脱细胞异种角膜基质的制备及细胞相容性

目的用牛角膜制备脱细胞基质,作为组织工程角膜的载体,为细胞提供贴附生长的支持物.方法选取新鲜牛角膜9个,每个分层剥离为2片组织.用0.25%胰蛋白酶,37℃下分为20、40、60min消化,漂洗.每组取样本分别做扫描电镜观察和HE染色观察.其余冻干处理后消毒备用.将消毒后冻干牛角膜基质常规培养基浸泡24 h,取浸提液原液,稀释101、102、103倍培养人成纤维细胞,观察细胞生长情况.将冻干牛角膜基质复水,常规培养基浸泡24 h,以2×l05个/cm2接种兔角膜缘细胞,培养7 d后,标本扫描电镜检查、HE染色观察.结果电镜观察各组牛角膜片表层细胞均被脱去,60min组基质胶原间细胞碎片残留较少,20 min组较多,胶原纤维有序排列以60 min组破坏最大.浸提液的各稀释倍数及原液所培养人成纤维细胞生长良好,各组间差异无显著性.电镜及HE染色观察复合材料培养的兔角膜缘干细胞,均见细胞在材料表面贴附生长,材料部分表面呈多层生长.结论以酶消化法和冻干处理的脱细胞牛角膜基质可以作为细胞的载体在体外与细胞复合培养.     

家猪脱髓核细胞基质的制备及其生物相容性评价

目的:制备家猪脱髓核细胞基质并评价其生物相容性。方法:分离家猪脊柱髓核组织,并逐步经过胰酶、核酶及TritonX-100处理,得到脱髓核细胞基质,DAPI染色观察脱细胞效果及扫描电镜观察脱髓核细胞基质的物理形态特点,将脱髓核细胞基质溶于醋酸,制备成脱细胞基质膜,将大鼠骨髓间充质干细胞接种于基质膜上培养。在第1～5天采用CCK-8检测骨髓间充质干细胞在脱髓核细胞基质膜上的增殖情况,并计算细胞相对增殖率(RGR)来评价其生物相容性。结果:制备出的家猪脱髓核细胞基质肉眼呈白色糜状,DAPI染色发现无细胞残留。扫描电镜下观察发现,脱髓核细胞基质由无序排列的胶原纤维组成。通过CCK-8检测,5 d内细胞毒性分级在0级与2级之间。结论:家猪正常髓核组织能够进行脱细胞处理,且脱细胞后由无序的胶原纤维组成。脱髓核细胞基质具有很好的生物相容性,符合生物工程支架选材标准。     

角膜脱细胞基质的特性研究

目的采用适当的角膜脱细胞方法获得角膜脱细胞基质,并对其进行特性研究。方法采用胰酶-冰冻法对新鲜兔角膜(全层和分层)进行脱细胞处理,再进行组织学检测及生物学特性力学特性、含水率、膨胀率分析。结果用胰酶-冰冻法获得的兔角膜全层和分层脱细胞基质未见细胞成分,细胞外基质的结构未见明显破坏,脱细胞基质在生物力力学特性、含水率、膨胀率上与正常角膜接近,透光率低于新鲜角膜。结论用胰酶-冰冻法获得的脱细胞基质与自然角膜接近,可作为组织工程角膜支架材料和角膜替代物。     

脱细胞基质与颌下腺细胞体外复合培养的实验研究

目的:颌下腺细胞与脱细胞生物衍生支架材料复合培养,观察细胞在支架材料上的生长情况.方法:用传代培养第2代的颌下腺细胞与颌下腺脱细胞基质在体外复合培养,扫描电镜下观察不同时间细胞在支架材料上的生长情况.结果:颌下腺细胞多数附着在支架材料的孔隙内或其边缘,细胞大小不等、形态各异,部分细胞之间分泌基质相互连接,细胞表面凸凹不平、突起丰富、数目不等、长短不一,表面结构似"银耳"状.结论:颌下腺脱细胞基质支架材料具有良好的生物相容性,是一种较为理想的颌下腺组织工程用支架材料.     

以膀胱脱细胞基质为支架材料体内外构建组织工程化尿路上皮

目的:探讨利用组织工程技术体内外构建尿路上皮组织的方法.方法:制备新西兰兔膀胱脱细胞基质材料(bladder acellular matrix graft,BAMG),通过Masson染色和扫描电镜观察材料结构特点.酶消化法获取兔膀胱上皮细胞,体外培养扩增,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,并以免疫组织化学方法进行细胞鉴定.将膀胱上皮细胞与BAMG体外复合培养,HE染色和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况.将体外培养的细胞-材料复合物植入裸鼠体内,分别在4周和8周取材,进行大体观察、组织学以及免疫组织化学方法检测.结果:制备的BAMG呈白色半透明薄膜状,扫描电镜下为纤维网状结构,无细胞残留.体外培养的膀胱上皮细胞呈"铺路石"样外观,抗细胞角蛋白AE1/AE3免疫组化染色胞浆呈棕黄色阳性反应.膀胱上皮细胞接种到BAMG 7 d后,细胞铺满材料的表面,呈单层细胞结构.裸鼠体内植入4周和8周后,细胞-材料复合物形成多层细胞结构,抗细胞角蛋白免疫组化染色呈阳性.结论:采用组织工程技术能够在体内外初步构建尿路上皮组织,这可为进一步进行组织工程泌尿道修复及重建奠定基础.     

