浙江省衢州市1例输入性登革热病例分子流行病学研究

目的调查浙江省衢州市1例登革热输入性病例流行病学特征及病原体分子溯源,为登革热的防控提供依据。方法对2017年输入性登革热病例进行流行病学调查,采集病例血清进行登革热病毒核酸和抗体检测,提取病毒核酸后扩增E基因并测序,利用生物信息学软件进行多序列比对并构建进化树。结果该病例登革热病毒核酸及IgM抗体检测结果均为阳性,基因序列比对及进化分析,病毒株为登革热病毒1型Ⅰ亚型,与东南亚病毒株(登录号KY586429.1、KJ806941.2)亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%和99.7%。结论衢州市登革热病毒1型病例可能为来自东南亚的1例输入性病例。     

2例马来西亚籍输入性基孔肯雅热病例的实验室诊断

[目的]通过系统的实验室检测发现并确认2例输入性基孔肯雅病例。[方法]采用实时荧光逆转录（Realtime RT-PCR）、逆转录PCR（RT—PCR）检测方法对病人血清进行检测,并对RT-PGR扩增产物进行核苷酸序列测定。[结果]通过实时荧光RT—PCR、RT—PCR 2种实验方法在该病例标本中检出基孔肯雅病毒核酸;对RT-PCR扩增产物进行测序,测出的521个碱基与基孔肯雅病毒核酸序列比对,结果同源性高达99％。[结论]2病例为输入性基孔肯雅实验室确诊病例。     

浙江口岸首次发现入境登革热的实验室诊断

目的确证杭州机场截获发热患者为登革热,为口岸卫生检疫提供技术支持。方法分离患者血清,用ELISA试剂盒检测登革热Ig M抗体;同时提取血清中的病毒核酸,采用登革热通用型实时荧光RT-PCR、RT-LAMP及RTPCR法进行检测,并进行核酸分型检测,同时对RT-PCR的扩增产物进行测序分析。将测序结果与Gen Bank中的其他国家或地区的登革1型病毒株进行比对,分析该病毒的来源。结果血清学检测登革热Ig M抗体为阳性,登革1型病毒RT-LAMP检测结果为阳性,经序列分析该病毒株与印度株(JN940920.1)最为接近,同源性最高,达到97%。结论杭州机场截获的输入性发热患者确证为登革1型病毒感染,该患者为浙江口岸首次发现的输入性登革热。     

河南省2018年输入性登革热的病原监测分析

目的 分析2018年河南省输入性登革热的病原监测情况。方法 利用国家传染病报告信息管理系统,收集2018年河南省登革热疑似病例,开展个案调查同时采集血清,检测登革病毒NS1抗原、IgM和IgG抗体以及病毒RNA;对于病毒RNA检测阳性的样本进行荧光PCR分型诊断和E基因序列扩增,阳性扩增产物测序后进行同源性比对和系统进化分析。结果 2018年河南省累计报告登革热病例29例,均为输入性病例,来自东南亚地区(25/27,92.6%)和非洲地区(2/27,7.4%),以<45岁中青年农民为主,男性明显多于女性,输入性病例时间空间分布分散。29例报告病例中NS1抗原和/或IgM检测阳性的22例。8例病例标本进行核酸检测,其中6例阳性且基因分型成功,其中登革病毒1型、2型各3例。1例由马尔代夫输入的2型登革病毒进行了测序和系统进化分析,与2008年柬埔寨2型登革病毒JF730046一致性最高,属于AsianⅠ基因亚型。结论 2018年河南省输入性登革热病例较2017年明显上升,但未引起河南省本地流行。     

全国首例输入性基孔肯雅病的实验室诊断

目的:通过系统的实验室检测发现并确认全国首例输人性基孔肯雅病例.方法:利用实时荧光RT-PCR、RT-PCR检测方法,并对RT-PCR扩增产物进行核苷酸序列测定.结果:实时荧光RT-PCR、RT-PCR两种实验方法,在同一病例不同时间采集的多份标本中,都检测到基孑L肯雅病毒核酸;对RT-PCR扩增产物进行测序,测出的521个碱基与基孔肯雅病毒核酸序列比对,结果同源性高达99%.结论:该病例为全国首例输入性基孔肯雅病实验室确诊病例.     

