原代分离的大鼠胰岛细胞对葡萄糖刺激胰岛素分泌的反应性研究

目的:研究原代分离的大鼠胰岛对葡萄糖刺激的胰岛素分泌反应性。方法:胶原酶原位灌注法分离大鼠胰岛,在含0.5%BSA、5.5或11.1mmol/L葡萄糖的培养基中培养不同时间后,用含0.2%BSA、3.3mmol/L葡萄糖的KRB缓冲液预培养胰岛30min,分别换入含不同浓度葡萄糖KRB缓冲液,培养1h,收集上清,RIA法测定胰岛素浓度。结果:大鼠胰岛过夜培养后,在基础(3.3mmol/L)和高浓度(16.7mmol/L)葡萄糖条件下胰岛素分泌量分别为(12.4±3.2)和(45.2±4.2)μU/ml/10islets/h;5.5mmol/L和11.1mmol/L葡萄糖浓度下培养12h和20h后,胰岛对葡萄糖的反应性均明显高于16.7mmol/L和22.5mmol/L葡萄糖组(P<0.05);体外培养5d后,对高糖的反应性为(4.28±0.67)倍。结论:原代分离的大鼠胰岛可在(1～5)d内保持对葡萄糖的反应性。     

胰岛素分泌细胞的来源

糖尿病是严重危害人类健康的重大疾病之一。且近年来此病的发病率星上升趋势,目前治疗该病的有效方法是胰岛索治疗,给社会和家庭带来了沉重的负担。胰岛移植虽是治疗此病的有效手段,但面临胰岛供体匮乏,免疫排斥以及使用免疫抑制剂给病人带来痛苦等困难。能找到可以避免上述困难又能有效分泌胰岛素的细胞将给亿万糖尿病病人带来福音。     

11β-羟类固醇脱氢酶1型基因沉默对胰岛β细胞系NIT-1葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响

目的观察RNA干扰阻断胰岛β细胞系NIT-1中11β-羟类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)表达对细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)的影响。方法pSuper质粒为载体,构建针对11β-HSD1基因的质粒oligo886、oligo866和乱序对照质粒oligoScr886,转染NIT-1细胞,RT-PCR和蛋白印迹法检测11β-HSD1mRNA和蛋白表达。oligo886重组质粒转染25 mmol/L葡萄糖培养基中的NIT-1细胞,测GSIS。结果转染oligo886和oligo866质粒的NIT-1细胞11β-HSD1mRNA分别下降78.1%±2.9%和51.7%±2.7%,11β-HSD1蛋白的水平分别下降82.2%±2.1%和56.5%±2.0%。oligo866转染25 mmol/L葡萄糖培养基中的NIT-1细胞后,GSIS较对照组明显升高(P<0.01)。结论11β-HSD1基因沉默能改善NIT-1细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌能力,提示胰岛β细胞NIT-1通过11β-HSD1调节糖皮质代谢,参与葡萄糖刺激胰岛素分泌。     

秋水仙碱对巨噬细胞分泌TNF－α的影响

微管聚合抑制剂秋水仙碱（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ，Ｃｏｌ．）能剂量依赖性地抑制ＬＰＳ刺激的大鼠巨噬细胞（Ｍψ）分泌ＴＮＦ－α。Ｃｏ１的衍生物β－ｌｕｍｉｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ对微管无影响，对ＴＮＦ－α的分泌亦无影响；其他微管抑制剂如长春新碱等亦能抑制Ｍψ分泌ＴＮＦ－α。间接免疫荧光染色和原位杂交法显示，ＬＰＳ能促进微管聚合，并使ＴＮＦ－αｍＲＮＡ及蛋白质表达明显增加；当ＬＰＳ与Ｃｏｌ．联用时，微管解聚，ＴＮＦ－αｍＲＮＡ表达及其蛋白质合成减少，ＴＮＦ－α失去原有的胞浆定位，弥散分布于胞浆。说明ＴＮＦ－α的合成需要完好的微管结构与功能，并提示在生理或病理条件下微管功能的变化可能直接或间接参与对ＴＮＦ－α生物合成的调节。     