异种角膜缘上皮移植治疗碱烧伤动物的实验研究

[目的]观察异种角膜缘上皮早期移植对兔角膜碱烧伤的治疗效果。[方法]用鲤鱼角膜作异种角膜缘上皮移植的角膜来源，对角膜缘碱烧伤的兔动物模型进行异种角膜缘干细胞上皮移植术，观察术后新生血管长入角膜的情况以及基质中的炎症反应。[结果]异种角膜缘上皮移植术后，植片与植床粘附良好，基质中细胞浸润减轻，新生血管长入减少，实验组与对照组之间存在显著差异。[结论]异种角膜缘干细胞上皮移植术治疗角膜碱烧伤可减少角膜新生血管的形成，维持角膜缘的细胞屏障功能。     

肾纤维囊作为载体培养角膜基质细胞的研究

目的 探索以脱细胞的肾纤维囊作为载体培养角膜基质细胞并研究培养角膜基质细胞特性。方法 将培养扩增的兔角膜基质细胞分别接种到培养板和肾纤维囊上进行体外培养,采用倒置显微镜、免疫组化(波形蛋白)和免疫荧光(AO、PI和Hoechst)的方法进行检测,观察兔角膜基质细胞在培养板和肾纤维囊上的生长情况。结果 倒置显微镜和免疫荧光显微镜观察结果显示角膜基质细胞在肾纤维囊上快速贴壁生长并增殖,细胞形态呈多角形树枝状,多次传代后细胞仍维持原有的形态和功能,细胞能长期培养。在培养板上培养的细胞呈长梭形,细胞贴壁生长和增殖情况稍差。在肾纤维囊上的活细胞较在培养板上培养的细胞多。结论 角膜基质细胞在脱细胞的肾纤维囊载体上生长良好,细胞形态结构明显。本研究为角膜基质细胞的体外培养,提供了简单和高效的方法。     

利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

目的 探讨利用犬的间充质干细胞诱导分化种子细胞,以异种脱细胞血管基质为基础体外构建小口径血管移植物.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养的方法从犬骨髓中分离出间充质干细胞并体外培养,诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞;采用非离子型去垢剂和胰蛋白酶去除猪颈动脉血管壁结构细胞,对脱细胞基质进行组织学、力学检测及孔隙率评估.在生物反应器内采用旋转种植的方法将犬骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞种植到脱细胞基质上,体外构建小口径组织工程血管.结果 犬的骨髓间充质干细胞体外能够定向诱导分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,可以作为血管组织工程的种子细胞.经过脱细胞处理后,光镜和电镜观察证实血管壁的细胞成分完全去除.具有良好的孔径和孔隙率.支架在生物力学、孔隙率等方面符合构建组织工程血管支架的要求.在生物反应器内剪切力条件下可以初步构建出组织工程血管.结论 小口径血管移植物可以将间充质干细胞诱导种子细胞,以异种脱细胞血管支架作为基质,在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建.     

脱细胞生物基质组织相容性评价研究

目的研究不同脱细胞生物基质及猪皮的组织相容性.方法将以不同脱细胞生物基质及猪皮注射法植入家兔脊柱旁肌肉内,观察植入后不同时间样品周围组织反应程度,以评价样品对组织的刺激性和相容性.阴性对照用SGBT硅橡胶.结果猪皮、S0.55′、S 0.5 20′和S 0.5 60′四种样品4周时炎细胞反应程度为Ⅱ级,纤维囊腔形成程度为Ⅱ～Ⅳ级.胰酶处理后的样品和SDS处理后的样品4周时炎细胞反应程度为Ⅲ级,纤维囊腔形成程度为Ⅲ～Ⅳ级.结论猪皮、S0.55′、S 0.520′和S 0.560′四种样品短期肌肉植入试验合格.表明其对组织无明显的刺激性,组织相容性良好.胰酶处理后的样品和SDS处理后的样品短期肌肉植入试验不合格表明其对组织有刺激性,组织相容性差.     

灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质的研究

目的 探讨灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质(ACM)支架的可行性.方法 取12周龄的Wistar大鼠的肾脏,保留输尿管、肾静脉及肾动脉,沿肾动脉插入留置针建立灌注通道.灌注压强为100 cmH2O,依次灌注肝素化PBS溶液,1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液,去离子水,1%TdtonX-100溶液以及含青链霉素的PBS溶液.经脱细胞处理后,采用HE染色法光镜观察及扫描电镜观察支架微观结构,DAPI染色法荧光显微镜观察残留细胞核成分.结果 所有经SDS及TritonX-100联合处理后的脱细胞基质支架在HE染色光镜观察下未发现细胞残留,扫描电镜观察仪见基膜及胶原蛋白等细胞外基质形成网状结构而无细胞,DAPI染色荧光显微镜观察未见DAPI与细胞核结合后所发出的强荧光.结论 灌注法用于制备大鼠全肾脏脱细胞基质支架,简便可靠,该支架无细胞成分残留,是一种理想的细胞支架.