三维培养的主动脉平滑肌细胞-胶原凝胶皮下移植的研究

目的 研究经三维培养后的主动脉平滑肌细胞(ASMC)-胶原凝胶移植后,是否仍能产生弹性纤维及宿主的接受状态。方法 将仿真皮替代物三维培养2周的ASMC-胶原凝胶植人大鼠皮下,分别于术后4、7、10、14和28d取材,用HE染色、Gomori醛复红染色、α肌动蛋白免疫组织化学染色和弹性蛋白免疫组织化学染色,观察和检测ASMC-胶原凝胶。结果在移植后第1周有大量的弹性纤维产生,但于28d时完全消失。在移植后的28d内,ASMC-胶原凝胶块周围没有明显的白细胞浸润。结论利用ASMC-胶原凝胶作为一种有弹性的真皮替代物,尚需讲一步的研究。     

小鼠主动脉平滑肌细胞的培养

目的 建立一种小鼠主动脉平滑肌细胞体外培养方法,为相关疾病的研究提供实验材料。方法 采用组织贴块法、胰酶消化法进行细胞原代及传代培养,综合运用自然纯化、机械刮除、差异贴壁法进行细胞纯化,并通过形态学特征及免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果 90％的组织块接种存活,第5代的平滑肌细胞纯度达98％以上。相差显微镜下培养细胞呈典型的“谷峰状”生长,免疫细胞化学染色显示特异的α平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论 本法简便、可靠,培养的平滑肌细胞纯度高、性能好。     

小鼠主动脉发生的观察

应用醛复红ＨＥ染色方法，对胎龄炒９、１１、１３、１５、１７、１９ｄ（新生）的小鼠主动脉的发生过程进行了较系统地观察。结果显示，在９ｄ胎龄的小鼠，其主动脉由一层内皮细胞组成，随着胎龄的增加，动脉壁逐渐增厚，依次出现间充质细胞，平均滑肌细胞和弹性张，而形成具有内、中、外膜结构的主动脉。     

人主动脉平滑肌细胞对淋巴细胞迁移的影响

一、材料和方法1．人主动脉平滑肌细胞条件培养液制备：取4～6个月水囊引产胎儿生动脉，撕去外膜，刮除内膜后用0.2％胶原酶门型，Sigma公司）消化法收集细胞常规培养，取4～6代细胞由典型峰、谷状生长至基本融合时去除原培养液，PBS洗3次，加入不含抗菌素之10％小牛血清培养液（IMDM，GibCoLab出品）继续培养48／小时，收取培养液，1000r／min离心10分钟，取上清液即为平滑肌细胞条件培养液（SMC－CM），-30℃保存。2．淋巴细胞分离：取正常健康人肝素化全血，分离并去除单核细胞，收集淋巴细胞即求激活淋巴细胞。以5×105个细胞／m…     

大鼠远端肺动脉平滑肌细胞分离与原代培养

目的探索简便、高效原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的方法,为研究肺动脉高压发病机制提供实验材料。方法采用显微操作和分次酶消化法进行原代培养并与传统酶消化法比较。对培养的细胞进行形态学观察、平滑肌α-actin免疫荧光细胞化学法鉴定、激光扫描共聚焦显微镜计算纯度。结果两种酶消化法均可获得高纯度的远端肺动脉平滑肌细胞。镜下细胞呈典型的"峰-谷"状生长,胞质特异的α-actin阳性表达,细胞纯度达98%。分次酶消化法获得的细胞数及细胞存活率均大于传统酶消化法,并且提前了3d得到足够进行实验的细胞数量。结论本法简便、可靠、低成本,短期内可获得大量高纯度、功能良好的远端肺动脉平滑肌细胞。     

大鼠远端肺动脉平滑肌细胞分离与原代培养

目的 探索简便、高效原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的方法,为研究肺动脉高压发病机制提供实验材料.方法 采用显微操作和分次酶消化法进行原代培养并与传统酶消化法比较.对培养的细胞进行形态学观察、平滑肌α-actin免疫荧光细胞化学法鉴定、激光扫描共聚焦显微镜计算纯度.结果 两种酶消化法均可获得高纯度的远端肺动脉平滑肌细胞.镜下细胞呈典型的"峰-谷"状生长,胞质特异的α-actin阳性表达,细胞纯度达98%.分次酶消化法获得的细胞数及细胞存活率均大于传统酶消化法,并且提前了3 d得到足够进行实验的细胞数量.结论 本法简便、可靠、低成本,短期内可获得大量高纯度、功能良好的远端肺动脉平滑肌细胞.     