不同培养时间对NIT-1细胞胰岛素分泌及相关基因表达的影响

目的：研究体外生理浓度葡萄糖培养胰岛β细胞株NIT-1细胞在不同时间出现的功能变化及其可能机制。方法：观察5.6 mmol/L葡萄糖浓度的DMEM完全培养基培养的NIT-1细胞在 8周培养时间内细胞的形态变化；胰岛素免疫细胞化学染色；应用放射免疫法测定8周葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平；并以RT-PCR半定量测定各基因Insulin、Glut2、GK、PDX-1、NeuroD1、Pax4、Pax6 mRNA表达水平变化。结果：（1）传代培养过程中细胞生长良好呈多边形，不同培养时间的NIT-1细胞形态无显著差异；（2）胰岛素免疫细胞化学染色示GSIS组胞浆染色阳性，呈淡黄褐色；（3）1-8周每周测定的葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）与第1周数据比较，显示胰岛细胞分泌功能改变差异显著（P<0.05）；（4）1-8周每周测定的胰岛素基因、PDX-1基因、GK基因、Glut2基因、NeuroD1基因和Pax6基因mRNA的表达与第1周比较，显示基因mRNA的改变差异显著（P<0.05）； Pax4基因mRNA的改变无显著差异（P>0.05）。结论: 生理浓度葡萄糖培养的NIT-1细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能随体外培养时间的延长呈逐步下降趋势；这可能与维持β细胞功能有关的基因Insulin、PDX-1、 GK、Glut2、NeuroD1 和 Pax6 表达下降有关。     

不同病程非胰岛素依赖型糖尿病人的胰岛素分泌反应

磺脲类药物继发性失效是非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)治疗过程中较难克服的问题,随着(?)程的延长,其发生率有增多趋势,为了解不同病程NIDDM发生继发性失效的规律,我们分析了283例未使用过胰岛素的NIDDM胰岛素分泌曲线,以图对其治疗有所帮助。 对象和方法 一、对象:在我院住院的符合WHO诊断标准的NIDDM 283人(男157,女126),全部病例均末使用过胰岛素,年龄36～77岁,平均55.38±11.74岁,病程1～32年。按病程<3年,3～6年,6～9年,>9年分为4组。 二、方法:受试者隔夜禁食12小时,进食馒头100克,于进食前及进食后0.5、1、2、3小时抽血测定胰岛素及C肽值,胰岛素及C肽测定均用RIA法,试剂盒由中国原子能研究院提供,仪器用北京核仪器厂生产的FT-630型微机多探头放免测定仪。显著性检验用t检验。 结果 不同病程的NIDDM不同时相的胰岛素及C肽结果分别见表1和表2。     

肥胖对不同糖耐量者第一时相胰岛素分泌功能的影响

 目的： 探讨肥胖对不同糖耐量人群第一时相胰岛素分泌功能的影响。方法： 无糖尿病家族史的正常糖耐量者(正常对照,NC)38例、2型糖尿病一级亲属正常糖耐量(NGT)者32例、糖调节受损(IGR)者67例及新诊断的2型糖尿病(T2DM)患者35例参与本试验。这4个组再分为超重/肥胖及正常体重2个亚组。各组均行静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）和口服葡萄糖-胰岛素释放试验（OG-IRT）,计算第一时相胰岛素分泌功能指数(AlR3-5)及胰岛素敏感性指数（ISI）,分析肥胖对不同糖耐量人群胰岛β细胞功能及胰岛素抵抗的影响。结果： NC超重/肥胖亚组较正常体重亚组AIR3-5显著升高（P<0.05）,其余3对亚组间比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。超重/肥胖亚组ISI较正常体重亚组有降低趋势,其中IGR两亚组间比较差异无统计学意义（P>0.05）,其余3对亚组间比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。ISI与体重指数和腰围在各组均呈负相关（P<0.05）,与AIR3-5在NC组呈负相关（P<0.05）,而在其余各组均呈正相关（均P<0.05）。结论： 肥胖对不同糖耐量人群胰岛β细胞分泌功能影响各不相同。无糖尿病家族史的正常糖耐量者随着胰岛素抵抗的加重,第一时相胰岛素分泌功能代偿性增加,而2型糖尿病一级亲属正常糖耐量者、糖调节受损者和2型糖尿病患者则不能代偿性增加。     

