siRNA干扰MDM2基因对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的将靶向MDM2的siRNA转染人肝癌HepG2细胞,观察转染后细胞内p21基因的表达变化及其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法将人工合成的针对MDM2基因的siRNA片段通过LipofectamineTM 2000转染人肝癌细胞HepG2。实验分为MDM2 siRNA转染组、阴性对照组、脂质体组、正常对照组。分别用RT-PCR和Western blot法检测各组细胞中MDM2、p21的mRNA和蛋白质的表达量,并用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化。结果与其他3组比较,siRNA转染组细胞中MDM2 mRNA及蛋白表达减少（P〈0.01）,而p21 mRNA及蛋白表达增高（P〈0.01）。HepG2转染MDM2 siRNA后,增殖能力减弱,凋亡显著。结论 MDM2基因可能通过影响p21控制肝癌细胞的生长。     

鼠双微粒体-2基因沉默对人肝癌HepG2细胞移植瘤生长的抑制作用

目的 构建鼠双微粒体-2基因(MDM2)靶向小分子干扰RNA (siRNA)质粒,研究其对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,探讨其在肝癌基因治疗中的可行性.方法 构建MDM2的siRNA真核表达载体pSilencer-siRNA-MDM2 (siMDM2),建立裸鼠荷瘤模型,分别给予阴性对照质粒和siMDM2质粒处理.监测肿瘤生长变化,RT-PCR、Western blot方法检测MDM2及p53 mRNA和蛋白的表达变化.正态分布数据的组间比较用单因素方差分析及LSD检验.结果 裸鼠体内实验结果显示,转染siMDM2-1和siMDM2-2组与对照组相比,肿瘤增长受到明显抑制,抑瘤率分别为60.6％和54.6％.RT-PCR和Westem blot结果示MDM2的mRNA和蛋白质表达下调,而p53的mRNA和蛋白质表达上调.与空白组比较,转染siMDM2-1和siMDM2-2组的MDM2mRNA表达分别下调62.8％和61.5％,MDM2蛋白表达分别下调60.7％和59.5％;p53 mRNA表达分别上调47.1％和45.6％,p53蛋白表达分别上调45.9％和44.3％,差异均具有统计学意义(F值分别为75.099、47.860、17.676和235.770,P值均＜0.01).结论 siRNA沉默MDM2基因能抑制人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,可能与其在体内有效下调MDM2和上调p53的mRNA及蛋白质表达有关.     

PDECGF-siRNA诱导膀胱癌细胞凋亡机制的探讨

目的 探讨RNA干扰技术沉默血小板源性内皮生长因子基因(platelet-derived endothelial cell growth factor, PDECGF)表达诱导人膀胱癌细胞凋亡的机制.方法 针对人PDECGF mRNA序列设计合成编码干扰RNA (siRNA) 的DNA模板, siRNA;构建含RNA聚合酶启动子Ⅲ转录载体pRNAT-U6/Neo并能形成发夹结构小干扰RNA(siRNA)的psiPDECGF质粒;用其转染人膀胱癌T24细胞株,采用RT-PCR、Western 印迹法观察转染前后PDECGF基因及相关基因表达变化,采用凋亡DNA琼脂糖凝胶电泳及吖啶橙/溴化乙啶染色法观察细胞凋亡.结果 显示PDECGF siRNA对膀胱癌T24细胞中PDECGF基因表达产生明显抑制作用;转染psiPDECGF-2细胞组PDECGF mRNA水平明显降低,上述重组质粒可诱导T24细胞凋亡,同时caspase-3、p53蛋白水平明显增高.结论 证实psiPDECGF-2可抑制PDECGF在T24细胞的表达,诱导肿瘤细胞凋亡.其机制与caspase-3、p53蛋白水平表达增高有关.     

siRNA对脂多糖诱导下HepG2细胞caspase-8基因的干扰及对凋亡的影响

目的:研究针对人caspase-8基因mRNA的siRNA(small interfering RNA)表达载体,观察其转染人肝癌细胞HepG2后,细胞caspase-8基因表达的变化,及其对细胞凋亡的影响。方法:采用针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达质粒,由脂质体介导瞬时转染HepG2细胞株,并采用脂多糖(LPS)诱导HepG2细胞凋亡,RT-PCR、Westernblot测定caspase-8表达。结果:针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达质粒能抑制caspase-8mRNA和蛋白表达;转染后HepG2细胞体外生长明显受到抑制。结论:siRNA表达质粒能有效地抑制HepG2细胞中caspase-8的表达,抑制细胞凋亡并促进生长。为进一步探究肝衰竭基因治疗提供了实验依据。     

siRNA抑制survivin基因及其对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

目的观察特异小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法构建survivin-siRNA真核表达载体,利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。针对转染后不同的时间点采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖以及HepG2细胞的凋亡情况。结果构建的survivin-siRNA转染组survivin蛋白表达较对照组明显下调,差异有显著性（P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（P〈0.001）;而阳性对照组及未转染组对survivin表达及mRNA抑制作用不明显（P=0.219）。结论所构建的针对人survivin-siRNA可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞凋亡。     

