铜绿假单胞菌噬菌体vB＿PaeM-YQ78生物学与基因组特征及其裂解酶的改造

目的 从医院废水中筛选并鉴定铜绿假单胞菌烈性噬菌体，表达和优化其裂解酶。方法 以收集的临床铜绿假单胞菌为宿主菌，分离纯化烈性噬菌体，并深入鉴定其中一株裂解能力强的广谱噬菌体的生物学特性，分析其基因组特征和进化特征，表达和改造噬菌体裂解酶，测定噬菌体与抗生素的协同杀菌作用以及不同穿膜辅助剂对于裂解酶杀菌活性的影响。结果噬菌体vB＿PaeM-YQ78是一株新的铜绿假单胞菌肌尾噬菌体，潜伏期为10 min，裂解量为43；最佳感染复数为0.00001；在40℃以下和pH 5～10范围内保持稳定。噬菌体与环丙沙星具有较强的协同作用，在24 h内无突变菌株生长。不使用穿膜辅助剂时，裂解酶LysYQ78在1 h内能将多重耐药铜绿假单胞菌降低1个log单位，在添加5 mmol/L EDTA时，LysYQ78可以将细菌浓度降低6个log单位。将ApoE蛋白N端穿膜肽融合到LysYQ78的N端后，Lys1410-YQ78的杀菌活性得到显著提高，可以在1 h内将宿主菌浓度降低2个log单位。结论 本实验分离鉴定了一株新的铜绿假单胞菌烈性噬菌体，其具有较宽的宿主谱，与环丙沙星具有较强的协同作用。并且，其裂解酶...     

重组肝素酶I在大肠杆菌中的表达及纯化

优化肝素裂解酶I在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pOFX-T7-SL1中的重组表达条件,结果显示接种6 h(OD600≈2.5)后加入0.25 mmol/L IPTG,在25℃下表达8 h目标蛋白酶活达到最高值1.49×105IU/L。进一步于5 L发酵罐中扩大培养,20 h后最高酶活达到5.55×105IU/L。利用亲和层析分离目标蛋白,肝素裂解酶I的纯度可达到96%,回收率为37.58%,比酶活达到1.12×103IU/mg。肝素裂解酶I的高效表达为大规模利用酶法制备低分子肝素打下了坚实的基础。     

构建高表达酪氨酸酚裂解酶重组大肠杆菌合成左旋多巴

以PCR技术扩增得到弗氏柠檬酸细菌ATCC 8090中酪氨酸酚裂解酶的结构基因tpl,与表达载体pQE30连接后构建质粒pQTPL,并转化到E. coli M15中进行表达,在加入0.2mmol/L的IPTG、18℃表达14h的诱导条件下,酪氨酸酚裂解酶比活为208u/mg.50ml摇瓶中E.coli M15(pQTPL)合成左旋多巴产量达55g/L.     

海洋细菌Thalassomonas sp.LD5中新型褐藻胶裂解酶TsAly7C的研究

目的对来源于Thalassomonas sp.LD5的褐藻胶裂解酶TsAly7C进行研究,以期获得具有优良性质的褐藻胶裂解酶,适应工业需求。方法在生物信息学分析的基础上,对TsAly7C进行了重组表达和酶学性质研究。结果通过生物信息学分析,TsAly7C属于PL7家族的第一亚家族。对重组TsAly7C(r TsAly7C)酶学性质进行分析,r TsAly7C的最适温度是30℃,最适p H为8.0(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液),在底物中添加300 mmol/L NaCl时降解能力最强。r TsAly7C的p H稳定性和温度稳定性较好,在0～30℃保存1 h仍保有80%以上的酶活,是1种适低温性褐藻胶裂解酶。Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺和十二烷基硫酸钠(SDS)对r TsAly7C的酶活有明显的抑制作用。r TsAly7C是1种双功能褐藻胶裂解酶,以内切形式裂解褐藻胶产生不饱和二糖和单糖。     

基因工程菌株产生的青霉素酰化酶的纯化及其性质

以构建的青霉素酰化酶基因工程菌(E.Coli 108/PPAHD 1)为材料,经硫酸铵沉淀、离子交换和制备电泳等手段将青霉素酰化酶的纯度提高了155倍,比活达17 u/mg,其凝胶电泳呈现单带。该酶有两个亚基,分子量分别为62300 d 和14900 d。并测定了该酶对温度及 pH 稳定范围、米氏常数等电点。     

肺炎克雷伯菌噬菌体裂解酶的研究进展

随着耐药性肺炎克雷伯菌的增多,噬菌体的潜力逐步被发掘。裂解酶在噬菌体裂解宿主菌时起到了重要作用,作为外源纯化蛋白使用时,防控效果更为显著。现有研究中,针对革兰阳性菌噬菌体裂解酶的表达更多,因其不具有革兰阴性菌细胞壁外层的肽聚糖层,而对肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌等革兰阴性菌的噬菌体裂解酶研究仍较为罕见。但已有研究表明,多种策略可以克服其肽聚糖层带来的阻碍。本文主要综述了近年来用于防控肺炎克雷伯菌的噬菌体裂解酶及其作用机制和防控优势,旨对其后续研究提供思路。     

透明质酸酶催化透明质酸水解的最适反应条件

目的确定透明质酸酶(HAase)催化透明质酸(HA)水解的最适条件。方法HAase不同条件下催化HA水解,反应结束后利用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法测量反应产物的相对分子质量及其分布系数。结果HAase催化HA水解受温度、pH值、酶浓度、底物浓度、反应时间等因素的影响。结论HAase催化HA水解的最适反应条件是底物浓度为10 g/L,酶浓度为150 000 U/L,pH为5.0,反应温度为50℃。     

透明质酸产生菌菌种诱变选育及发酵工艺研究

采用透明质酸酶缺陷型链球菌发酵生产透明质酸.从牛鼻粘膜分离兽疫链球菌,经诱变获得透明质酸酶缺陷型变异株Y-921.Y-921在含葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏及无机盐的发酵液中,pH7.0,37℃下发酵42h,得透明质酸4.5g/L,其分子量为1.9×10~6,蛋白质含量0.2%,这种高分子量透明质酸适用于化妆品.     

