海藻糖对乳酸杆菌耐热和室温贮存保护作用的研究

乳酸杆菌不耐高温和室温贮存是其应用于饲料添加剂的一大限制因素,本试验旨在研究5%(W/V)的海藻糖对三株乳酸杆菌在高温处理和室温贮存条件下的保护作用。结果表明:海藻糖能显著提高乳酸杆菌耐热性和室温贮存的存活率,且不同菌株抗逆性能不同,其中F22菌株表现出较G31和H51两株菌更好的耐热性和耐贮性。添加海藻糖保护的F22菌株70℃处理5 min,活菌数为(6.0±0.1)×10~5cfu/m L,对照组为(1.2±0.1)×10~2 cfu/m L;室温贮存15 d,添加海藻糖的试验组存活率为(127.94±0.23)%,对照组为(89.45±0.78)%。由此可见,海藻糖可作为微生态制剂高温加工和室温贮存的保护剂,提高乳酸杆菌的耐热性和延长保质期。     

犬细小病毒悬浮培养工艺研究

研究旨在证明犬细小病毒(CPV)悬浮培养的可能性,提高CPV P6株抗原的病毒含量,降低转瓶生产不同批次间疫苗质量差异,生产质量稳定的疫苗产品。试验利用大孔的纤维编织物BioNOCⅡ型微载体所提供的巨大表面积,实现Vero细胞高密度培养,建立了Tide-cell生物反应器大规模培养CPV P6株抗原制备工艺。结果显示：生物反应器Tide-cell载体罐内接入1.0×10¹⁰个F81种子细胞,在优化的参数条件下培养,用RPMI 1640培养液经过96 h培养,细胞总数为1.0×10¹¹个;在葡萄糖消耗量约为5 g/(L·h)时,按照病毒感染复数(MOI)=0.02将生产种毒CPV P6株接入Tide-cell微载体细胞培养瓶内,补加含8%血清的RPMI 1640病毒维持液至50 L,调整pH值为7.2～7.3,培养48 h收获,病毒含量至少为10^7.43 TCID50/mL。     

一株MDBK细胞的低血清悬浮驯化研究

研究选取一株背景清晰、纯净的MDBK贴壁细胞,通过直接驯化和逐级降低血清相结合的办法,获得了一株可以在低血清培养基中全悬浮培养的MDBK细胞。该细胞在含0.5%胎牛血清的培养基中悬浮培养48 h后的细胞密度稳定在5.0×10⁶/mL以上,培养72 h后细胞密度最高可达1.16×10⁷/mL,且细胞形态良好,活力在93%以上,具有良好的传代稳定性。应用筛选获得的悬浮培养MDBK细胞株分别接种伪狂犬病毒和传染性牛鼻气管炎病毒后,检测病毒敏感性。细胞在24 h均发生了皱缩,72 h大部分死亡。悬浮培养的MDBK细胞对传染性牛鼻气管炎病毒的滴度在24 h达到最大值107.6TCID50/mL,对伪狂犬病毒的滴度在48 h达到最大值107.6 TCID50/mL,说明虽然细胞的培养方式发生了改变,但并没有影响上述两种病毒在该细胞上的增殖特性。对MDBK细胞的全悬浮驯化研究可为相关病毒类疫苗规模化生产及工艺的升级改进提供细胞学基础资料。     

微载体灌注培养Marc-145细胞制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗

对在生物反应器中用微载体连续灌注培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸综合征病毒的制备技术进行了研究.在14 L体积的生物反应器中,加入含10 g/L微载体的细胞培养基DMEM,接种Marc-145细胞至细胞浓度为1×105/mL,培养4d后细胞可生长至5～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种PRRSV PC株病毒,接毒后36 h开始收获,连续收获3d左右,收获的病毒滴度范围在106.0～ 1073TCID50/mL之间,将收获的病毒液加入适量的保护剂,经冷冻干燥制备成疫苗,无菌、支原体等项目的检验均合格,3批疫苗的免疫保护率均为5/5.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养Marc-145细胞制备PRRS疫苗工艺可行.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株最小免疫剂量的测定

