实时荧光PCR法检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的研究

近年来,包装饮用水中铜绿假单胞菌超标的现象时有发生,运用国家安全标准方法进行检验,过程烦琐,周期较长,不利于监管。然而,实时荧光PCR检验法具有灵敏、快速、准确等优点,被广泛应用于各种检验检测中。本文采用实时荧光PCR法,利用特异性引物和探针对目标基因进行扩增。然后通过实时荧光PCR法对其他5种细菌和梯度含量的铜绿假单胞菌菌悬液进行检测,验证方法的特异性和灵敏度。结果表明,只有铜绿假单胞菌的实时荧光PCR检测结果为阳性,其他细菌的检测结果为阴性,说明本方法对铜绿假单胞菌的特异性较好,方法的灵敏度为1×10³ CFU·mL^-1。同国家安全标准方法相比,实时荧光PCR法所用时间更短,明显提高了检测效率。     

包装饮用水中铜绿假单胞菌实时荧光定量PCR快速检测

目的:有效弥补传统微生物学检验方法的缺陷。方法:针对GB 8538—2022中铜绿假单胞菌的毒力基因pcrL和16S rRNA基因的V3～V4区保守序列设计合成引物和探针,建立实时荧光PCR方法。结果:该方法可以有效扩增常见标准储备菌株的16S rRNA基因,且对铜绿假单胞菌标准储备菌株的毒力基因pcrL的检测效果良好,观察到明显的“S”型扩增曲线,但对常见的食源性致病菌无扩增曲线。当菌液浓度<10 CFU/mL时,pcrL基因仍有扩增曲线,其检测范围为10～10⁷ CFU/mL,检测限为10 CFU/mL;不同菌液浓度下毒力基因pcrL的Ct平均值为18.0～38.6。对近3年湖南省14个县、市抽查检验(瓶)桶装水中铜绿假单胞菌不合格样品进行进一步检测,符合率达到100%。结论:该方法对铜绿假单胞菌携带毒力因子pcrL检测的灵敏度较高;且操作简便、特异性强,具有良好的实用性。     

实时PCR检测食品中荧光假单胞菌方法的建立

针对荧光假单胞菌分子检测靶点gyrB基因设计引物和探针,制备标准质粒,绘制标准曲线,建立荧光假单胞菌实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测体系。特异性评价表明该体系能够特异性检测荧光假单胞菌,其他细菌均无检出。灵敏性检测结果表明纯DNA水平灵敏度可达14.3 fg/μL,纯培养物水平上检测灵敏度为3.0×102 CFU/mL。抗干扰性实验结果表明当加入低浓度背景干扰菌时,对上述体系检测灵敏度没有影响。人工污染样品检测表明适当增菌可检测到荧光假单胞菌,说明Taq Man探针real-time PCR法特异性强、灵敏度高、抗干扰性能力强。     

实时荧光环介导等温扩增检测铜绿假单胞菌

目的建立一种实时荧光与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)相结合的铜绿假单胞菌检测方法。方法利用铜绿假单胞菌的外毒素A基因(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, PEA)序列,设计LAMP引物,对该方法的特异性、灵敏度及其在人工污染矿泉水中的检出限进行评价。结果该方法与其他菌株无交叉反应,特异性强,对纯菌液和人工污染矿泉水的检出限均可达到5.2 CFU/mL。结论该方法快速、灵敏、操作简便,为水样中铜绿假单胞菌的检测提供了一种有效的手段。     