谷氨酰胺抑制MIN6细胞AMPK活性并促进其胰岛素分泌

目的:观察谷氨酰胺对MIN6细胞胰岛素分泌和AMPK磷酸化水平的影响,以探讨谷氨酰胺影响胰岛素分泌的可能机理.方法:将MIN6细胞接种于24孔或6孔细胞培养板,实验前用含0.2%BSA和2.8mmol/L葡萄糖KRB预培养30min,分别换入含不同浓度葡萄糖和谷氨酰胺的KRB缓冲液,培养1h,收集上清,待测胰岛素;抽提蛋白,检测蛋白磷酸化水平.结果:葡萄糖在(2.8～22.5)mmol/L浓度下能剂量依赖性地降低AMPK蛋白磷酸化,抑制其活性,胰岛素分泌和AMPK活性呈负相关.10mmol/L谷氨酰胺孵育MIN6细胞1h可降低AMPK蛋白磷酸化,胰岛素分泌增加35%.结论:抑制AMPK活性可以促进胰岛素分泌,谷氨酰胺可能通过抑制AMPK活性促进胰岛素分泌.     

葡萄糖毒性与胰岛β细胞功能

人们已了解到长期高血糖不仅是代谢控制不良的一个标志,而且它与胰岛素分泌和胰岛素抵抗有着密切的关系。高血糖具有双向性作用,短期的高血糖对胰岛素的分泌和葡萄糖的利用有着刺激作用,长期的高血糖则起相反的抑制作用。这种长期高血糖的有害作用被称之为“葡萄糖毒性”[1]。1     

甲鱼油对胰岛素抵抗细胞模型胰岛素敏感性和葡萄糖代谢的影响

采用高浓度胰岛素诱导建立胰岛素抵抗(IR)HepG2细胞模型,评价甲鱼油对IR细胞模型胰岛素敏感性和葡萄糖代谢的影响.利用甲鱼油处理IR细胞模型,通过葡萄糖氧化酶及3H-D-葡萄糖参入实验分别检测其葡萄糖消耗和3H-D-葡萄糖参入率.结果表明,HepG2细胞模型的葡萄糖参入率在各种浓度的胰岛素刺激下均低于对照细胞(P＜0.05),并且HepG2细胞模型与对照细胞的3H-D-葡萄糖参入率随着胰岛素浓度的升高而升高,但前者升高的幅度低于后者.MTT(甲基噻唑基四唑)结果显示甲鱼油均具有促进对照细胞和IR细胞模型增殖作用.与对照组细胞相比,采用不同浓度胰岛素诱导的模型细胞经甲鱼油处理后其葡萄糖摄取和消耗显著增加(P＜0.05).甲鱼油明显增加该IR细胞模型的葡萄糖消耗和3H-D-葡萄糖参入率,提高IR细胞模型的胰岛素敏感性,改善其糖代谢.     

胰岛素分泌细胞再生医学研究的最新进展

糖尿病是由于胰岛素绝对或相对不足引起的以高血糖和多并发症为特征的内分泌代谢性疾病,其本质是胰岛素分泌细胞受损或者胰岛素工作效率低下。通过再生医学手段将体外再生的胰岛素分泌细胞植入患者体内,重建有功能的胰岛素分泌系统不失为治疗Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的一种新途径。再生医学的研究和应用中,最有价值的细胞是干细胞。文中就干细胞诱导分化以及成体细胞重编程再生为胰岛素分泌细胞方面最新进展作一综述。     

Ghrelin促进大鼠胰岛素合成及高葡萄糖诱导的胰岛素分泌

Ghrelin是由胃黏膜分泌的小分子脑肠肽。本研究探讨了Ghrelin对于大鼠胰岛细胞合成与分泌胰岛素的影响。将分离培养的大鼠胰岛分为Ghrelin处理组和对照组 :(1)在高浓度葡萄糖 (16 7mmol L)刺激时加入不同浓度Ghrelin 10 - 1 2 ～ 10 - 8mol L孵育 6 0min ,测定胰岛素分泌量。 (2 )在培养液中加入不同浓度Ghrelin 10 - 1 2 ～ 10 - 8mol L预处理 2 4h后 ,用RT PCR方法检测胰岛内前胰岛素原mRNA表达 ,并测定不同浓度葡萄糖 (5 6mmol L ,16 7mmol L)刺激时胰岛素分泌量。离体大鼠胰岛 ,在高糖刺激时加入Ghrelin 10 - 1 1 ～ 10 - 1 0 mol L共同培养 6 0min ,胰岛素分泌量增加高于对照组 (P <0 0 5 )。Ghrelin 10 - 1 2 ～ 10 - 1 0 mol L预处理 2 4h后 ,高糖刺激时胰岛素分泌量增加高于对照组 (P <0 0 5 ) ,同时Ghrelin 10 - 1 0 mol L促进胰岛内前胰岛素原mRNA表达高于对照组 (P <0 0 5 )。一定浓度的Ghrelin促进胰岛在高葡萄糖诱导下的胰岛素分泌 ,经Ghrelin预处理 2 4h后该作用更为显著。Ghrelin增加大鼠胰岛内前胰岛素原mRNA的表达 ,促进胰岛素合成。     

