多位点PCR技术用于四川267株分枝杆菌临床分离株的鉴定

目的 初步了解四川省肺结核患者分枝杆菌菌种类型。 方法 收集267株分枝杆菌临床菌株,经PNB/TCH鉴别培养基进行培养鉴定后,采用聚合酶链反应(PCR)对16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120 基因位点进行扩增,鉴定至种,再经PRA-rpoB、hsp65基因测序进行验证。 结果 267株分枝杆菌临床分离株多位点PCR结果显示结核分枝杆菌262株,非洲分枝杆菌Ⅰ型3株,非结核分枝杆菌2株。PNB/TCH鉴别培养基培养鉴定结果为结核分枝杆菌复合群266株,非结核分枝杆菌1株。2株非结核分枝杆菌分别为鸟分枝杆菌(M. avium)和脓毒分枝杆菌(M. septicum)。多位点PCR结果与rpoB-PRA、hsp65基因测序结果一致。 结论 多位点PCR技术鉴定分枝杆菌菌种结果准确可靠,且具有简便和快速等优点,有较大的分子流行病学应用价值,且对于临床诊断和治疗都具有重要意义。     

实时荧光PCR分子信标检测耐利福平结核分枝杆菌印rpoB基因

目的 应用实时荧光PCR分子信标技术,建立快速检测临床标本中结核分枝杆菌利福平rpoB相关耐药突变点方法,探讨其缩短耐药实验报告时间的临床应用价值.方法 以分枝杆菌药物敏感性实验绝对浓度法为标准,12株非结核分枝杆菌、4株非分枝杆菌作对照,对174例结核患者临床分离株应用实时荧光PCR分子信标方法,检测利福平rpoB核心区域的耐药突变点并将结果与直接测序进行比较.结果 (1)实时荧光PCR分子信标方法:82例结核分枝杆菌利福平敏感菌株中,3例发生rpoB基因突变,特异度为96.3%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,82例检出耐药突变,敏感度为89.1%;准确性为92.5%.(2)DNA直接测序分析:82例结核分枝杆菌利福平敏感株中,1例发生rpoB基因突变,特异度为98.8%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,83例发生:rpoB基因突变,敏感度为90.2%;准确性为94.2%.检测174株结核分枝杆菌临床分离菌株,与实时荧光PCR分子信标方法检测一致性为98.3%(171/174).结论 实时荧光PCR分子信标方法检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变点可作为结核患者快速耐药检测的初筛方法之一.     

荧光定量PCR仪在检测结核菌方面的作用

从痰等临床标本直接诊断结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌也称直接扩增试验(Direct Amplification test,DAT),主要是利用PCR技术特异性地扩增核酸片断达到鉴定结核分枝杆菌的目的.     

PCR-SSCP快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株的研究

目的：应用分子生物学方法快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株。方法：通过设计两对引物分别扩增16S rDNA两条片段，根据SSCP电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性鉴别结核、非结核分枝杆菌。结果：98株临床分离株中，经细胞学鉴定93株为结核分枝杆菌复合群，5株非结核分枝杆菌。用引物I、Ⅱ对结核分枝杆菌复合群进行PCR－SSCP析，有81株与标准株有相似图谱。用引物Ⅲ、Ⅳ对非结核分枝杆菌进行PCR－SSCP分析，均显示出与结核分枝杆菌标准株不同的电泳图谱。结论：PCR－SSCP可快速鉴别结核、非结核分枝杆菌。     

分枝杆菌的分子诊断

结核病仍然是世界范围的主要传染病 ,由于致病菌结核分支杆菌生长速度缓慢 ,结核杆菌和其他的临床上重要的分枝杆菌的分离、鉴定和药物敏感试验需要几个星期或更长的时间。近年来 ,多种分子诊断方法已用于分枝杆菌的直接检测 ,菌种鉴定和药物敏感实验 ,极大缩短了诊断时间。两种核酸扩增方法改良型结核分支杆菌直接试验和Amplicor结核分枝杆菌试验已经获得FDA批准用于临床标本结核分枝杆菌的检测。PCR测序和DNA探针作为多数分枝杆菌的菌种鉴定的常规手段。高通量的寡核苷酸阵列已用于分枝杆菌利福平耐药基因突变的检测和菌种的鉴定     

2011-2018年四川省自贡市分枝杆菌临床分离株鉴定分析

目的了解自贡市肺部感染分枝杆菌的菌种菌型特征,为临床分枝杆菌病的诊断和治疗及制定有效防控策略提供科学依据。方法收集2011－2018年临床疑似结核病患者分离到的抗酸染色阳性培养物,经对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸肼（TCH）鉴别培养和多位点PCR鉴定为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌（NTM）,再经rpoB和hsp65序列分析对NTM进行种的鉴定。结果2 751株分枝杆菌临床分离株经PNB/TCH鉴别培养基和多位点PCR鉴定,结核分枝杆菌2 647株,占96.22%,非洲分枝杆菌Ⅰ型32株,占1.16%,NTM 72株,占2.62%。 72株NTM鉴定出11个种。结论自贡市分枝杆菌肺部感染主要为结核分枝杆菌所致,感染致病的NTM种类较多,以脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌为主。 外来分枝杆菌和奥巴涅分枝杆菌在国内为首次报道。     