将35头40日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗原及抗体均为阴性的健康仔猪,随机分成7组,每组5头,命名为XJ1~XJ7组。XJ1~XJ6组分别免疫PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株,接种剂量分别为102TCID50/头、103TCID50/头、104TCID50/头、105TCID50/头、106TCID50/头和107TCID50/头,XJ7组为对照组,按1mL/头剂量接种DMEM。各试验组在免疫后28 d,用3×104.0TCID50/头剂量感染HP-PRRSV HuN4第5代强毒,疫苗免疫和攻毒后观察和检测各组试验猪的免疫效果。结果表明:攻毒前XJ2-XJ6组PRRSV ELISA抗体在免疫后14 d全部转为阳性,XJ1组在免疫后21 d转为阳性,但维持在较低水平;XJ2-XJ6组针对标记基因NP49的特异性抗体在免疫后28 d转阳性。攻毒后对照组全部发病,且死亡2头,XJ1有4头发病,XJ2-XJ6组无发病和死亡,本研究结果表明PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株对仔猪提供免疫保护的最小免疫剂量为103TCID50/头。     

肉羊鲜精常温保存技术的研究

试验研究常温下不同含量的卵黄(5、10、15、20、25 mL)和海藻糖(0.5、1.0、1.5、2.0,2.5、3.0 g)对肉羊鲜精保存时间的影响。在20～25℃,选取10只体征基本一致的种公羊,每只羊进行3次重复试验。结果表明:10 mL卵黄条件下,精子活率连续4 d均高于其他4个卵黄含量,且第4 d精子活率在50%以上;2 g海藻糖条件下,精子活率除第3 d低于1.5 g海藻糖以外,其他时间段均为最高,且第4 d精子活率在50%以上。因此,鲜精常温保存剂中卵黄和海藻糖的最适含量分别为10 mL和2 g。     

J亚群禽白血病病毒TCID_(50)不同测定方法的比较

为比较不同方法在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)组织细胞半数感染量(TCID50)上的差异,将ALV-J传染性克隆r NX0101株同一病毒保存液以10倍梯度稀释后按照常规方法分别接种已长满DF-1细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,维持7 d后取所有细胞培养上清以ALV-p27抗原检测试剂盒检测p27抗原,细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体JE9进行间接免疫荧光(IFA)检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算两种方法在两种细胞上的TCID50。结果显示,ELISA法测定该病毒在DF-1细胞和CEF细胞上的TCID50分别为10-5.4TCID50/0.1 m L和10-4.666TCID50/0.1 m L,而IFA法测定该病毒在DF-1和CEF细胞上的TCID50分别为10-6.333TCID50/0.1 m L和10-5.2TCID50/0.1 m L。结果表明,IFA比ELISA具有更高的灵敏度,并且ALV-J在DF-1细胞上复制能力比CEF更强,在DF-1细胞上测定ALV-J的TCID50更为科学。     

核酸杂交技术在禽白血病病毒TCID_(50)测定中的应用

为探索核酸杂交技术在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)细胞半数感染量(TCID50)中的可行性,将ALV-J传染性克隆r NX0101株以10倍梯度稀释后按常规方法接种已长满单层鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,在维持7 d后收集细胞培养上清。上清液部分按照试剂盒说明书进行p27抗原的ELISA检测,另一部分提取RNA后以鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒进行Dot-blot检测,每孔中细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体进行IFA检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算三种方法测定的TCID50。结果显示ELISA法、IFA法和Dot-blot法在确定病毒感染中能够相互验证和补充,该病毒在CEF的TCID50分别为10-4.7TCID50/0.1 m L、10-5.2TCID50/0.1 m L和10-5.3TCID50/0.1 m L。表明采用Dot-blot法测定ALV-J的TCID50是可行的,不仅能够排除内源性的干扰,并且比ELISA和IFA具有更高的灵敏度。     

