pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体的构建及其对人鼻咽癌细胞增殖的影响

目的：构建 pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体并观察其对鼻咽癌细胞株 CNE1体外增殖的影响。方法：提取 CNE1细胞中总 RNA,RT －PCR 扩增 NPRL2并克隆至 pEGFP －N1载体,鉴定出阳性克隆送测序,以重组质粒转染 CNE1细胞。通过 Western blot 检测转染细胞中 NPRL2蛋白的表达,CCK －8法检测细胞增殖的变化。结果：成功构建了 pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体,Western blot 法检测到 NPRL2蛋白的表达, CCK －8法检测发现 NPRL2能够明显抑制肿瘤细胞增殖（P ＜0．05）。结论：成功构建 pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体并转染至 CNE1细胞,NPRL2可抑制肿瘤细胞的增殖。     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的：建立稳定的基因工程细胞系。方法：将含有人肿瘤坏死因子α（hTNFα）全长cDNA插入表达载体pSNAV2．0，产生重组质粒pSNAV2．0-TNFα，利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中，G418筛选阳性克隆hTNF／293，采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果：通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明：在质粒pSNAV2．0中插入片段正确。采用RT—PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达，分子量为17KDa。结论：成功构建重组质粒pSNAV2．0-TNFα，真核表达载体构建正确，转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白，并能分泌到细胞外。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

骨肉瘤MG-63细胞中Polo样激酶2的表达和定位

目的：构建真核表达载体＊3 Flag-hPlk2并检测其在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法：以GST-hPlk2为模板,利用PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其克隆至含有＊3 Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察＊3 Flag-hPlk2在MG-63细胞中的定位,免疫沉淀法纯化hPlk2蛋白。结果：hPlk2基因cDNA全长成功构建到真核表达载体＊3 Flag中,Western blot检测到＊3 Flag-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为80kDa。＊3 Flag-hPlk2在骨肉瘤MG-63细胞中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化hPlk2蛋白。结论：成功构建了＊3 Flag-hPlk2真核表达质粒,同时鉴定了＊3 Flag-hPlk2融合蛋白的表达,并纯化hPlk2蛋白。＊3 Flag-hPlk2蛋白主要定位在细胞质和核周。     

BLCAP基因cDNA的克隆及siRNA表达载体的构建

目的：克隆BLCAP基因cDNA并构建和鉴定针对于BLCAP基因的siRNA真核表达载体.方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得BLCAP基因.将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定.将合成的siRNA核酸片段退火形成双链后连接到经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1真核表达载体,命名为pSilencer4.1-B1以及pSilencer4.1-B2,并进行酶切及测序鉴定.脂质体法转染SOSP-9607细胞系,G418筛选以及RT-PCR验证构建的真核表达载体对目的基因的干涉情况.结果：经酶切及测序鉴定,所获得的目的片段序列BLCAP基因完全相符.重组质粒中含有与理论值相符的插入片段,其测序结果与设计序列一致.经脂质体法转染后pSilencer4.1-B2可明显抑制SOAP-9607细胞的BLCAP表达.结论：成功克隆了BLCAP基因并cDNA构建和验证了其siRNA真核表达载体.     

Notch1 胞内段荧光表达质粒的构建及鉴定

目的：构建能够在鼻咽癌细胞株中高效表达人Notchl信号胞内段（NIC）的荧光质粒。方法：通过RT—PCR获得人NIC的cDNA;利用基因重组技术插入到pEGFP—N1中;在脂质体介导下转染人低分化鼻咽癌细胞CNE2后,经荧光显微镜、RT—PCR和Westernblot检测NIC的表达情况。结果：RT—PCR方法得到一条2424bp的特异性扩增产物,酶切和基因测序结果表明重组质粒构建成功。转染48h后,检测到绿色荧光表达,RT～PCR和Westernblot的结果显示NIC的表达量升高。结论：正确构建了人NIC荧光表达质粒。该质粒能够在鼻咽癌细胞株中高效表达,为研究Notch信号通路在鼻咽癌中的作用奠定了实验基础。     