江苏省传染性非典型肺炎病原学检测研究

目的:建立传染性非典型肺炎(SARS)实验室检测方法,为SARS病例诊断和现场防治提供依据。方法:用逆转录套式PCR、实时荧光定量PCR检测SARS病毒核酸;酶联免疫法检测血清标本SARS病毒IgM抗体;部分PCR检测阳性或SARS病毒IgM抗体阳性病例的标本进行直接电镜观察;简并引物PCR检测冠状病毒属病毒核酸;鉴别诊断IFA检测血清中肺炎支原体等9种常见呼吸道感染病原IgM抗体,PCR检测军团菌以及甲、乙型流感病毒核酸。结果:检测各类临床标本506份。2003年全省报告临床诊断病例7例,5例检测结果阳性;逆转录套式PCR检测各类标本132份,阳性8份;对其中4份PCR扩增产物(108bp)进行了序列分析,与SARS病毒序列100%同源;实时荧光定量PCR检测各类标本30份,阳性3份;酶联免疫法检测血清标本101份,SARS病毒IgM抗体阳性4份;3个诊断病例的各类标本电镜检查发现冠状病毒样颗粒;IFA检测血清标本75份,嗜肺军团菌IgM抗体阳性9份,乙型流感IgM抗体阳性11份,两者同时阳性3份,其他病原体IgM抗体均为阴性。不明发热病例的标本21份简并引物PCR检测冠状病毒,2份咽拭子标本阳性;漱口液、尿液标本各15份PCR检测军团菌、漱口液25份PCR检测甲、乙型流感病毒结果均为阴性。结论:本研究建立的检测方法与临床诊断有比较好的符合性,对于临床诊断和防治工作具有重要的参考价值。PCR检测SARS-CoV特异性较好,而敏感性有待提高。     

肠道病毒VP1基因定型巢式RT-PCR反应体系建立及评价

目的建立一种快速、灵敏、特异的肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法。方法根据Gen Bank发表的肠道病毒全基因组序列,收集国内外文献,将文献中用于测序分型的引物进行总结分析,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测肠道病毒基因分型的巢式RT-PCR方法。将200株肠道病毒通用阳性,EV71、CA16阴性的临床标本及阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒用该方法进行巢式RT-PCR扩增,随机选择30例PCR产物进行测序,明确本区肠道病毒流行基因型。结果 200份临床病例样本巢式RT-PCR扩增,124例有准确PCR扩增条带,阳性率为62%;阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒均未扩增出条带;23例测序成功,7例比对失败,其中检出16份CA6阳性,阳性率为69.5%,6份CA12阳性,阳性率为26.1%,1份CA10阳性,阳性率为4.3%。结论肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度;本院就诊患儿肠道病毒基因型主要以CA6和CA12型为主。     

重庆口岸输入性登革热病例的分子流行病学调查

目的对2014年重庆口岸首起输入性登革热疫情进行分子流行病学调查,确定病毒的基因型别及感染来源。方法采集2014年重庆口岸首起聚集性输入登革热疑似病例血清样本,进行IgM/IgG抗体检测、核酸检测(实时荧光RTPCR)以及病毒分离;用RT-PCR方法扩增病毒分离株E基因,进行核苷酸序列测定和进化分析。结果共采集21份血清样本,其中4份样本IgM抗体阳性,阳性率为19%,IgG均阴性;9份样本为登革热病毒1型核酸阳性。分离得到4株登革病毒,4株病毒的E基因序列同源性为100%,与印度尼西亚的毒株进化关系最近,同源性为99.1%。结论输入性登革病毒与印度尼西亚的登革病毒1型亲缘关系最近,提示其传染源极有可能在印度尼西亚。     

2019年珠海市登革病毒流行情况及E基因演化分析

目的 通过对2019年珠海市登革热流行病学数据及及登革病毒包膜蛋白基因（E基因）序列进行分析,了解珠海市登革热流行规律和病毒遗传进化特点。方法 2019年珠海疾病预防控制中心采集登革热临床诊断病例的血液标本,对病例进行流行病学调查,磁珠法提取病毒核酸,用Real-time RT-PCR进行检测,阳性标本用RT-PCR扩增E基因并进行测序分型获得的基因序列,采用MEGA6.0软件进行系统进化分析。结果 共收集登革热临床诊断病例185例,实验室诊断病例99例,实验室诊断病例较2018年同期增长154%。其中输入性病例53例,本地感染病例46例,男性61例,女性38例,进入9月份本地感染病例增多,以散发状态为主,其中本地暴发疫情2起;75例成功测序,以DENV-1型为主,占88.00%,全部属于基因Ⅰ亚型,分布在3个不同分支上,分别与2017年越南、2015柬埔寨、2014年马来西亚、新加坡,2012、2014年斯里兰卡等流行株高度同源;DENV-2和DENV-3病例均为输入病例。结论 珠海市登革热主要由东南亚输入,极易发生输入性病例引起本地暴发流行,定期对流行的登革病毒进行序列分析有利于分析该病毒的基因进化方向。     