食品中椰毒假单胞菌酵米亚种实时荧光PCR检测的研究

目的建立食品中椰毒假单胞菌酵米面亚种实时荧光PCR检测方法。方法根据椰毒假单胞菌酵米面亚种16S～23S rRNA基因片段序列,用Oligo7设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,摸索最佳退火温度,最佳引物和探针浓度,建立椰毒假单胞菌酵米面亚种实时荧光PCR检测方法。通过对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌以及22种其他标准菌株进行实时荧光PCR检测,验证本法的特异性和抗干扰性。同时从菌液浓度和DNA浓度水平上进行研究,确定该检测方法的灵敏度。结果用该方法检测23种菌,除唐菖蒲伯克霍尔德氏菌外,其他22种细菌均为阴性。抗干扰性试验显示杂菌对检测结果不影响,本法抗干扰能力强。通过灵敏度试验的研究,确定本法检测椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌液灵敏度为1×10~2 CFU/mL,DNA灵敏度为250 fg/μL。结论本试验设计的引物和探针具有较强特异性、抗干扰性以及灵敏度,该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌

目的 建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测方法。方法 针对选择铜绿假单胞菌gyrB基因设计特异性引物和探针。250mL水样经膜过滤后经过短时培养(36℃、4 h),优化提取菌体DNA流程,预冻干聚合酶链式反应预混液,采用实时荧光聚合酶链式反应进行检测。结果 样品中铜绿假单胞菌量为≥1 CFU/250 mL时,检测结果均呈阳性,整个检测用时6 h左右。该方法检测结果与国家标准方法(GB8538—2022)检测结果一致。结论 该方法特异性强、灵敏度高、用时短,可为预包装饮用水中铜绿假单胞菌监管和生产企业质控提供更为快速、精准的技术手段。     

桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较

分别采用传统国标GB/T 8538-2008方法、基于OprL基因的PCR方法和环介导等温扩增(LAMP)方法检测桶装水中的铜绿假单胞菌,比较三种方法的检测效果.结果显示,采集的46份市场水样中,用传统GB8538-2008方法检出了3份阳性样品,检出率为6.5％,检测时间至少2天;而PCR和LAMP方法都检出4份阳性...     

饮用水中铜绿假单胞菌快速检测的研究进展

铜绿假单胞菌是一种条件致病菌,广泛存在于各类水体环境中,对消毒剂、紫外线等因素具有很强的抵抗力,可引起急性肠道炎等各种疾病。本文主要阐述了5种饮用水中铜绿假单胞菌快速检测技术的优点和具体应用,可为饮用水中铜绿假单胞菌的检验检测和质量控制工作提供参考。     

铜绿假单胞菌对食品中沙门氏菌检测 干扰作用的评价

目的评价铜绿假单胞菌作为干扰菌对食品中沙门氏菌准确检出的影响。方法在无菌奶粉样品中人工污染不同浓度的沙门氏菌(1~100 CFU/10 g)和铜绿假单胞菌(0~10~6 CFU/10 g),参照GB4789.4-2010进行检测,同时利用全自动酶联免疫检测系统(VIDAS30)和全自动病原微生物检测系统(BAX Q7 System)对样品进行快速筛查,以此综合评价铜绿假单胞菌作为干扰菌对沙门氏菌检测过程的影响。结果在不同浓度的铜绿假单胞菌干扰下,VIDAS和BAX系统均能够准确筛查出沙门氏菌阳性样品;使用的3种选择性平板对沙门氏菌和铜绿假单胞菌的分离效果存在差异,XLD平板优于BS平板和科玛嘉CAS平板,其中铜绿假单胞菌和沙门氏菌在科玛嘉CAS平板上具有相似的显色情况,直接影响沙门氏菌的检测结果;BPW前增菌8 h沙门氏菌的平板分离效果优于前增菌18 h。结论研究表明,铜绿假单胞菌在选择性平板分离步骤时对沙门氏菌具有干扰作用。联合使用2种以上沙门氏菌选择培养基,才能保证沙门氏菌的准确检出。VIDAS和BAX可作为沙门氏菌快速筛查的可靠技术手段。     