胚胎干细胞R1诱导成胰岛素分泌细胞团的研究

目的 建立体外培养和扩增胚胎干细胞R1(ES-R1)的最佳条件;利用多种生长因子,优化培养条件,体外定向诱导ES-R1分化为胰岛素分泌细胞(IPCs).方法 以丝裂霉索-C处理的MEF为饲养层,培养液中加白血病抑制因子(LIF),ES-R1维持未分化状态并扩增,进行碱性磷酸酶染色.胚胎干细胞(ESCs)悬浮培养制成拟胚体(EBs),对培养至第4d的EBs开始定向诱导,依次加入无血清的ITS培养液,胰岛前体细胞增殖培养液和胰岛分化培养液,每种培养液内各培养6d,获得形态功能较成熟的IPCs.采用DTZ染色、免疫荧光染色、胰岛素刺激实验等方法对IPCs进行检测.结果 ESCs在饲养层细胞上呈克隆状生长,经碱性磷酸酶染色为阳性;EBs经3种诱导液诱导成三维立体的IPCs,IPCs被DTZ染成猩红色,胰岛素和胰高血糖素阳性表达,胰岛素刺激实验阳性.结论 ES-R1在体外培养时,用MEF做饲养层,培养液中添加一定浓度的LIF,可以最好地保持未分化状态并大量增殖.用分阶段添加不同生长因子的方法诱导ES-R1定向分化生成的IPCs在形态和功能上具有胰岛的特性.     

miR-375对人类诱导多能干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响

目的:探讨微小RNA-375(miR-375)在调控人类诱导多能干细胞(hiPSCs)分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)过程中的作用及可能机制。方法:构建miR-375过表达的慢病毒载体,转染hiPSCs获得miR-375稳定表达的miR-375-hiPSCs,体外诱导其定向分化为IPCs,采用real-time PCR、流式细胞术及ELISA等方法对其标志性基因、分化效率、胰岛素和C肽释放量等进行检测;生物信息学结合萤光素酶报告基因实验预测并验证miR-375的靶基因,real-time PCR及Western blot检测靶基因的表达。结果:过表达miR-375可上调胰岛β细胞标志性转录因子HNF4α、MafA、Pdx1、Pax6、Nkx6.1、glucokinase和insulin的表达,分化效率由对照组的22.3%提高至38.6%;高糖刺激后胰岛素释放量由成年胰岛细胞分泌量的1/8提高到1/5;过表达miR-375可影响靶基因REST和WNT5A的蛋白翻译水平。结论:miR-375可通过干扰靶基因REST和WNT5A的翻译水平,开启胰岛素分泌相关特异性基因的表达,从而促进hiPS...     

小鼠iPSCs诱导分化为胰岛素分泌细胞及治疗糖尿病的实验研究

 目的: 利用3步法诱导方案,使小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)分化为胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs),观察诱导效率和成熟度,并观察其对糖尿病小鼠治疗效果。方法: 本实验室通过piggyBac转座子将C57/C雄性小鼠来源胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)构建为小鼠iPSCs,利用3步法诱导方案分化为IPCs,观察细胞分化过程中的形态变化;RT-PCR和免疫荧光检测其胰岛β细胞发育相关基因和蛋白的表达;流式细胞术分析分化效率;葡萄糖刺激实验检测胰岛素和C肽分泌水平。将IPCs移植入C57/C雄性糖尿病小鼠模型左肾包膜下,监测血糖和血清中胰岛素含量28 d,观察逆转高糖血症的效果。结果: 建立的3步诱导方案可以将小鼠iPSCs诱导分化为IPCs,其表达胰岛β细胞的标志性基因(Pdx1、Ngn3、Pax6和Ins2)和蛋白(Pdx1、Nkx6.1和胰岛素),在葡萄糖刺激下可分泌胰岛素和C肽。流式细胞术结果表明诱导分化的效率达28%。移植后3 d糖尿病小鼠血糖即降低至接近正常水平,血清胰岛素含量明显升高,对葡萄糖的调控能力明显增强。病理学观察IPCs细胞移植28 d后仍存活。结论: 建立的3步诱导法可将iPSCs高效定向诱导分化为IPCs,明显缩短了诱导分化的时间,移植至近交系同性别小鼠体内可逆转糖尿病的高糖血症。     

