吉非替尼和靶向表皮生长因子受体小干扰RNA治疗前列腺癌

目的 观察吉非替尼(Gefitinib)和靶向表皮生长因子受体(EGFR)小干扰RNA(siRNA)体内外抑制前列腺癌的效果并探讨其作用机制.方法 前列腺癌细胞PC-3转染慢病毒为载体的EGFR siRNA或Gefitinib(0～10 ms/L)处理后,噻唑蓝(iT)比色法检测细胞生长抑制率,荧光聚合酶链反应(PCR)检测EGFR mRNA表达,Western blot检测EGFR、丝氨酸蛋白激酶(Akt)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶c(PKC)表达.体内观察EGFR siRNA和Gefitinib单独或联合抑瘤效果.结果 EGFR siRNA对PC-3细胞转染率达85%,细胞生长抑制率为40%～50%,而Gefitinib细胞生长抑制率呈浓度.时间依赖性.EGFR siRNA对PC-3细胞EGFR mRNA和蛋白表达抑制率＞90%,明显高于Gefitinib的＜80%(P＜0.01);EGFR siRNA显著抑制Akt和MAPK表达,而Gefifimb仅明显抑制Akt表达.Gefitnib单独和联合EGFR siRNA的抑瘤率分别为53.95%和59.28%,明显高于EGFR siRNA组的34.83%(P＜0.05).结论 EGFR通路抑制剂能有效抑制前列腺癌生长,其机制主要通过阻断EGFR及其胞内蛋白Akt的表达来实现.     

短发卡状RNA特异性抑制表皮生长因子受体对大肠癌细胞凋亡的影响

目的体外构建编码人类表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞EGFR的特异性抑制作用以及对细胞凋亡的影响。方法体外合成EGFR的DNA模板引物和Pgenesil-1质粒构建编码shRNA的表达载体。应用脂质体Lipofectamine2000转染人结肠癌LoVo细胞,转染成功后以G418筛选4周,实时荧光定量RT-PCR(realtime RT-PCR)和Western-blot检测EGFR的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果成功的构建了针对EGFR的质粒表达载体。质粒载体成功转染后,EGFR mRNA表达下降了(81.3±2.8)%,蛋白表达下降了(73.4±2.3)%,细胞凋亡增加了(10.1±0.4)%,和对照质粒载体比较差异有统计学意义。结论我们构建的针对EGFR的质粒表达载体可以显著抑制其在人结肠癌LoVo细胞的表达,诱导细胞凋亡,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。     

小干扰RNA抑制雄激素受体基因表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制雄激素受体(AR)基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响.方法 化学合成针对AR的siRNA,用脂质体转染T24细胞.采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测AR mRNA和蛋白的变化.转染细胞48 h后用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖活性的变化,流式细胞术检测细胞的凋亡状况.结果 成功的转染T24细胞,实时荧光定量RT-PCR筛选出一条AR mRNA抑制效率最高的siRNA,行Western blot检测可抑制AR蛋白表达至70.3%.转染细胞48 h后,T24细胞增殖活性抑制率达到(25.9±5.4)%,细胞凋亡率达到21.61%.结论 应用siRNA干扰技术能有效的抑制AR基因的表达,同时可抑制人膀胱癌T24细胞的体外增殖活性及促进其凋亡的发生.     

转化生长因子—α表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人大肠癌细胞增殖的

目的 探讨转化生长因子－α（ＴＧＦ－α）、表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）反义寡脱氧核苷酸（ＡＳＯＤＮ）对人大肠癌细胞株ＨＲ８３４８的作用。方法 将ＴＧＦ－α、ＥＧＦＲ反义寡核苷酸经脂质体包裹后转染人大肠癌细胞（浓度均为１０ｕｍｏｌ／Ｌ）。采用四唑蓝比色法（ＭＴＴ法）、细胞周期分析、裸鼠体内接种等方法测定瘤细胞体内外增殖的变化。结果 ＴＧＦ－α反义ＯＤＮ、ＥＧＦＲ反义ＯＤＮ均可明显抑制ＨＲ８３４８的增殖（抑制率分别为８０．０％、８２．５％），并使裸鼠体内成瘤率下降（均为２０．０％；对照组为１００．０％）。Ｇ０／Ｇ１期细胞数明显增多（分别为６３．９％、６７．１％；对照组为３１．１％），Ｓ期细胞数相应减少（分别为３５．６％、３２．６％；对照组为５３．９％）。结论 ＴＧＦ－α反义ＯＤＮ、ＥＧＦＲ反义ＯＤＮ均能有效抑制大肠     