食品中荧光假单胞菌双重PCR法检测体系的建立和评价

根据荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)促旋酶(gyrase)的B亚单位基因以及金属蛋白酶(apr)基因设计出两对引物,经过反应条件的优化,建立了用于荧光假单胞菌快速检测的双重聚合酶链式反应(PCR)方法,并对该体系进行评价。结果显示,Pseudomonas fluorescens菌株经普通PCR扩增均可见2条特异性条带(384 bp和194 bp),而其它阴性对照菌株PCR扩增均为阴性。基于基因组DNA的双重PCR检测灵敏度为16.9 fg/μL(3~4拷贝/μL),1.8CFU/m L的UHT牛奶样品(250 m L)经增菌24 h后用该双重PCR方法均可检出。本研究建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏度,能克服乳制品样品基质的干扰,可应用于乳制品中荧光假单胞菌的快速检测。      

利用实时荧光PCR方法检测转Bt基因大米

应用实时荧光PCR技术对转基因大米进行了定性和定量检测研究.本研究以转基因B163大米为材料,采用TaqMan探针技术,对大米中的内源基因蔗糖磷酸合酶SPS和转基因水稻中普遍存在的外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子以及苏云金芽孢杆菌(Bacillusthndngiemis,简写为Bt)杀虫晶体蛋白基因Cry1Ac进行了实时荧光PCR研究,并对外源基因Cry1Ac进行了定量检测和敏感性分析.该实时荧光PCR方法检测结果和常规PCR结果一致,同时不用进行凝胶电泳,更为快速、简便,降低了污染机会,可用于转Bt基因大米的定性和定量检测.     

实时荧光PCR技术定量检测转基因豆粉的研究

本实验以美国、阿根廷、巴西豆粉、中国豆粉和转基因大豆粉标准品为材料,利用设计的特异性引物和探针,建立了实时荧光定量PCR 技术检测抗草甘膦转基因豆粉的方法,成功检测出美国、阿根廷、巴西抗草甘膦转基因豆粉和中国豆粉的转基因含量分别为5.37%、3.96%、2.26% 和0,确定了荧光PCR 技术检测抗草甘膦转基因豆粉的灵敏度为0.001%,稳定性良好。     

通用型酵母菌实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测鉴定食品中酵母污染菌实时荧光PCR法,根据酵母基因序列设计出通用型探针和引物,建立了运用实时荧光PCR法检测酵母的反应体系和反应条件,进而对该方法进行特异性验证,灵敏度分析及稳定性评价,并应用于产品样本的检测。特异性试验表明,酵母菌检测结果均为阳性,而细菌、霉菌均为阴性,荧光PCR检测结果的特异性为100%。灵敏度试验表明,酵母菌检出限在760 cfu/m L。稳定性试验表明,酵母菌组内实验CV在0.62~0.81%之间波动,而组间实验在0.43~0.77%之间波动。通过样品增菌检测发现在培养12 h后能检出阳性。本研究所建立的实时荧光PCR法特异性好、灵敏度高、稳定性好,具有快速、简便的特点,为快速检测食品中酵母污染提供新的方法和途径,具有很好的研究价值和应用前景。     

果汁中梨成分分子生物学鉴伪-实时荧光PCR方法研究

根据不同植物品种中类甜蛋白基因内含子的差异性,克隆梨类甜蛋白基因内含子,并根据其序列设计梨特异性扩增引物.通过对苹果、梨、桃等多种水果成分的特异性筛选,建立梨成分的实时荧光PCR检测方法,该方法对梨DNA的检测低限为10 pg/μL.用该方法检测几种常见的果汁样品(梨汁、梨果肉饮料、苹果汁、苹果果肉饮料、桃汁),结果表明,能够检测到果汁中的梨成分.该法可用于果汁或食品中梨成分的鉴别.     