河北省1例输入性登革热病例的病毒分离及其分子特征分析

目的从疑似登革热病例血清中分离病毒,获取全基因组数据并分析分子进化特征。方法采集河北省1例由柬埔寨输入的登革热疑似病例的血清样本,用胶体金法检测登革病毒IgM和IgG抗体以及NS1抗原;利用Vero E6细胞从血清中分离登革病毒,并采用Real-time PCR对病毒进行分型;扩增病毒全基因片段,将序列与国内外分离株序列进行比对,构建系统发生树。结果胶体金检测显示该病例血清登革病毒IgM、IgG抗体和NS1抗原均为阳性,从早期血清中分离到登革病毒,鉴定为I型登革病毒,分子进化分析揭示该分离株与东南亚地区毒株最为相似,病毒全基因组和E基因核苷酸序列同源性最高达99.99%,而与近年国内其他地区分离株进化关系较远。结论国内登革热的防控依旧需要加强输入性病例的监测。     

南宁市37例登革病毒1型E基因系统进化分析

目的 对南宁市37例登革病毒1型（DENV1）流行株E基因进行序列测定,分析其分子生物学特征,探讨其可能来源。方法 选取2014年12份、2019年25份,共37份经确证为DENV1感染者阳性血浆样本,RT PCR扩增E基因片段,测序后进行同源性比较、系统进化分析。结果 测序后共获得37条长度为1437bp的E基因核苷酸序列,与各参考株E基因序列构建系统进化树后共形成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,3个较大的进化簇,进化簇Ⅰ包括10条2019年DENV1 E基因序列,与参考序列Singapore 2017遗传距离最近,序列相似度99.4%~99.5%;进化簇Ⅱ包括8条2019年DENV1 E基因序列,与参考序列GuangZhou 2018遗传距离最近,序列相似度99.3%~99.5%;进化簇Ⅲ包括7条2019年DENV1 E基因序列和8条2014年DENV1 E基因序列,与参考序列Vietnam 2016遗传距离最近,序列相似度98.4%~98.8%。结论 2019年南宁市输入性DENV1流行株最有可能来源于广州和越南,推断南宁市2019年出现的DENV1本地流行由2014年以来本地进化毒株和新输入毒株共同引起。     

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革1～4型病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革1～4型病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物，并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性，随后对PCR反应条件进行优化，以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照，验证其特异性。并对2003年30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测，阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增，分别获得295、237、118、347bp片段，与设计相符；而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，30份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83．3％(25／30)，其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14／97、G1305／99同源性分别为97％、97％、98％。结论 实验证明，所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革1～4型病毒，为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。     

广州市自然界白纹伊蚊携带登革热病毒情况分析

目的通过对广州地区登革热媒介白纹伊蚊进行携带登革热病毒情况的调查，从传播媒介的角度探索该地区登革热流行的来源和特点。方法采集广州市各区新旧疫点附近的白纹伊蚊幼虫标本，饲养为成蚊后提取蚊虫总RNA，用登革热病毒特异引物经实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）进行病毒核酸检测，并对阳性结果反应产物进行序列测定。结果在荔湾区逢源街（2006年8月）、从化市邓村（2007年4月）和白云区云溪（2007年5月）各检出1宗登革热病毒核酸阳性蚊虫标本。其中荔湾区逢源街和从化邓村标本的RT—PCR产物经过序列测定证实为登革热病毒I型。结论广州地区登革热病毒可能在自然界白纹伊蚊种群中长期存在。     

2型登革病毒基因部分序列测定及氨基酸分析

目的 对登革病毒(DEN)-2贵州分离株的NS1、E基因部分序列进行测定并作氨基酸序列的预测分析。方法 碘化钠-异硫氰酸胍-氯仿法提取RNA，用DENNSl基因区通用引物和DEN-2E基因区特异性引物经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增登革病毒核酸，用纯化PCR产物测序后，用DNASIS软件进行氨基酸序列的预测。结果 DEN-2贵州分离株部分基因测序及氨基酸序列预测结果与DEN-2NGC株比较。分离株的NSl基因区有8个碱基发生点突变和2个位点氨基酸改变，E基因区有1个碱基的插入和1个位点氨基酸改变。结论 DEN-2贵州分离株和NGC株NS1、E基因区基因序列存在差异。     