晚期糖化终产物对糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞的影响

目的 探讨血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）在糖尿病早期的改变及其与晚期糖化终产物（ＡＧＥｓ）的关系。方法 应用荧光分光光度法、免疫组织化学、计算机图像分析和透射电镜等技术,研究链脲佐菌素诱导的糖尿病（ＤＭ）大鼠血浆和腹主动脉晚期糖化终产物（ＡＧＥｓ）的含量以及腹主动脉ＶＳＭＣ的变化。结果 从４周起,ＤＭ大鼠血浆和腹主动脉的ＡＧＥｓ显著增多;腹主动脉α－ＳＭ－肌动蛋白的相对面积减小,ＣＳＭＣ的细胞核密度     

S-亚硝基谷胱苷肽对糖基化终产物诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增生的影响

为探讨脂溶性NO前体药物S 亚硝基谷胱苷肽 (S nitrosoglutathione ,GSNO)对糖基化终产物 (advancedglycosyla tionendproducts ,AGEs)诱导的大鼠血管平滑肌细胞增生的影响 ,利用体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞 ,用MTT法、同位素掺入法及细胞计数法测定其增殖率的变化 ,观察不同浓度的AGEs对血管平滑肌细胞的增殖的影响以及不同浓度的GSNO对AGEs作用的预防和逆转作用。MTT法测定的OD值、3 H 胸腺嘧碇核苷 (3 H TDR)掺入量、细胞计数均显示AGEs可以使血管平滑肌细胞数明显高于对照组 (P <0 0 5 ) ;而用GSNO干预后 ,AGEs的上述作用被明显抑制 (P <0 0 5 )。提示NSNO可以抑制AGEs诱导的血管平滑肌细胞的增殖     

人脱细胞羊膜与体外培养大鼠血管平滑肌细胞的生物相容性

目的了解人脱细胞羊膜(HAM)的细胞相容性;观察以HAM为生长载体,复合大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)构筑组织工程膀胱的可能性。方法用物理和酶消化方法处理人羊膜,将大鼠VSMCs与HAM进行体外复合培养,分别进行组织学、相差显微镜和扫描电镜观察。将20只大鼠随机分为两组后行半膀胱切除术,实验组10只行半膀胱切除后用复合大鼠VSMCs的HAM进行修补,另外10只以单纯的HAM修补。分别于术后2、4、8周测定膀胱容量并取膀胱进行组织学观察。结果经物理和酶处理的HAM纯度高,孔隙多,胶原纤维未受损;VSMCs在HAM上可黏附生长,并能长入材料的孔隙内。应用HAM行大鼠膀胱重建术后,实验组与对照组膀胱最大容量(Volmax)比较无显著性差异。组织学观察显示,2周时HAM即已吸收降解,膀胱移行细胞和平滑肌细胞开始形成,炎性反应明显;实验组膀胱平滑肌比对照组厚且规则。4周和8周时实验组和对照组膀胱均与正常膀胱组织无明显区别。结论HAM的细胞相容性良好,不影响VSMCs的形态,作为膀胱移植物进行膀胱修补吸收降解迅速,可用做组织工程膀胱的支架材料进一步研究。     

培养血管平滑肌细胞收缩蛋白表达与表现型转变及细胞增殖的关系

目的　探讨体外血管平滑肌细胞 (SMC)的失分化与其表现型转变及增殖的关系。　方法　采用电镜形态定量及蛋白印迹 (Westerblot)方法检测家兔主动脉SMC在原代培养过程中肌丝体密度及收缩蛋白表达的动态变化 ,并分析这些变化与细胞增殖状态的关系。　结果　根据对细胞生长曲线的分析 ,原代培养SMC的增殖可分为 3个阶段 ,即潜伏期 (第 1～ 6d)、对数增殖期 (第 6～ 12d之间 )和增殖后静止期 (第 12d以后 )。电镜定量显示 ,胞质中肌丝的体积密度均值由培养前的 (32 14± 1 4 4 ) %下降至潜伏期末的 (18 36± 2 0 1) % (P <0 0 5 ) ;然后逐渐增高 ,到细胞进入增殖后静止期第 3d恢复至培养前水平 [(32 5 0± 1 2 1) % ;与培养前相比 ,P >0 0 5 ]。Westernblot分析显示 ,培养过程中平滑肌特异型收缩蛋白 ,如α SM肌动蛋白、SM肌球蛋白重链随培养时间逐渐降低 ,其中作为血管SMC成熟标志的SM肌球蛋白重链亚型 2在培养第 9d后消失 ;而非肌细胞型收缩蛋白 ,β NM肌动蛋白则随培养时间逐渐增高。上述蛋白含量的变化不随细胞增殖状态及肌丝的消涨而波动。　结论　体外培养血管SMC的表现型转变和失分化是两个相对独立的过程。前者与SMC的增殖状态密切相关 ,可能是肌丝系统为适应细胞分裂而发生的可逆性重组 ;而     