聚乙二醇可提高包被抗原的稳定性

为了筛选抗原封闭液中聚乙二醇(PEG4000)的适宜浓度,首先用狂犬病病毒(Rabies virus,RV)细胞培养物包被抗原板,以含1%BSA和5%蔗糖的PBST溶液中加入不同浓度的PEG作为封闭液,分别于4℃、37℃保存7,14,30,90,180 d,从中筛选含适宜浓度PEG的封闭液,然后分别用乙肝表面抗原(HBsAg)、猪瘟病毒E2抗原(CSFV E2)和猪繁殖与呼吸综合征nsp2基因(PRRSV nsp2)原核表达产物作为包被抗原,对所筛选出的封闭液进行稳定性评价。结果表明:当封闭液为含12%PEG+1%BSA+5%蔗糖的PBST时,上述4种抗原包被板均可在37℃稳定保存180 d。由于该封闭液对不同来源抗原所具有的良好稳定性,初步推断该封闭液可能具有较广泛的应用前景。     

微载体培养BHK-21细胞生产狂犬病毒Flury株的研究

本文主要研究了利用生物反应器Tide-Cell微载体培养的BHK-21细胞生产狂犬病毒Flury株工艺。总数为1×1010个BHK-21细胞接入装有500 g BioNOCTMⅡ型载体的Tide-Cell培养系统,最适条件下培养120 h。当细胞培养系统中葡萄糖消耗量达到8 g/(L·h)左右,细胞数达到4×1011时,按照MOI为1接入Flury株病毒。一批至少可以收获10次(50 L/次)毒价高于107.5TCID50/mL的抗原液,其中包含5次毒价为108.0TCID50/mL的抗原液。提高抗原液病毒含量有助于提升狂犬病灭活疫苗效价,从而降低生产成本。     

酸奶生产用直投式乳酸菌发酵剂研究

对酸奶常用发酵剂菌种德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种S-1、嗜热链球菌G1208的高密度细胞培养条件,低温真空冷冻干燥中抗冷冻保护剂的选择等进行了研究。结果发现,德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种S-1在改良MRS培养基中的最佳培养条件为:培养温度43℃,起始pH值6.0,最高活菌数为1.2×109cfu/mL;采用3%蔗糖+3%海藻糖+10%β-环糊精+10%甘油+1%酵母膏+10%脱脂奶作为冻干保护剂,经低温冷冻干燥后,存活率为40.8%。嗜热链球菌G1208的最佳培养条件为:培养温度37℃,起始pH值7.0,对培养基配方进行优化后,最高活菌数为1.7×109cfu/mL;采用3%海藻糖+1%酵母膏+10%脱脂奶作为保护剂经低温冷冻干燥后,存活率可达96%。     

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)最小免疫剂量的研究

为了确定猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)的最小免疫剂量,本研究将3批猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)分别稀释成10TCID_(50)/mL、102.0TCID_(50)/mL、103.0TCID_(50)/mL,每批疫苗各个稀释度分别免疫仔猪1.0 mL/头,并设攻毒对照组和阴性对照组。免后10 d连同攻毒对照组用伪狂犬病病毒GD1株进行攻毒保护试验,阴性对照组不攻毒。结果表明,10TCID_(50)/头和102.0TCID_(50)/头的免疫剂量在免疫后10 d依然无法提供完全的免疫保护,保护率为20%～80%(1/5～4/5);103.0TCID_(50)/头的免疫剂量能够保护仔猪抵抗PRV强毒的攻击,保护率为100%(5/5);攻毒对照组发病率为100%(5/5),死亡率为80%(4/5);阴性对照组全部健活。由此确定猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)最小免疫剂量为103.0TCID_(50)/头。     

蛹虫草多糖对鸡脾脏淋巴细胞的影响

试验将7种浓度蛹虫草多糖(CMP)单独或与刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)同时加入鸡脾脏淋巴细胞的培养体系中,培养48 h时用MTT法测定淋巴细胞增殖(A570值)的变化;将5种浓度的CMP 40%乙醇提取物(CMP40)、CMP 50%乙醇提取物(CMP50)分别与ConA加入到鸡脾淋巴细胞的培养体系中,培养24 h后收集细胞培养上清液,测定白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)的含量。结果显示,CMP在31.25~2 000μg/mL时,CMP40+ConA组的A570值显著高于ConA对照组;CMP在31.25~500μg/mL时,CMP50+ConA组A570值显著高于ConA对照组,CMP40+LPS组、CMP50+LPS组的A570值显著高于LPS对照组;CMP40在125~1 000μg/mL时、CMP50在500μg/mL时,各多糖组的A570值显著高于细胞对照组;CMP40和CMP50在250~1 000μg/mL时,各多糖组的IL-2和IFN-γ浓度显著高于对照组。结果表明,CMP40和CMP50在合适的剂量能单独或协同ConA、LPS刺激鸡的T、B淋巴细胞增殖,促进淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ,从而增强鸡的细胞免疫能力。     