小分子干扰RNA降低蛋白激酶Cι表达抑制HeLa细胞增殖

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默蛋白激酶Cι (PKCι)表达对HeLa增殖与凋亡的影响.方法 实验分为转染组、阴性对照和空白对照组.将PKCι基因的siRNA转染HeLa细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测3组细胞第1～5天的吸光度;培养细胞于第21天计数细胞克隆数;流式细胞仪检测沉默PKCι基因72h的细胞凋亡及细胞周期分布.结果 转染组细胞增殖率低于两个对照组.转染组的平板集落形成率(64.00±4.54)%低于阴性(87.00±1.22)%和空白组(82.00±2.10)%(P<0.05).转染组细胞凋亡率(9.54±0.55)%明显高于阴性对照组(1.31±0.10)%和空白对照组(2.75±0.24)%.瞬时转染PKCι siRNA 72h后,G1期细胞增多,G2+S期细胞减少.结论 沉默PKCι可抑制宫颈癌细胞增殖,促进细胞凋亡.

Abstract：

Objective To explore the effect of RNA interference (RNAi) targeting protein kinase C iota (PKCι) on proliferation and apoptosis of cervical carcinoma cell line HeLa. Methods Stable cell lines which were transfected with PKCι shRNA or vector-mock plasmids were established. The cell lines, psi-PKCiota-HeLa, psi-mock-HeLa and HeLa, were used to detect methyl thiazol tetrazolium (MTT) absorbance at 1st-5th day. The cells were cultured in 6-well plates and stained by crystal violent at 21st day, and the stained cells colonies were counted. Flow cytometry was used to detect apoptosis and cell cycle distribution after HeLa cells were transiently transfected with PKC iota shRNA at 72nd h. Results Compared with the psi-mock and blank controls, the transfected cells stably expressing PKCι shRNA showed markedly decrease of proliferation assayed by MTT and plate colony formation. The apoptosis rate of cells transiently transfected with PKCι shRNA (9.54±0.55)% was higher than that of cells transiently transfected with psi-mock (1.31±0.10)% or HeLa blank control cells (2.75±0.24)% (P<0.05). The cells transiently transfected by PKCι shRNA were arrested in G0/G1 phase. Conclusion PKCι is essential for maintaining of HeLa cell proliferation. Silencing PKCι can inhibit the growth of HeLa cells and induce apoptosis.     

双位点小干扰RNA靶向抑制表皮生长因子受体促大肠癌细胞凋亡和5-氟尿嘧啶化疗增效的实验研究

目的观察针对单位点与双位点的RNA干扰技术抑制大肠癌LoVo细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达,诱导细胞凋亡以及对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的差异。方法构建质粒表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2,脂质体转染人大肠癌LoVo细胞,G418筛选4周,分5组:1组为LoVo细胞,2组为对照质粒载体HK,3组为pU6-EGFR-shRNA-1,4组为pU6-EGFR-shRNA-2,5组为pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2各半量。实时荧光定量PCR和Westernblot检测mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,细胞増殖分析试剂CCK-8(CellCountingKit-8)测定5-FU不同浓度和时间对LoVo细胞的抑制率和半数抑制浓度(IC50)。结果正确构建了短发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体,成功转染;3、4、5组mRNA表达分别下降了(80·2±3·4)%、(81·3±2·8)%和(90·6±2·8)%,蛋白表达分别下降了(74·1±4·0)%、(73·4±2·3)%和(90·4±3·3)%,凋亡率增加了(10·4±0·5)%、(10·1±0·4)%和(14·2±0·5)%,同时对5-FU的IC50和细胞抑制率作统计学分析,5组,3、4组和1、2组三者之间比较差异有统计学意义,而1组2组间、3组4组间各项比较差异无统计学意义。结论两条shRNA均可有效抑制LoVo细胞EGFR表达,促进细胞凋亡,提高5-FU对癌细胞的杀伤作用,靶向联合位点的RNA干扰技术较单一位点的干扰效果更显著,为大肠癌的基因治疗联合化疗提供了新的思路。     