基于DPO的四重荧光PCR检测常见分枝杆菌方法的建立与应用

目的 利用多重荧光PCR技术,建立一种快速、准确、特异的检测常见分枝杆菌的方法.方法 以分枝杆菌16S rRNA作为检测靶基因,设计双启动寡核苷酸(DPO)引物和TaqMan探针,探针的5’端分别用FAM 、ROX、HEX和JOE进行荧光标记,3’端标记淬灭荧光.通过对4种分枝杆菌标准株基因组DNA的扩增,评价多重荧光PCR方法的特异性和灵敏度.采用建立的多重荧光PCR方法,采用该方法检测2010年6至12月杭州市红十字会医院68例结核科住院患者清晨痰液标本,结果与细菌培养和抗酸染色镜检进行比较.采用x2检验比较3种方法的阳性率.结果 该方法可准确、特异地鉴定结核分枝杆菌和3种常见非结核分枝杆菌,检测灵敏度均为1 ×101 cfu/ml.对68份痰液标本进行检测,结果显示31份检测结果阳性,阳性率45.6％,明显高于涂片染色镜检(阳性率14.7％),差异具有统计学意义(x2=15.4,P ＜0.05),其中28例为结核分枝杆菌,1例为鸟分枝杆菌,2例为胞内分枝杆菌,与细菌培养鉴定方法一致.1例培养阳性而PCR检测结果阴性标本经16SrRNA扩增测序鉴定为龟分枝杆菌.结论 本研究建立的多重荧光PCR方法敏感、特异、快速,能有效检测结核分枝杆菌和常见非结核分枝杆菌,可用于分枝杆菌感染者的实验室快速诊断.     

分枝杆菌的分子诊断

结核病仍然是世界范围的主要传染病，由于致病菌结核分支杆菌生长速度缓慢，结核杆菌和其他的临床上重要的分枝杆菌的分离，鉴定和药物敏感试验需要几个星期或更长的时间，近年来，多种分子诊断方法已用于分枝杆菌的直接检测，菌种鉴定和药物敏感实验，极大缩短了诊断时间，两种核酸扩增方法改良型结核分支杆菌直接试验和Amplicor结核分枝杆菌试验已经获得FDA批准用于临床标本结核分枝杆菌的检测，PCR测序和DNA探针作为多数分枝杆菌的菌种鉴定的常规手段。高通量的寡核苷酸阵列已用于分枝杆菌利福平耐药基因突变的检测和菌种的鉴定。     

应用膜芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种

目的：利用膜芯片技术建立一种快速、简便的分枝杆菌分子菌种鉴定方法。方法：以DNA直接测序法为对照，通过PCR．SSCP和膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和199株分枝杆菌临床分离株的菌种。结果：应用膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株和7种非分枝杆菌菌株，特异性100％。199株分枝杆菌临床分离株中，经16S rRNA PCR-SSCP初步菌种鉴定，30株为结核分枝杆菌复合群，应用膜芯片分析，显示与分枝杆菌属探针分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群探针a杂交阳性，两种鉴定方法结果一致：169株PCR．SSCP初步鉴定为非结核分枝杆菌的分离株，经芯片分析，58株为龟分枝杆菌，46株为胞内分枝杆菌，33株为堪萨斯、瘰疬、胃和猿猴分枝杆菌复合群，6株为偶然分枝杆菌，15株为戈登分枝杆菌，3株为乌分枝杆菌，2株为海和溃疡分枝杆菌复合群，另6株只与探针分枝杆菌杂交，经测序显示2株为胞内分枝杆菌，但其基因序列与标准菌株不完全相同，1株为土分枝杆菌，1株为迪氏分枝杆菌，1株为草分枝杆菌，1株为新金色分枝杆菌，芯片上无鉴定该菌种的探针。结论：应用膜芯片技术可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种，指导临床合理治疗。     

分子杂交法快速鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步评价

目的评价结核分枝杆菌鉴定试剂盒(分子杂交法)进行分枝杆菌菌种初筛的准确性,并探讨如何快速准确地鉴定结核分枝杆菌复合群(MTC)和非结核分枝杆菌(NTM)混合感染标本。方法采用分子杂交法对200株结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定。人工制备结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌、结核分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、结核分枝杆菌和偶发分枝杆菌的混合感染模型,评价基因测序法、芯片法和Hain test在检测分枝杆菌混合感染中的准确性。结果以对硝基苯甲酸(PNB)分离鉴定结果为参照,分子杂交法的敏感性和特异性分别为65.12%(65/86)和98.25%(112/114)。对于人工制备的13种不同比例混合的H37Rv和NTM,芯片法和Hain test均可以准确鉴定出混合感染标本中的混合菌种,而基因测序结果表明,H37Rv:偶发分枝杆菌的比例在10%~90%范围内才能区分出混合感染的类型。结论分子杂交法对于结核分枝杆菌诊断有较高的特异性,一旦经该法鉴定为NTM,则具有很高的诊断意义。明确标本中存在混合感染后可以采用芯片法或Hain test对临床上高致病的分枝杆菌进行菌种水平的鉴定。