EGM吸附ZEN对鸡外周血淋巴细胞的保护效应

吸取500μL含0.1亿个/mL鸡外周血淋巴细胞的细胞悬液,分别加入2个24孔细胞培养板的32个孔内,每4个孔为1组,共设8组:第1组为空白对照组,每孔加入500μL RPMI-1640完全培养液;第2组每孔加入500μL含10μg/mL玉米赤霉烯酮(ZEN)的培养液;第3~5组每孔分别加入500μL含0.01%、0.20%和0.30%酯化葡甘露聚糖(EGM)的培养液;第6~8组每孔分别加入500μL含0.01%、0.20%和0.30%EGM,均含10μg/mL ZEN的培养液;第2~8组ZEN质量浓度为5μg/mL;第3和6组、第4和7组及第5和8组的EGM含量分别为0.05%、0.10%和0.15%。37℃,5%CO2培养72 h后,检测培养液中白细胞介素-2(IL-2)、α干扰素(IFN-α)和丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活性及淋巴细胞转化率。结果表明:空白对照组、培养液中加入0.05%~0.15%EGM及培养液中加入5μg/mL ZEN和0.05%~0.15%EGM组,IL-2和IFN-α含量、SOD活性及淋巴细胞转化率均显著高于培养液中加入5μg/mL ZEN,MDA含量显著低于培养液中加入5μg/mL ZEN。培养液中加入0.10%和0.15%EGM后,IL-2和IFN-α含量显著高于空白对照组。由此表明:EGM对淋巴细胞增殖无不良影响,并能通过吸附ZEN有效地减轻ZEN对淋巴细胞的损伤。     

猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备及攻毒保护研究

为研究现用猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777疫苗毒株对流行毒株的免疫保护效果,以RTPCR进行PEDV CV777疫苗株、JS12流行株S基因克隆测序,进行PEDV S基因核酸序列分析与氨基酸序列分析。分别以转瓶工艺与细胞悬浮培养工艺培养Vero E6细胞,制备PEDV CV777株转瓶灭活苗与悬浮灭活苗。分别以PEDV转瓶灭活苗、悬浮灭活苗、PEDV流行株组织灭活苗(JS12株)产前30d免疫经产母猪;母猪产仔后14d进行仔猪攻毒保护试验。核酸序列分析显示,PEDV CV777株S基因与流行毒株的相似性在96.4%~99.7%之间,氨基酸序列相似性在96.7%~99.5%之间。转瓶工艺制备PEDV抗原效价为107.0 TCID50/mL,悬浮培养制备PEDV抗原效价为108.5 TCID50/mL。攻毒保护试验显示,悬浮灭活苗免疫母猪后,仔猪有2/10发病,保护率为8/10,转瓶灭活苗组发病率为8/10,保护率仅为2/10;组织灭活苗组9/10发病;对照组10头全部发病。该试验证明,提高PEDV CV777株的抗原含量,能够有效提高疫苗对PEDV流行毒株的保护效果。     

牛传染性鼻气管炎病毒JZ06-8株犊牛感染模型的建立

为建立IBRV对犊牛的感染模型,将试验组第1组~3组犊牛通过鼻腔内喷雾接种4mL/头,病毒含量分别为107.0 TCID50/mL、106.0 TCID50/mL和105.0 TCID50/mL的IBRV/JZ06-8,阴性对照组同样方法接种MDBK细胞冻融物;攻毒后第0天~第14天,每天测定直肠温度,进行临床观察,采集鼻拭子进行病毒分离鉴定。结果显示,鼻内喷雾接种对犊牛可产生有效感染,106.0 TCID50/mL的感染剂量即可致犊牛产生典型的IBR临床症状,并可分离到IBRV。试验成功实现IBRV/JZ06-8对犊牛的感染,该模型可用于IBRV研究和IBR疫苗评价。     