猴脑动脉的衰老变化—大脑中动脉中膜平滑肌定量分析

用透射电镜结合定量方法对猕猴大脑中动脉干中膜的年龄变化进行了研究,结果表明:幼年、成年及老年组大脑中动脉中膜平滑肌占中膜面积的百分比分别是71.8%±6.93、64.8%±5.65和63.1%±7.36.说明平滑肌占中膜面积的百分比随着增龄而逐渐下降,此变化与定性观察的结果相一致.认为此定量方法能较客观地反映出平滑肌与间质的增龄改变.     

机械张应变诱导的大鼠血管平滑肌细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路相关基因的筛选

目的 筛选机械张应变诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的相关基因.方法 应用FX-4000T 细胞应变加载系统,对大鼠主动脉VSMCs施加1 Hz、10 % 张应变,Western blotting检测细胞在不同加载时间下Akt磷酸化水平的变化;用抑制消减杂交法(SSH) ,筛选给予PI3K的抑制剂Wortmannin和给予DMSO 两组细胞在加载张应变24 h后的差异表达基因片段,得到的消减杂交产物连接到T 载体上,经过蓝白斑筛选,对所有阳性克隆进行菌液PCR筛选及测序,应用BLASTN进行序列比对.结果 机械张应变改变了VSMCs磷酸化Akt水平;SSH所获得的54个克隆随机挑选30个送测序,得到10个不同差异表达序列标签(EST),发现6个EST代表的大鼠基因可能与机械张应变诱导的VSMCs PI3K/Akt信号通路相关,它们是:High mobility group box 1(HMGB1), Neural precursor cell expressed(Nedd4a ), Cyclin-dependent kinase 5(CDK5), Histone deacetylase 3(HDAC3), Ubiquitin-like 1(Uble1a), Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1(hnRNP).结论 SSH有效筛选到了机械张应变诱导的VSMCs PI3K/Akt信号通路的相关基因,为进一步研究机械张应变诱导的血管病理生理改变提供了资料.     

狗股动脉弹性纤维的构筑

为研究正常动脉的弹性纤维，用甲酸消化法制取动脉的弹性网，在扫描电镜下观察了８例健康狗股动脉弹性纤维的构筑。可见内弹性膜有光滑的腔面并有许多窗孔，中膜互相吻合的弹性纤维组成复杂的网状，外膜含有由大的纵行纤维及纤细的横行纤维组成的７～８层不完全的弹性膜。３层膜里所有的弹性纤维互相连接，形成连续的弹性网     

牛脑微血管平滑肌细胞的体外培养及其产生血小板激活因子的观察

本文采用匀浆及149μm尼龙网过滤法分离脑微血管,并用胶原酶处理后接种于培养瓶中,静置一周后.可见有散在的细胞生长,再经一周后可长成致密单层。细胞经光镜、电镜检查均符合平滑肌细胞的特征。光镜下可见细胞呈梭形,火焰状排列,电镜下可见为平滑肌细胞特征的肌丝。VIII因子相关抗原鉴定呈阴性,培养的脑徽血管平滑肌细胞,在A-23187刺激下可产生少量血小板激活因子(platelet activating faetor,PAF),其产量较内皮细胞要少.这也是平滑肌细胞与内皮细胞的重要区别之一。     

弹性纤维参与大鼠心肌梗死后重构的形态学观察

目的探讨大鼠心肌梗死重构过程中弹性纤维的变化及其机制和意义。方法SD大鼠冠状动脉前降支结扎形成心肌梗死模型,于术后2、4、8、12、21周时,用Masson染色、Uana地衣红染色技术和免疫组织化学方法,分别观察梗死区弹性纤维和白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化,计算机图像分析系统作半定量分析。结果心肌梗死后2周梗死区即出现弹性纤维,至8~12周最高,21周弹性纤维明显减少或缺如,以胶原纤维为主。IL-1β、TNF-α表达在梗死后2周时可见,并随时间而增强。结论弹性纤维参与心肌梗死后的愈合过程,干预弹性纤维的形成可能成为抗心室重构的手段。