靶向cyclinE小干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:以cyclinE基因编码区为靶位,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,观察转染后对HepG2细胞的影响.方法:针对cyclinE基因序列构建表达siRNA的真核表达载体pSilencer3.1-H1hygro,利用脂质体Metafectene转染CyclinE基因高表达的肝癌细胞株HepG2.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR和Western blot法观察转染后细胞cyclinE基因表达.结果:成功构建了表达siRNA的真核质粒载体,转染后cyclinE基因mRNA及蛋白表达水平分别下降了79%和65%.结论:靶向cyclinE基因的siRNA可有效沉默HepG2细胞高表达的cyclinE基因,从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡.     

人宫颈癌基因小干扰RNA抑制HepG2细胞生长的作用及其机制

目的 利用RNA干扰技术探讨人宫颈癌基因(HCCR)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制. 方法 构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR,将其转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量PCR、Westem blot检测HCCR及其相关基因的表达,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖状态,流式细胞术观察细胞凋亡与细胞周期变化. 结果 成功构建真核表达质粒pRIV2-siHCCR,其表达的HCCR siRNA可有效抑制HepG2细胞内HCCR的表达,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加.Western blot结果显示HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后,细胞内P53蛋白的表达降低,P15蛋白的表达明显升高,而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变. 结论 HepG2细胞中HCCR蛋白下调后,细胞增殖受到抑制,凋亡细胞增多,其作用机制可能与蛋白质P53、P15有关.     

RNA干扰诱导肝癌HepG2细胞凋亡对丹参酮ⅡA药物敏感性的影响

目的:探讨载体介导的RNA干扰技术诱导HepG2细胞凋亡对丹参酮ⅡA药物敏感性的影响.方法:应用靶向细胞周期E(cyclin E)基因的siRNA真核表达载体转染HepG2细胞诱导凋亡,再以丹参酮ⅡA处理48h(cyclinE siRNA+丹参酮ⅡA组),同时设立cyclin EsiRNA组、无义siRNA组、丹参酮ⅡA组以及空白对照组,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,吖啶橙荧光染色检测细胞凋亡形态,Western blot法观察细胞Caspase-3蛋白表达.结果:单用cyclinE siRNA质粒转染或丹参酮ⅡA处理肝癌HepG2细胞,细胞凋亡率显著高于空白对照组(P＜0.01),2μg/ml剂量凋亡率分别达到21.6%、23.6%.cyclinE siRNA质粒转染预诱导再经丹参酮ⅡA处理,HepG2细胞G0～G1期比例显著增高,S期、G2～M期细胞所占有比例明显下降;与单用cyclinE siRNA质粒转染、丹参酮ⅡA两组比较,细胞凋亡率分别增高了1.81和1.61倍,比两组合计增高0.35倍,Caspase-3蛋白表达水平分别增高了0.91倍和0.66倍.结论:通过cyclinE siRNA质粒转染诱导的HepG2细胞凋亡可提高丹参酮ⅡA药物敏感性,其机制与增强凋亡控制相关基因表达有关.     

氧化苦参碱调节NS5ATP13对人肝母细胞瘤HepG2细胞系增殖及凋亡的作用机制

目的探讨氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)与HCV NS5A蛋白反式激活基因13(HCV NS5A trans-regulated protein 13,NS5ATP13)的关系及对人肝母细胞瘤细胞系HepG2增殖凋亡的影响及其作用机制。方法在HepG2细胞中分别加入OMT、转染NS5ATP13过表达载体(pNS5ATP13)和小干扰RNA(siNS5ATP13)及各自的阴性对照,检测细胞活力、愈合速度、迁移及侵袭程度、Caspase-3/7表达水平及增殖凋亡相关蛋白的表达。结果 (1)OMT能抑制HepG2细胞增殖,促进HepG2细胞凋亡,下调NS5ATP13;(2)过表达NS5ATP13能促进HepG2细胞的增殖、迁移;干扰NS5ATP13能促进HepG2细胞凋亡;(3)将NS5ATP13干扰后加入OMT能显著抑制细胞增殖、迁移,并抑制AKT/GSK/mTOR信号转导通路。结论 OMT可能通过下调NS5ATP13抑制AKT/GSK/mTOR信号转导通路,诱导人肝母细胞瘤HepG2细胞系的凋亡。     