福建口岸首次截获输入性登革热病例实验室诊断

〔目的〕通过实验室检测发现福建口岸首次截获输入性登革病例,并进行分子追踪溯源。〔方法〕采用实时荧光RT-PCR和RT-PCR检测方法,并对RT-PCR扩增产物进行核苷酸序列分析。〔结果〕从血清样本中检出登革病毒1型核酸,序列分析表明,该病毒株与来自太平洋群岛分离株在系统进化树上最为接近,序列同源性高。〔结论〕福建口岸首次截获输入性登革热病例,病毒株来源于太平洋群岛地区。     

2019年广西7份本地感染登革病毒E基因特征分析

目的 了解2019年广西本地感染登革病毒(Dengue virus,DENV)E基因特性,探索可能的输入来源。方法 采用实时荧光定量PCR（real - time fluorescence quantitative PCR,RT - qPCR）方法对广西本地感染登革热病例急性期血清样本进行病毒核酸检测并分型,扩增登革病毒 E基因后测序,测序结果与不同地区和国家的参考株进行同源性比较和系统进化分析。结果 53份登革热病例血清标本经RT - qPCR分型,结果42份（79.2%,42/53）登革病毒核酸阳性,其中南宁9份、梧州10份、玉林17份、崇左6份,均为DENV - 1型,其余11份为登革病毒核酸阴性,42份DENV - 1型阳性核酸样本经过E基因扩增共得到7份,其中南宁市1份、梧州市1份、玉林市2份、崇左市3份,进化分析结果显示7份样本均为DENV - 1型Genotype Ⅰ基因型,其中DENV1/GXNN/007/2019、DENV1/GXWZ/009/2019、DENV1/GXYL/011/2019、DENV1/GXYL/012/2019与2019年广东株（序列号:MN921500）同源性99.94%～100.00%,DENV1/GXCZ/015/2019、DENV1/GXCZ/016/2019、DENV1/GXCZ/017/2019与 2015年印度尼西亚株（序列号:MG894852）同源性达99.60%,与1945年夏威夷参考株（序列号:AF425619）比较存在12处氨基酸位点变异。结论 2019年广西登革病毒是Genotype Ⅰ基因型,推测病毒从广东和东南亚国家输入导致的本地流行,应加强登革热跨省、跨境传播的防控。     

登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备

目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫B...     

2016年-2018年浙江省义乌市输入1型登革病毒分子溯源分析

目的对2016年-2018年义乌市输入1型登革热病例进行实验室检测与分子溯源分析。方法采集登革热病例急性期血清标本进行NS1抗原和核酸检测,用RT-PCR法扩增包膜蛋白(Envelope protein,E)基因,测定核苷酸序列并进行系统进化分析。结果6例登革热病例NS1抗原和核酸检测结果均为阳性。6株毒株之间的E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96.6%~99.3%和98.8%~100%,系统进化分析显示,E基因序列均属于登革病毒1型的GⅠ亚型,与东南亚2003年-2016年分离病毒株亲缘关系最近。结论2016年-2018年义乌市输入登革病毒1型的亚型主要为GⅠ亚型,输入来源主要为东南亚国家。     

登革2型病毒感染小鼠体内病毒迁移及分布

目的 观察登革病毒在感染动物模型体内的迁移和分布特点，了解登革病毒的感染致病机制。方法 以2型登革病毒新几内亚(NGC)株和临床分离株病毒悬液皮下注射，建立登革病毒感染的小鼠模型。于感染后不同时间采集小鼠血浆、肝、脾、肾、脑等脏器组织，用病毒分离及RT-PCR方法检测病毒的存在。结果 2株2型登革病毒感染小鼠后，在小鼠血浆、肝脏、脾脏、肾脏和大脑组织中均可检测到病毒，病毒在脑组织中持续存在的时间最长，在肝脏中滞留时间最短。临床分离株感染小鼠体内病毒持续时间较NGC株长。结论 登革病毒感染后病毒呈全身性多脏器组织分布，临床分离株的致病作用较NGC株强。