综述了这方面的最新研究进展,为更深入了解真核生物基因的表达调控机理提供依据。     

拟南芥SDIR1基因转录的选择性剪接

采用PCR及RT-PCR法分别克隆了拟南芥SDIR1基因的DNA和cDNA序列。根据序列比对分析结果,发现了3种不同的转录本,提示SDIR1基因的转录中存在选择性剪接。3种转录本的长度分别为822bp、691bp和666bp,依次命名为：SDIR1-822、SDIR1-691、SDIR1-666。与SDIR1基因的DNA序列及已报道的SDIR1cDNA序列比较,除转录本SDIR1-822包含了完整的编码序列外,其余2种转录本的编码序列都存在不同长度的缺失。其中,SDIR1-691缺失了131bp的片段：第2外显子3′端缺失33bp,第3外显子53bp全部缺失,第4外显子5′端缺失45bp;转录本SDIR1-666缺失了156bp的片段：第3外显子3′端缺失18bp,第4外显子5′端缺失138bp。进而随机挑取101个克隆子对三种转录本的表达比例进行初步分析,结果表明3种分子的比值为SDIR1-822：SDIR1-691：SDIR1-666=26.00：1.33：1.00,反映出SDIR1基因不同转录本在拟南芥中的相对表达量。     

植物MAPK信号转导组分的细胞定位与选择性剪接

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径在真核生物中是高度保守的,由MAPKs,MAPKKs,MAPKKKs组成,通过MAPKKK→MAPKK→MAPK逐级磷酸化传递细胞信号.已有大量研究表明,MAPK在植物响应生物与非生物胁迫,以及植物激素和细胞周期的信号转导中起重要作用.在植物响应各种逆境过程中激活的MAPK基因,细胞内的定位发生动态变化.选择性剪接是真核生物中调节基因表达的重要模式,能够影响蛋白的结合特性、胞内定位、酶的活性、蛋白的稳定性和翻译后的修饰.MAPK基因的选择性剪接能产生不同的转录异型并具有不同的亚细胞定位.本文综述这方面的研究进展.     

人受精促进肽受体基因（TCP11b）的剪接、克隆和差别表达

运用同源比较和PCR法 ,从人睾丸组织中分离了人受精促进肽受体TCP11基因的一个新的剪切体TCP11b ,它编码 5 0 3个氨基酸的蛋白质 ,与TCP11a相比 ,在基因组的 5′端存在复杂的外显子剪接现象。运用荧光原位杂交 (FISH)方法 ,显示该基因定位到人染色体 6p2 1。Northern杂交及多组织RT PCR的结果显示该转录本在正常睾丸中表达 ,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因的表达。该结果结合mTcp 11功能的提示 ,TCP11b这种转录本对精子发生和人受精过程可能起重要作用。     

可变剪切在植物成花转换中的作用

精确调控成花转换,确保植物在适宜环境下开花,对于植物的成功繁殖和物种繁衍至关重要。开花由多种分子机制在转录、转录后和蛋白质水平进行调控。可变剪切(AS)是一种普遍的转录后水平调控过程,可从单个基因产生多个转录本,从而丰富转录组和蛋白质组的多样性。大量研究表明,可变剪切在成花转换过程中发挥重要作用。根据发育和环境条件, AS能够影响mRNA的稳定性和/或蛋白亚型的功能,从而调控开花相关基因的功能转录本和/或功能蛋白水平。揭示成花相关pre-mRNA的AS作用将进一步增进人们对开花相关基因功能以及整个成花转换调控网络的认识。该文归纳了涉及成花转换的AS研究进展,并针对各个调控途径进行总结,以期为进一步研究植物AS和成花转换调控机制提供参考。