靶向survivin基因siRNA在食管癌细胞增殖和凋亡中作用的研究

目的 研究survivin基因特异性RNA干扰对食管癌Eca-109细胞株体外增殖能力和凋亡的影响. 方法 构建靶向survivin的小干扰RNA(siRNA)表达载体,用脂质体法转染Eca-109细胞后,采用半定量RT-PCR、Western Blot检测转染前后survivin mRNA及蛋白表达水平的改变,采用噻唑兰(MTT)法检测细胞的生长增殖情况,采用流式细胞术测定细胞的凋亡情况. 结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制Eca-109细胞survivin基因的表达.转染靶向survivin的siRNA表达质粒可以显著抑制Eca-109细胞的增殖(细胞接种24 h、48 h后增殖抑制率分别为21.05%和33.96%),诱导明显的细胞凋亡[转染24 h、48 h后的凋亡率分别为(8.03±1.05)%和(6.22±1.06)%]. 结论 survivin基因特异性RNA干扰可以显著抑制食管癌Eca-109细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡.     

抑制干扰素诱导蛋白p204表达促进大鼠血管外膜成纤维细胞生长与迁移

目的观察干扰素诱导蛋白p204表达抑制后对大鼠血管外膜成纤维细胞(VAF)凋亡、增殖与迁移的影响及其部分机制。方法应用Ifi204小干扰RNA(si RNA)转染VAF使Ifi204基因沉默(Ifi204-si RNA组),以非特异性si RNA转染作为其转染阴性对照组(Con-si RNA组)和未经处理的VAF作为未干预阴性对照组(Neg组)。用MTT法检测VAF细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,细胞划痕法和Transwell法测定细胞迁移情况,应用实时荧光q RT-PCR和Western blot分别检测p204、p53及p21的m RNA和蛋白表达。结果与Con-si RNA组和(或)Neg组相比,Ifi204-si RNA组的p204、p53及p21的m RNA和蛋白表达减少(P0.05),细胞凋亡率下降(P0.05),细胞增殖及迁移速度提高(P0.05)。结论抑制p204表达可减少大鼠VAF细胞凋亡,促进其增殖与迁移,其机制可能部分与抑制p53及p21表达有关。     

抑制干扰素诱导蛋白16表达对人脑血管外膜成纤维细胞增殖、凋亡及迁移的影响

目的探讨抑制干扰素诱导蛋白16(IFI16)表达后对人脑血管外膜成纤维细胞(HBVAF)增殖、凋亡与迁移的影响及其可能机制。方法培养HBVAF分3组,未经处理的HBVAF作为空白对照组,转染非特异性小干扰RNA(siRNA)的HBVAF作为阴性对照组,转染IFI16siRNA的HBVAF作为IFI16siRNA组。应用蛋白免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定细胞中IFI16、p53、p21蛋白和mRNA表达水平。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡,Transwell法测定细胞迁移情况。结果与阴性对照组比较,转染IFI16siRNA后,HBVAF中IFI16、p53及p21蛋白和mRNA表达水平下调,IFI16siRNA组MTT吸光度值增高(0.70±0.01比0.65±0.01,P0.05),IFI16siRNA组、阴性对照组与空白对照组之间在细胞迁移数目与凋亡比例上差异无统计学意义。结论抑制IFI16表达可促进HBVAF增殖,其机制可能部分与抑制p53及p21表达有关。     

HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其机制

目的:研究HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法:用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3/HBx瞬时转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3的细胞为对照.RT-PCR法检测HBx基因的表达;MTT法检测各组细胞的增殖活性;TUNEL法检测各组的凋亡情况.β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-xL、c-myc的表达量变化.结果:pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.HepG2细胞转染HBx基因后,相对于对照组细胞增殖能力明显下降,凋亡增多,差异有显著性意义(P＜0.01);转染HBx的细胞Bax、Bcl-xL、c-myc mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:成功将HBx基因转染入HepG2细胞,并在细胞中表达,转染HBx基因可同时上调Bax、Bcl-xL、c-myc mRNA表达,促进HepG2细胞凋亡,抑制增殖.     