5株水貂阿留申病毒的分离与鉴定

为给水貂阿留申病疫苗的研制奠定基础,对疑似感染阿留申病死亡的水貂内脏处理后,接种猫肾传代细胞（CRFK）分离病毒,并对分离的毒株进行PCR鉴定及动物回归试验。与此同时,首次应用免疫过氧化物酶单层细胞实验（IPMA）对所分离的水貂阿留申病毒进行TCID50的测定。结果成功分离并鉴定出5株水貂阿留申病毒株,分别命名为ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-ZJ3、ADV-QD2、ADV-QD3,各分离株的TCID50分别为105.7TCID50/ml、105.0TCID50/ml、104.6 TCID50/mL、105.2 TCID50/mL、104.1 TCID50/mL。动物回归实验显示,所分离的病毒对水貂具有致病性,为水貂阿留申病毒强毒株。     

自制貉源抗血清治疗犬瘟热病的研究

应用含有104.5TCID50/0.1 mL犬瘟热弱毒培养物4 mL免疫特种经济动物乌苏里貉,10 d后采集血液分离血清,病毒用200TCID50与等量连续倍比稀释的血清和经饱和硫酸铵粗提的免疫球蛋白做中和试验鉴定抗体的效价,并对上述2种抗体效价进行比较。结果表明,2917倍稀释全血清、2344倍稀释饱和硫酸铵粗提的免疫球蛋白能保护50%Vero细胞不出现CPE。临床应用全血清治疗24只患犬瘟热病的白貉,22只成活。由此说明可以应用狐貉等特种动物制备的抗血清治疗犬瘟热病。     

水栀子多糖提取物对感染猪圆环病毒2型的RAW264.7细胞氧化应激的调节作用研究

为了研究水栀子多糖提取物(Gardenia jasminoide var.radicans polysaccharide extract, GJPE)对猪圆环病毒2型(PCV-2)感染的RAW264.7细胞氧化应激的调节作用,试验采用ELISA法测定了GJPE对RAW264.7细胞的安全浓度;将RAW264.7细胞分为空白对照组、维生素C组、不同浓度(安全浓度范围)GJPE组,分别加入到96孔细胞培养板(1×10⁶ 个/mL)和24孔细胞培养板(2×10⁵ 个/mL)中,除空白对照组加基础培养基外,其他各组分别加入1×10³ TCID₅₀ PCV-2病毒液,并设置PCV-2组(只添加PCV-2病毒液)作为病毒对照组,100μL/孔(96孔细胞培养板)或500μL/孔(24孔细胞培养板),培养24 h;吸弃上清液,用PBS洗涤3遍,空白对照组和PCV-2组分别加入基础培养基,维生素C组加入200μmol/mL维生素C,不同浓度GJPE组分别加入相应浓度GJPE[100μL/孔(96孔细胞培养板)或50...     

异亮氨酸缓解轮状病毒攻毒断奶仔猪十二指肠结构和功能的研究

为探究异亮氨酸(Isoleucine,Ile)对轮状病毒(RV)攻毒的断奶仔猪腹泻评分及十二指肠肠道形态和功能的影响,本试验采用2×3双因子交叉设计,第1个因素为基础日粮中Ile水平(0、0.5%、1.0%),第2个因素为RV攻毒与否。选取21日龄体重相近的健康断奶仔猪48头(杜×长×大),随机分为6个处理组,每个处理8个重复,每个重复1头猪。第1、2组饲喂基础日粮,第3、4组为基础日粮+0.5%Ile,第5、6组为基础日粮+1%Ile。在饲喂第14天时,所有仔猪灌服100 mmol/L碳酸氢钠溶液5 mL,20 min后,第2、4、6攻毒组进行灌服RV 5 mL(10⁶ TCID₅₀/mL)攻毒处理,第1、3、5组灌服生理盐水5 mL。攻毒后饲喂日粮不变,在试验第18天进行采样。结果显示：攻毒试验前14 d Ile试验组的腹泻指数与对照组相比差异不显著,在试验15～18 d时RV攻毒对照组断奶仔猪的粪便评分指数显著高于试验组,通过Ile的治疗断奶仔猪的粪便评分指数有降低的趋势,Ile与RV具有交互作用。在Ile处理下,试验组十二指肠的绒毛高...