小分子RNA干扰同时沉默表皮生长因子受体和胰岛素样生长因子-1受体基因对肝癌细胞周期和凋亡的影响

目的 观察小分子RNA干扰(riRNA)同时沉默表皮生长因子受体(EGFR)和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)基因对肝癌细胞周期和凋亡的影响.方法 构建真核表达载体,转染质粒48 h后通过流式细胞仪、噻唑蓝(MTT)检测细胞周期、凋亡、增殖变化以及Western blot检测CDK1、CDK2和p53蛋白的表达.结果 转染48 h后双基因干扰组吸光度为0.2,G0/G1和G2/M期细胞比例分别为72.70±0.26和7.38±0.06,凋亡率为17％,CDK1、CDK2蛋白的表达降低,与对照组和单基因干扰组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 同时沉默EGFR和IGF1R基因能有效干扰肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡,并使肝癌细胞阻滞于G0/G1期,干扰多个受体分子可能是一种新的肝癌治疗途经.     

靶向RNA干扰Survivin对结肠癌细胞HT-29增殖凋亡的影响

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒（Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP）介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白表达及对HT-29增殖凋亡的影响。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29（以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照），用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化，用噻唑蓝（MTT）法、吖啶橙／溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE／7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。结果与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较，转染Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP后，HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低，其细胞死亡率和凋亡率显著提高（P〈0．05）。结论Ad-deIE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP介导的RNA干扰较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率，且能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

表皮生长因子受体阻断对前列腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨阻断表皮生长因子受体（EGFR）对前列腺癌（PCa）细胞增殖的影响。方法：人PCa细胞株DU－145，分别加或不加抗EGFR单抗C225（20nmol/L)阻断EGFR体外细胞培养7d，收集细胞、计数以观察对PCa雄激素非依赖增殖的影响，并采用免疫沉淀和Western blot方法，探讨阻断EGFR后不同时相点磷酸化有丝分裂原激活下蛋白激酶MAPK，及p27^kipl的表达变化。结果：阻断EGFR与对照相比较可使DU－145细胞增殖被抑制达35％，8h后磷酸化MAPK的表达水平开始降低，p27^kip1表达开始升高，至24h最明显。结论：阻断EGFR可抑制PCa细胞增殖，可能的机制是MAPK的活性降低，使p27^kip1的表达升高而细胞周期被阻。     

小分子干扰RNA抑制肺癌细胞Survivin表达对凋亡和顺铂耐药性的影响

目的 观察应用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制肺癌A549细胞中Survivin表达对细胞凋亡和顺铂耐药性的影响.方法 设计、合成特异性抑制Survivin表达的siRNA,转染肺癌A549细胞48 h后,检测Survivin基因mRNA表达量以及肺癌细胞凋亡率和对顺铂耐药性变化.结果 A549细胞转染Survivin特异siRNA后,Survivin/β-actin基因mRNA表达比例1.17±0.25下降至0.41±0.18,抑制率65.10%;细胞凋亡率由2.67%上升至32.33%;顺铂半数抑制浓度(ICSO)由6.37 ms/L降低至2.42 ms/L.结论 通过siRNA特异性抑制肺癌A549细胞中Survivin基因表达可增加凋亡,逆转顺铂耐药.     

RNA干扰靶向抑制胃癌细胞血管内皮生长因子C表达的实验研究

目的 构建针对血管内皮生长因子C（VEGF-C）的RNA干扰质粒表达载体pSIH1-H1-copGFP,并评价其转染胃癌细胞后对VEGF-C表达的抑制作用.方法 设计并合成针对VEGF-C基因mRNA序列的3条短发夹RNA及1条阴性对照序列,克隆到pSIH1-H1-copGFP载体,重组构建RNA干扰质粒,并将其转染胃癌细胞（SGC7901）,采用RT-PCR分析转染后VEGF-C基因的表达情况.结果 重组构建pSIH1-H1-copGFP载体经双酶切及插入片断序列分析,表明其成功插入设计位点,并且序列完全一致.3种siRNA质粒表达载体的转染效率均为60%～70%,对VEGF-C mRNA表达的抑制率分别为35.4%、33.8%和81.5%.结论 RNA干扰质粒表达载体介导对VEGF-C基因的RNA干扰可明显抑制胃癌细胞中VEGF-C的表达,可能成为抑制胃癌淋巴管生成的一种有效手段.     