幽门螺杆菌脂多糖通过调节MDM2表达对胃上皮细胞恶性转化的影响

背景:幽门螺杆菌脂多糖(Hp-LPS)在诱导胃癌发生中起重要作用。目的:探讨Hp-LPS对MDM2基因表达的调节作用,及其对胃上皮细胞恶性转化的影响。方法:分别以Hp-LPS (1μg/mL)和大肠埃希菌(E. coli)-LPS(1μg/mL)刺激人胃上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株HGC-27、MKN45 24 h,以蛋白质印迹法检测MDM2表达。构建MDM2启动子区荧光素酶报告基因质粒并转染HGC-27细胞,以Hp-LPS刺激细胞24 h后,检测报告基因相对荧光素酶活性。构建MDM2 RNA干扰质粒并分别转染三株细胞,行流式细胞术细胞凋亡检测和Transwell细胞侵袭实验。建立裸鼠MKN45、HGC-27细胞胃癌异种移植瘤模型并予尾静脉注射siRNA-hMDMA2-3,观察移植瘤生长情况。结果:Hp-LPS可增加MDM2基因启动子转录活性,上调胃上皮细胞和胃癌细胞MDM2蛋白表达。转染siRNAhM DMA2-3的GES-1、HGC-27、MKN45细胞,细胞凋亡较转染阴性对照siRNA者显著增加(P 0. 05),侵袭能力显著减弱(P 0. 05)。经siRNA-hMDMA2-3干预的异种移植瘤模型裸鼠,肿瘤生长抑制率显著高于以阴性对照siRNA干预者(P 0. 05)。结论:Hp-LPS可能通过诱导MDM2表达引起胃上皮细胞恶性转化,而抑制MDM2表达可促进胃上皮细胞和胃癌细胞凋亡并抑制其侵袭能力,发挥抑制胃上皮细胞恶性转化和胃癌生长的作用。     

通过RNAi抑制人乳腺癌细胞窖蛋白-1基因表达

目的通过构建针对窖蛋白(CAV)-1基因的siRNA,研究RNAi技术对MCF-7细胞cav-1基因表达的影响。方法构建siRNA表达载体p Genesil-1-sh RNA-cav-1,通过脂质体法转染到MCF-7细胞,RT-PCR法检测cav-1的m RNA表达。结果成功构建重组表达载体p Genesil-1-sh RNA-cav-1;RT-PCR检测显示转染重组质粒的乳腺癌细胞中cav-1 m RNA表达明显低于阴性对照、空白对照和正常细胞组。结论重组表达载体p Genesil-1-sh RNA-cav-1能有效抑制人乳腺癌细胞cav-1基因的表达。     

节律基因Per2对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨节律基因Per2对胶质瘤细胞的影响及其作用机制。方法将Per2表达质粒pcDNA3.1-Per2及空载对照质粒pcDNA3.1分别经阳离子脂质体介导转染CHG-5细胞,用G418筛选出Per2稳定表达细胞株;分别用MTT法、流式细胞仪、RT-PCR技术,检测CHG-5细胞增殖、细胞周期和凋亡,以及该细胞株中增殖、凋亡相关基因p53和c-myc表达。结果筛选到稳定表达Per2基因的细胞株CHG-5/Per2细胞,Per2有抑制肿瘤细胞增殖能力;与对照组（pcDNA 3.1-CHG-5）和未处理组（CHG-5）比较,转染组CHG-5/Per2细胞在G1期阻滞,细胞凋亡明显增加（P均〈0.05）;Per2可明显上调p53基因表达,抑制c-myc基因表达。结论节律基因Per2可促进胶质瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖,是胶质瘤中的肿瘤抑制因子。     