Detection of Cashew Nut in Foods by a Specific Real-time PCR Method

Appropriate detection methods have to be provided to assure the compliance with the recently established regulatory provisions concerning the labeling of allergens in food. Therefore, a novel real-time polymerase chain reaction (PCR) system for the specific and sensitive detection of cashew nut (Anacardium occidentale) was developed. Specificity was checked against DNA from 56 plant and animal species to avoid cross-reactivity to phylogenetically related and other food-relevant organisms. The absolute limit of detection (LOD) was determined to be 0.5 pg genomic cashew DNA and 10 copies, respectively, and the practical LOD examined exemplarily for pesto Genovese was 2 mg/kg. In addition, analysis of different retail samples was performed to demonstrate the suitability of the new assay for manifold applications.     

实时荧光环介导等温扩增技术检测猪肉中的假单胞菌

根据假单胞菌16S rDNA基因序列设计引物,并向反应体系中加入饱和型核酸染料Eva Green,利用实时荧光检测仪,建立假单胞菌属实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)。研究中对62株假单胞菌的16S rDNA基因通过DNAMAN软件进行序列比对后,针对共有片段设计扩增引物。对扩增体系进行了优化,优化结果经电泳鉴定。通过12株假单胞菌和23株非假单胞菌进行特异性验证,并比较了实时荧光LAMP与普通LAMP的灵敏度,对人工污染样品的检出限进行了测定。结果表明,特异性验证中12株假单胞菌为阳性,23株非假单胞菌为阴性。实时荧光LAMP检测纯菌的灵敏度为36 CFU/mL,是普通LAMP灵敏度的10倍。人工污染样品的检出限为1.73×10~3 CFU/g。本研究中建立了一种检测冷鲜猪肉中假单胞菌属的方法,实现了多个菌种的同时检测,避免了单一菌种检测的局限性,该方法快速、准确、灵敏度高,可在2 h内完成冷鲜猪肉中假单胞菌的检测。     

基于实时荧光定量PCR和数字PCR的肉制品中牛源性成分检测

为了能够快速有效的检测出肉制品中牛源性成分,采用实时荧光定量PCR和数字PCR检测方法,检测肉制品中牛源成分。先依据牛肉单复制基因组特异区域,通过多序列比对设计特异性引物与探针,再利用苯酚-氯仿法提取标准品基因组DNA,确立实时荧光定量PCR和数字PCR两种方法的反应条件,测定DNA模版纯度及浓度可得实验提取的DNA溶液不含杂质,在此基础上构建牛源性成分荧光定量PCR标准曲线,检测两种方法的特异性、抗干扰性与肉制品中牛源性成分。分析实验结果可知,引物与探针在两种方法中均对牛肉有荧光信号显示,两种方法具有牛源性特异性,检测数值与实际样品数值基本一致,且两种方法抗干扰性较好,当存在其他肉类干扰时,仍可准确监测出牛源性,两种方法的最大误差分别为3.8%和4.0%;可定量检测不同肉制品中牛源性成分,两种方法均未检测出样品10牛肉丸中牛源性成分,验证了市面上确实存在假肉情况。说明所用方法能够准确、快速地检测出肉制品中的牛源性成分,适用于市场中肉制品的检测,对保障消费者的权益和健康具有十分重要的意义。     

乳中志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为了快速、有效的检测乳中的志贺氏菌,建立一种特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,对提取的志贺氏菌DNA模板进行PCR扩增,对目的基因进行克隆和测序,然后利用荧光定量PCR方法,对志贺氏菌进行检测,确定其扩增条件。建立的方法特异性强,检测的灵敏度可达到10-6 ng/μL。利用建立的方法可检测乳中2.84 cfu/mL的志贺氏菌。该方法为快速、准确检测乳中的志贺氏菌提供了参考。     

腊肠中植物成分实时荧光PCR定性检测方法

食品中掺假掺杂是当前食品检验工作的一个重要方面。本文通过应用实时荧光PCR技术,建立了鉴别腊肠中植物成分的方法,和常规PCR比特异性强,简便快速,同时实验采用完全闭管检测,降低了污染机会,为腊肠中植物成分的检测提供了新方法。