骨肉瘤细胞中Sestrin2的表达和定位

目的:构建新型人源真核表达载体3*Flag-hSesn2并同时检测其在骨肉瘤细胞中的表达及定位.方法:以GST-hSesn2作为模板,利用聚合酶链反应扩增目的基因hSesn2的cDNA全长,并将其克隆到含有3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组质粒酶切并测序分析鉴定,转染至MG-63骨肉瘤细胞中,提取细胞总蛋白后进行Western blot检测重组蛋白表达.此外利用荧光共聚焦激光扫描显微镜检测3*Flag-hSesn2在MG-63细胞系中的定位,并最终利用免疫沉淀方法纯化人源Sesn2蛋白.结果:hSesn2基因cDNA全长成功构建于含有3*Flag标签的真核表达载体中,利用Western blot检测3*Flag-hSesn2融合蛋白表达,分子量约为55kDa.3*Flag-hSesn2在MG-63骨肉瘤细胞系中主要定位于细胞质及核周,进一步成功纯化了hSesn2蛋白.结论:成功的构建了含有3*Flag标签的人源Sesn2真核表达质粒,同时鉴定3*Flag-hSesn2融合蛋白的表达,最终成功纯化hSesn2蛋白.其中3*Flag-hSesn2蛋白主要定位在细胞质和核周.     

重组人canstatin真核载体的构建及鉴定

目的 构荧光蛋白和canstatin融合蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N1／canstatin，以深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性。方法 提取人胚肝总RNA，RT—PCR扩增canstatin基因片断，T—A克隆到pGEM—T中，从pGEM—T／canstatin克隆载体中，将人canstatin cDNA亚克隆入真核表达载体pEGFP-N1，构建含人canstatin cDNA的重组质粒pEGFP-N1／canstatin，通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果 成功构建pEGFP—N1／canstatin真核表达载体，双酶切及测序鉴定显示canstatin基因片断正确插入载体，与Genebank中报道的序列一致。结论 pEGFP—N1／canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达和活性研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的:建立稳定的基因工程细胞系.方法:将含有人肿瘤坏死因子α(hTNFα)全长cDNA插入表达载体pSNAV2.0,产生重组质粒pSNAV2.0-TNFα,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中,G418筛选阳性克隆hTNF/293,采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达.结果:通过Sal I和EcoR I双酶切、PCR及测序鉴定证明:在质粒pSNAV2.0中插入片段正确.采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFct蛋白表达,分子量为17KDa.结论:成功构建重组质粒pSNAV2.0-TNFα,真核表达载体构建正确,转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外.     

3*Flag-hPlk4真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达和定位

目的:构建3*Flag-hPlk4真核表达载体,并证实重组表达载体在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以pGEX-4T-2-hPlk4为模板,利用聚合酶链反应扩增hPlk4基因cDNA全长,并将其克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到U2OS骨肉瘤细胞中,Western blot检测重组蛋白的表达.同时利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hPlk4表达载体在U2OS细胞中的定位,进一步利用免疫沉淀的方法纯化人源Plk4蛋白.结果:hPlk4基因cDNA全长成功构建到3*Flag真核表达载体中,Western blot检测到含有3*Flag的人源Plk4融合蛋白表达,进一步在U2OS骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和细胞核周,并成功纯化hPlk4蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hPlk4真核表达质粒,同时鉴定了融合蛋白的表达,并成功纯化人源Plk4蛋白.3*Flag-hPlk4蛋白主要定位在细胞质和细胞核周.     