靶向5-LOX的siRNA诱导胰腺癌细胞的凋亡

目的:采用RNA干扰技术(siRNA)阻断5-LOX基因的表达,观察其抑制人胰腺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用.方法:构建靶向5-LOx的siRNA质粒表达载体,采用Lipofectamine-2000转染人胰腺癌细胞株SW1990,采用RT-PCR检测RNA干扰后5-LOX mRNA表达,MTT法检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:靶向5-LOX序列特异性的三条siRNA(组1、组2、组3)可以有效地抑制SW1990细胞5-LOX基因表达,其表达抑制率分别为19.6%±1.9%、55.4%±2.6%和55.2%±2.7%.转染靶向5-LOX siRNA的三个质粒表达载体可以显著抑制SW1990细胞的增殖, 细胞接种24 h后,三组增殖抑制率分别为5.37%±1.19%、11.63%±1.25%和13.67%±1.04%:48 h后其增殖抑制率分别为16.13%±1.5%、26.63%±1.22%和25.47%±1.67%, 各siRNA组增殖抑制率高于空白组和阴性对照组(均P<0.05),转染后24 h和48 h三组细胞凋亡率分别为5.56%±1.05%、11.45%±1.44%、12.13%±1.36%和7.37%±1.23%、18.75%±1.5%和22.02%±1.45%,均高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05).结论:所构建的靶向5-LOX的siRNA质粒表达载体可以有效阻断SW1990细胞5-LOX基因表达,显著地抑制SW1990细胞增殖,并在一定程度上诱导其凋亡.     

shRNA干扰SMYD3对肝癌细胞c-Myc表达及凋亡的影响

目的:观察SMYD3(SET and MYND-domain containing 3)基因沉默后c-Myc的表达及对HepG2细胞凋亡的影响.方法:构建针对SMYD3的shRNA干扰质粒Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2和阴性对照质粒Pgenesil-1-hk,同时设空白对照组,采用Lipofectamine2000脂质体介导转染法转染质粒.转染后24、48、72 h,RT-PCR检测HepG2细胞SMYD3和c-Myc的表达情况.流式细胞术法检测各组细胞的凋亡.结果:SMYD3、c-Myc基因在HepG2细胞中强表达.RT-PCR显示Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2转染组与阴性对照质粒转染组Pgenesil-1-hk转染24、48、72 h后相比,SMYD3基因表达均明显受到抑制 (F=67.46,P<0.01:F=176.79,P<0.01;F=175.28,P<0.01),同时c-Myc表达下调(三组之间:F=11.58,P=0.009; F=126.41,P<0.01;F=261.25,P<0.01).Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2转染组细胞早期凋亡率与Pgenesil-1-hk转染组 (LSD-t=-13.58,-12.62,均P<0.01)、空白组(LSD-t=-18.62,-17.67,均P<0.01)相比有显著性差异.结论:RNA干扰技术特异性沉默HepG2细胞SMYD3基因后,抑制了c-Myc的表达,促进了HepG2细胞的凋亡.     

siRNA抑制人黑色素瘤A375细胞株VEGF的表达及细胞增殖

目的 研究小干扰RNA( siRNA)对人黑色素瘤A375细胞血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的抑制作用及对癌细胞增殖的抑制作用和诱导凋亡的作用.方法 设计并合成特异性靶向人VEGF基因的siRNA,通过脂质体转染到A375细胞中.RT-PCR检测siVEGF对VEGF基因表达的抑制作用;MTT法检测siVEGF对癌细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测siVEGF诱导细胞凋亡的作用.稳定转染的肿瘤细胞株接种于裸鼠皮下,观察肿瘤细胞成瘤情况.结果 转染siVEGF1和siVEGF2组VEGFmRNA表达水平与空白对照组比较分别下调了59.92％和69.63％,转染阴性对照质粒组VEGF基因表达水平都无明显改变.转染siVEGF1和siVEGF2的细胞增殖受到抑制,增殖抑制率具有时间依赖性,细胞的凋亡率分别为33.8％和41.1％.转染SiVEGF2的A375细胞成瘤率平均为66.7％和50％,而对照组成瘤率均为100％.结论 构建的siRNAVEGF能有效抑制人黑色素瘤A375细胞增殖及成瘤率,诱导其凋亡,其机制可能与其特异性有效下调VEGF基因的表达有关.     

siRNA干扰沉默EZH2基因对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的探讨小分子RNA(siRNA)干扰沉默靶基因EZH2对人肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法取对数生长期的HepG2细胞,分为转染组、阴性对照组及空白对照组,转染组与阴性对照组按照Lipofectamine2000使用说明分别瞬时转染EZH2 siRNA、荧光物FAM,对照组不予任何干预。分别采用MTT法检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期;qRealtime-PCR和Western blot方法检测EZH2 mRNA和蛋白表达。结果与阴性对照组相比,转染组细胞增殖明显受抑;与阴性对照组及空白对照组比较,转染组细胞凋亡率明显升高,G0/G1期细胞明显增多,S期明显细胞减少;转染组EZH2 mRNA和蛋白表达明显下调,P均<0.05。结论 EZH2 siRNA可抑制人肝癌细胞增殖活性,是一种潜在基因治疗新方法。