乳腺癌细胞中表皮生长因子对雌激素受体表达的影响及机制

目的研究表皮生长因子（EGF）在雌激素受体（ER）阳性及阴性乳腺癌细胞株中对ER表达的影响及其可能的机制。方法以逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术分别研究EGF途径以及抑制该途径的信号传导后，对乳腺癌细胞株中ERcxmRNA的影响。结果在ER阳性乳腺癌细胞株中，EGF能显著抑制ERα mRNA的表达（P〈0．05），而通过抑制表皮生长因子受体（EG-FR）、磷脂酰肌醇3激酶（P13K）阻断EGF信号传导可减弱上述抑制作用（P〈0．05）；在ER阴性乳腺癌细胞株中，ERα mRNA无显著变化。结论EGF能够明显抑制ER阳性乳腺癌细胞株中ER的表达，这种抑制作用可能通过EGFR、蛋白激酶B（PKB，又称AKt）信号传导途径完成；这种作用在ER阴性乳腺癌细胞株中并不明显。     

核糖核酸干扰抑制生存素表达诱导小鼠结肠癌细胞凋亡

目的筛选强效抑制生存素Survivin基因表达的小干扰核糖核酸(siRNA),探讨Sur- vivin基因抑制对小鼠结肠癌细胞凋亡的影响。方法根据siRNA的设计规则和Survivin序列,设计3段侯选siRNA,聚合酶链反应(PCR)法制备表达框；将siRNA表达框与Survivin-绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因表达质粒(pSurvivin-EGFP)共转染293T细胞,24～48 h后根据荧光强度筛选强效siRNA；再制备其表达质粒转染小鼠结肠癌CT26细胞,应用实时荧光定量(FQ)-聚合酶链反应和蛋白印迹(Western blot)法分析Survivin基因的表达；DNA末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪(FCM)Annexin V/丙化碘锭(PI)双染色法检测细胞凋亡。结果筛选出1段高效抑制Survivin表达的siRNA,可使CT26细胞内Survivin mRNA拷贝数明显减少,抑制率为86．9%；蛋白表达水平亦显著降低；TUNEL检测显示转染48 h后RNA干扰组和对照组凋亡细胞数分别为(60．13±5．71)个和(5．47±0．63)个,两组差异有统计学意义(P＜0．01)；FCM检测转染后1、2、3、4 d凋亡细胞比率分别为2．1%、4．9%、11．7%和32．6%,对照组4个时间点凋亡率均低于1．5%,两组差异有统计学意义(P＜0．01)。结论siRNA能有效抑制小鼠结肠癌CT26细胞内Survivin基因表达并诱导结肠癌细胞凋亡。     

RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的 观察RNA干扰对大肠癌细胞中人端粒酶逆转录酶基因(hTERT gene)的抑制效应.方法 大肠癌细胞株HT-29分为Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组;将靶向于hTERT基因的小干扰RNA,转染大肠癌细胞;分别检测大肠癌细胞转染前后的端粒酶活性,hTERTmRNA和蛋白水平,细胞生长增殖和凋亡情况.结果 sihTERT转染大肠癌细胞效率为60%;sihTERT组的端粒酶活性值、hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞凋亡率分别为0.73±0.14、0.47±0.08、0.37±0.07、49.5%,sihTERT组与其他三组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 靶向于hTERT的siRNA能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因,下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平,降低端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖从而促进大肠癌细胞凋亡.     

慢病毒介导的NOB1基因沉默对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默人NOB1基因对人结肠癌RKO细胞增殖和凋亡的影响。方法设计靶向NOB1基因的小干扰RNA（siRNA）,构建NOB1基因特异性的RNA干扰慢病毒载体,感染RKO细胞,并设置阴性对照组。实时定量PCR和Westemblot分别检测两组细胞NOB1mRNA及蛋白的表达情况;CellomicsArrayScanVTIHCS高内涵分析仪检测感染细胞的增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化：裸鼠成瘤实验检测0NOB1-siRNA对肿瘤的抑制作用。结果NOB1-shRNA慢病毒感染RKO细胞3d后．与阴性对照组比较．NOB1mRNA和蛋白的表达明显降低,克隆形成数减少,而细胞凋亡数增加（均P〈0．05）。裸鼠成瘤实验结果显示,NOB1．shRNA感染组裸鼠移植瘤体积为（405±102）mm3,小于阴性对照组的（870±165）mm3（P〈0．05）。结论通过RNA干扰方式沉默NOB1基因的表达．有望作为抑制结肠癌发展的有效手段。     