糖尿病患者血液细胞来源多能干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞

目的建立和鉴定1型糖尿病(T1DM)患者血液细胞来源诱导多能干细胞(iPSCs),研究其在体外诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)的潜能及对糖尿病小鼠的治疗效果。方法将表达OCT4、SOX2、LIN28、L-MYC和KLF4转录因子的oriP/EBNAl附加体电转染T1DM患者外周血红系祖细胞使其重编程获得iPSCs,通过形态、核型鉴定、碱性磷酸酶染色、RT-PCR和体外畸胎瘤实验检测其干细胞多能性。诱导iPSCs分化为IPCs,对其进行RT-PCR检测和葡萄糖刺激实验,并将其移植入C57BL/6J雄性糖尿病小鼠左肾包膜下,监测血糖、体质量和糖耐量变化。结果获得的iPSCs核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达干细胞多能性基因OCT4、SOX2、LIN28、L-MYC和KLF4,畸胎瘤实验可分化为三胚层细胞。获得的IPCs表达胰岛β细胞特异性基因PDX-1、INSULIN和NKX6.1,在葡萄糖刺激下分泌C肽。移植后,糖尿病小鼠血糖降低,体质量恢复,控糖能力增强。结论 T1DM患者血液细胞的iPSCs可诱导分化为IPCs,移植至1型糖尿病小鼠体内具有治疗作用。     

FK506对NIT-1细胞增殖和胰岛素分泌的影响

目的 探讨他克莫司(FK506)对NOD鼠胰岛β细胞系(NIT-1)增殖、凋亡和胰岛素分泌的影响.方法 用MTT法、流式细胞术检测NIT-1细胞增殖;放射免疫法、real-time PCR检测NIT-1细胞胰岛素分泌和胰岛素分化相关基因PDX-1、GLUT2和GK mRNA的表达.结果 FK506(20 μg/L)抑制NIT-1细胞增殖(P＜0.05),诱导细胞凋亡(P＜0.05);FK506(10 μg/L)抑制NIT-1细胞释放胰岛素(P＜0.05),胰岛素分泌相关基因PDX-1(胰岛素促进因子-1)、GLUT2(葡萄糖转运载体2)mRNA表达下调(P＜0.05).结论 FK506(10 μg/L)可抑制NIT-1的增殖,诱导凋亡,可通过下调PDX-1和GLUT2 mRNA表达,抑制NIT-1胰岛素分泌.     

三种不同细胞培养方式对体外小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞诱导效果的比较

目的：比较胚胎体、胚胎体-细胞单层和细胞单层3种细胞培养方式对小鼠胚胎干细胞（ES细胞）分化为胰岛素分泌细胞的诱导效果方法：应用胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、β细胞素(betacellulin)、激活素A（activin A）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和尼克酰胺（nicotinamide），分别以胚胎体、胚胎体-细胞单层和细胞单层3种细胞培养方式诱导小鼠ES细胞30 d后，应用RT-PCR、双硫腙（DTZ）染色和免疫组化检测分化细胞胰岛素表达，以流式细胞仪检测胰岛素阳性细胞百分比结果：3种细胞培养方式诱导的分化细胞均可见DTZ染色和胰岛素免疫组化染色阳性细胞，RT-PCR检测到胰岛素和其它一些胰岛相关基因mRNA表达，胚胎体-细胞单层方式胰岛素mRNA表达最强，胚胎体方式次之，细胞单层方式最弱。胚胎体-细胞单层方式的胰岛素阳性细胞百分比高于胚胎体方式（P＜0.01），后者又高于细胞单层方式(P＜0.01）结论：采用胚胎体-细胞单层方式诱导可更好促进小鼠ES细胞分化为胰岛素分泌细胞。