TFPI-2基因克隆及其在胰腺癌细胞中的表达

目的克隆人TFPI-2基因全长cDNA,构建其真核表达载体,并将其转染到人胰腺癌细胞Panc-1中,检测其表达。方法用RT-PCR法从人胎盘组织中扩增人TFPI-2基因,并将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2。将构建的重组载体转染到人胰腺癌细胞系Panc-1细胞,Westernblot检测TFPI-2在Pane-1细胞中的表达。结果RT-PCR成功的扩增出一条约708bp的片断,扩增片断与载体连接后,经限制性内切酶酶切电泳分析和DNA序列测定证实该基因已经成功构建到载体上,转染Panc-1细胞后,荧光显微镜观察到稳定转染细胞发出较强绿色荧光,Westernblot技术证明TFPI-2基因能在Panc-1细胞中稳定表达。结论成功构建了人TFPI-2基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,获得了稳定表达TFPI-2的Panc-1细胞,证实TFPI-2基因能够在人胰腺癌细胞系Panc-1中高效、稳定的表达,为进一步研究其胰腺癌迁移、浸润及转移中的作用打下基础。     

B7-1/GFP基因真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

Objective： To construct eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP geneand study its expression in osteosarcoma cell line LM8. Methods： By using gene cloning technique, eukaxyotic expression vector pEGFP-C1 was used to construct the murine B7-1 recombinant plasmid （pEGFP-C1/B7）. Recombinant plasmid was transfected into LM8 cells with liposome and was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. The expression of the fusion protein was detected using fluorescence microscope and Western blot analysis. Results： The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1/B7 was successfully constructed, which was confirmed by DNA sequencing, RT-PGR and restriction enzymes analysis. The green fluorescent protein could be detected in the transfected LM8 with fluorescence microscope. The expected B7-1 and green fluorescent protein （GFP） fusion protein was detected by RT-PCR and Western blot. Conclusion： The eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP gene was constructed successfully, and it could be expressed in LM8 after transfection.     

HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的:克隆人抗原R基因（HuR）的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。     

pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒的构建及在MCF-7乳腺癌细胞中的转染

目的构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒, 并进行鉴定。为进一步研究Smad3在抑制乳腺癌生长机制中起到的作用提供实验基础。方法 利用RT-PCR方法从MCF-7乳腺癌细胞中获得cDNA, 应用PCR方法扩增、提取 Smad3的基因片段, 酶切后与pEGFP-C3真核表达载体连接, 构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒, 进行测序、酶切鉴定, 表明质粒构建成功。将构建的质粒瞬时转染至MCF-7乳腺癌细胞中, 通过荧光倒置显微镜观察、RT-PCR技术及Westen blot技术鉴定转染是否成功。结果 本实验成功构建了pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒。结论 pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒瞬时转染到MCF-7细胞中, 可使Smad3在基因与蛋白水平的表达显著上调。     

人miR-34a真核表达载体的构建及其表达

目的:构建人miR-34a的真核表达载体,并使其在骨肉瘤SOSP-9607细胞中表达.方法:从人骨肉瘤SOSP-9607细胞基因组DNA中用PCR法扩增出miR-34a的前体序列,并引入酶切位点和保护碱基,双酶切后定向插入真核表达载体pcD-NA3.1(+)中,构建miR-34a真核表达载体pcD-NA-miR34a,然后进行菌落PCR、酶切和测序鉴定.同时用构建好的载体pcDNA-miR34a转染骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞,筛选miR-34a稳定表达细胞系,用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcD-NA-miR34a可于真核细胞中过表达miR-34a的生物学特性.结果:成功构建了人miR-34a真核表达载体pcDNA-miR34a.pcDNA-miR34a可于骨肉瘤SOSp-9607细胞中上调miR-34a的表达,获得了miR-34a高表达骨肉瘤细胞系.结论:miR-34a的真核表达载体可在骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞中有效表达,为进一步研究miR-34a在骨肉瘤中的功能及基因调控机制奠定了实验基础.     

CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的：构建C-末端结合蛋白-1（CtBP1）基因RNA干扰（RNAi）的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,初步鉴定其干扰效果。方法：以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白（EGFP）基因、卡那霉素（Kanr）抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果：构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA（pGenesil-1-CtBP1-shRNA）,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞表达绿色荧光蛋白（EGFP）,证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%-70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义（P均〈0.05）。结论：成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。     

PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响

目的 通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与PTEN融合蛋白真核表达载体的构建和表达,观察PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响。方法 （1）以RT—PCR方法扩增人的PTEN基因,经T—A亚克隆筛选后连入真核表达载体pEGFP—N1,构建融合蛋白表达载体。采用阳离子聚合物转染试剂,将重组质粒DNA瞬时转染至SHG-44细胞,检测融合蛋白的表达。（2）G418筛选出稳定转染的细胞（SHG-44-Z）,并扩增培养,通过细胞形态学、生长曲线观察PTEN基因对细胞形态和增殖的影响,免疫组织化学法检测对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响。结果 （1）重组质粒阳性克隆的测序结果与GenBank报告序列一致。瞬时转染的SHG-44细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光,流式细胞仪可检测到荧光表达量为17．8％,免疫细胞化学法检测到外源PTEN蛋白表达。证实pEGFP—PTEN融合蛋白表达载体构建成功,并在胶质瘤细胞得以正确表达。（2）转染组SHG-44-Z细胞株的生长增殖受到明显抑制,第7天细胞计数为未转染组细胞数的27．8％,且GFAP表达上调。结论携带绿色荧光蛋白的PTEN基因真核表达载体的构建,为进一步研究PTEN的作用机理及抑癌效应奠定了基础。     

HPV18 E6E7 反义荧光真核表达载体的构建及其在宫颈癌HeLa 细胞中的表达

 目的 构建HPV18型E6E7反义荧光真核表达载体,并观察其对宫颈癌HeLa细胞中HPV18 E6和E7基因表达的影响,探索反义技术用于治疗临床HPV感染及宫颈癌的可能性。方法 以HPV18型全基因质粒为模板,PCR法扩增HPV18型E6E7区716bp片段,利用基因重组技术将目的片段反向插入荧光真核表达载体pEGFP-C1,EcoR I酶切并测序鉴定;采用脂转法将重组质粒pEGFP-HPV18 E6E7as（EGFP-18AS）转染宫颈癌HeLa细胞株,通过RT-PCR及western blot检测细胞中E6、E7 mRNA和蛋白的表达。结果 成功构建HPV18E6E7反义荧光真核表达载体EGFP-18AS,经脂质体转染HeLa细胞,48h后在荧光倒置显微镜下可见明显的绿色荧光,且细胞中E6、E7 mRNA及蛋白表达水平均明显下调。结论 反义荧光真核表达载体可以有效的抑制HPV18E6、E7癌基因的表达,为治疗HPV感染和宫颈癌提供了一种新的方法。     

APC蛋白功能区域重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株HCT-116中的表达

 目的　构建并鉴定含有APC蛋白不同功能区域的真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5,转染人类结直肠癌细胞HCT-116,观察重组质粒在细胞内的表达。方法　根据APC基因的功能结构以及APC突变簇集区的特点,设计特异性引物扩增APC基因特异性的功能区域片段。将扩增出的5个APC片段克隆到pEGFP-N3载体的N端,经测序分析对重组质粒pEGFP-N3-APC1～5进行鉴定。使用脂质体转染法将重组质粒转染人类结直肠癌细胞HCT-116,通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来检测APC功能区域在细胞内的表达。以RT-PCR法进一步验证重组质粒在细胞中的表达。结果　构建5个pEGFP-N3-APC结构区域的重组真核表达载体,重组真核表达载体转染HCT-116细胞后,细胞中均可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,5个重组质粒在HCT-116细胞中均可表达。结论　真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能,筛选结直肠癌基因治疗的有效且易于基因操作的靶标片段提供了基础。础。