表皮生长因子受体在前列腺癌雄激素非依赖型细胞系中表达的意义

目的探讨转化生长因子(TGF)-α和表皮生长因子(EGF)对前列腺癌雄激素非依赖型细胞系中表皮生长因子受体(EGFR)表达的调控作用.方法采用逆转录-多聚酶链式反应和免疫印迹法分别对TGF-α和EGF刺激前列腺癌雄激素非依赖型细胞系PC3、ARCaP后EGFR mRNA表达及其蛋白水平进行定量分析.结果EGF引起PC3、ARCaP的EGFR mRNA升高,分别为5.01±0.45和2.41±0.26,差异无显著性(P＞0.05);TGF-α引起各细胞系EGFR mRNA升高,分别为9.05±0.63和3.54±0.33,差异无显著性(P＞0.05).各细胞系EGFR蛋白水平TGF-α组明显高于EGF组(P＜0.05).结论TGF/EGF-EGFR通路在发生发展中起重要作用;TGFα-EGFR自分泌环在非依赖型前列腺癌中的作用强于EGF-EGFR自分泌环.     

表皮生长因子受体相关蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义

目的 观察表皮生长因子受体相关蛋白(ERRP)的表达以及细胞增殖在胃癌分化和发展中的作用.方法 观察47例患者胃癌的手术标本中ERRP的表达和定位,并将其与良性胃黏膜比较,确定他们与细胞增殖和分化的关系.检测3种不同的胃癌细胞株中ERRP的表达,并用表皮生长因子(EGF)诱导EGFR磷酸化激活MKN-28胃癌细胞,检测ERRP对此效应的作用.结果 与良性胃黏膜(66％标本阳性)比较,胃癌(33％标本阳性)中ERRP的表达显著降低.正常胃黏膜的ERRP染色评分是2.9(0.3),高分化、中度分化和低分化癌的评分分别是2.6(0.6)、0.9(0.6)和1.0(0.5),ERRP表达的降低与恶性程度的组织学分级呈负相关(P＜0.05).ERRP阴性癌细胞[35.3(1.1)％;P＜0.01]中增殖程度是ERRP附性癌细胞[9.4(0.6)％]的3.5倍,ERRP在癌细胞中的表达与细胞增殖也呈负相关.与源于非转移性癌的细胞AGC比较,源于转移性胃癌细胞MKN-28和NCI-N87中ERRP的表达量分别是其的1.7倍和2倍.外源性的ERRP蛋白明显抑制了EGF诱导的胃癌细胞MKN-28中EGFR的磷酸化,抑制程度为45倍.结论 ERRP的下调可能在胃癌分化和发展中起重要的作用.ERRP对肿瘤细胞增殖具有负调控作用,其抑制作用可能部分是通过减弱EGFR的活化来实现的.     

RNA干扰畸胎瘤源性生长因子基因对食管鳞癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰畸胎瘤源性生长因子（PCDGF）基因对食管鳞癌细胞Eca-109的影响.方法 脂质体介导PCDGF-shRNA的表达载体转染Eca-109细胞,应用RT-PCR、Westernblot检测转染后细胞PCDGF mRNA及蛋白的表达情况,分别采用Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒和Boyden小室法检测转染后Eca-109细胞的增殖能力和侵袭能力.结果 转染组PCDGF mRNA和蛋白表达水平均较其他组下调.转染24、48和72 h转染组细胞增殖均受到抑制,抑制率分别为20.4％、21.1％和20.9％,其细胞增殖活性较未转染组、阴性质粒组和脂质体组均明显降低（均 P＜0.05）.未转染组、阴性质粒组、脂质体组和转染组的细胞迁移数分别为118.8±12.0、100.8±9.0、114.3±4.7和 53.5±16.3,转染组与其余3组比较,差异均有统计学意义（P=0.001,P=0.002,P=0.002）.结论 RNA干扰PCDGF基因可抑制食管鳞癌细胞的体外增殖及侵袭能力,PCDGF基因可能成为基因治疗的新靶点.