基于活性成分和α-葡萄糖苷酶抑制作用的组织培养牡荆遗传稳定性评价

目的 评价组织培养牡荆的遗传稳定性。方法 考察4种溶剂对牡荆叶总黄酮的提取效果；采用高效液相色谱(HPLC)法测定牡荆素含量，并测试牡荆叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及动力学曲线。结果 不同溶剂对牡荆叶活性成分提取得率从高到低依次为酸性乙醇(pH 1.33)、70%乙醇溶液、丙酮、乙酸乙酯。以酸性乙醇(pH 1.33)为溶剂的组织培养和野生牡荆叶中总黄酮含量以鲜重计分别为62.79 mg/g和60.35 mg/g，牡荆素含量以鲜重计分别为132.20μg/g和126.12μg/g，提取物对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(IC₅₀)分别为1.41 mg/mL和1.37 mg/mL。动力学曲线分析表明，组织培养和野生牡荆叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型均为可逆性抑制。结论 牡荆叶提取物对α-葡萄糖苷酶有较强抑制作用，且组织培养和野生牡荆叶活性成分相当，组织培养牡荆遗传稳定性较好。     

赤子爱胜蚓脱氧核糖核酸酶酶动力学研究

目的对赤子爱胜蚓中一组新型脱氧核糖核酸酶(EWDs)进行酶动力学研究。方法运用单相酶扩散法(SRED)、紫外分光光度法和林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法。结果EWDs的最适温度均为37℃。EWD1的最适pH为5.2,Km为1.58mg/ml,Vmax为5.36mg·ml-1·min-1;EWD2的最适pH为4.4,Km值是3.95mg/ml,Vmax值为2.87mg·ml-1·min-1;EWD3的最适pH为4.8,Km值是1.52mg/ml,Vmax值为4.89mg·ml-1·min-1。Mn2+和Ca2+是EWDs的抑制剂,Mg2+仅抑制EWD3的活性。结论蚯蚓组织中发现的此组脱氧核糖核酸酶具有特殊的酶学性质,区别于已知的脱氧核糖核酸酶类。     

细菌来源透明质酸酶的研究进展

透明质酸酶是致病性酿脓链球菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等革兰阳性球菌的毒力因子之一，也是肠球菌潜在的毒力因子之一。现对细菌来源透明质酸酶的基本结构、不同细菌来源透明质酸酶与其致病性的关系等研究进展做一综述。     

免疫球蛋白降解酶IdeS在大肠杆菌中的表达、纯化及功能鉴定

病原链球菌为逃避宿主的免疫反应,分泌一种可特异地裂解免疫球蛋白G的降解酶(immunoglobulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS)。IdeS既可作为工具酶用于IgG的指纹分析,又可用于治疗与自身免疫反应相关的疾病。本研究基于质粒pCold构建了两种重组IdeS的表达载体,并在大肠杆菌Shuffle T7中进行异源表达,经亲和色谱纯化后检测其蛋白活性。结果表明N-端含有His6-标签的重组IdeS产量为4 mg·L^-1,其与抗体IgG1以1∶200 (m/m)在37℃反应30 min即可完全酶解。而N-端含有His6-标签且C-端含有硅胶亲和标签(SiBP)的重组IdeS产量为1.5 mg·L^-1,其与抗体IgG1以1∶20 (m/m)在37℃反应30 min才可反应完全。C-端融合肽对于IdeS产量与活性都有较大的影响,使其活性降低,不利于后续应用于药物研发。上述结果表明,本系统所表达的N-端含有His6-标签的IdeS重组蛋白具有较高的活性,完全能满足抗体类药物研发...     

异柠檬酸裂解酶的制备及其抑制剂筛选模型的建立

目的 制备结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)并建立ICL抑制剂筛选模型.方法 通过四步层析法或金属螯合层析法纯化大肠埃希菌BL21(DE3)表达的ICL,并以异柠檬酸为底物,用纯化的ICL裂解舁柠檬酸,生成乙醛酸可与苯肼反应生成苯腙,苯腙在324nm波长下产生光吸收峰,测定酶促反应体系在324nm波长下光吸收检测异柠檬酸裂解酶的活性,根据待测样品对酶活性的抑制程度,筛选异柠檬酸裂解酶抑制剂.结果 用金属螯和层析法得到纯度为90%、比活力为2.8U/mg的ICL,建立并优化ICL抑制剂筛选模型,模型的信噪比(S/N)远大于3,变异系数(CV)远小于10%.结论 通过金属螯合层析法获得了特异性高、稳定性好的ICL抑制剂筛选模型,该模型可有效的应用于异柠檬酸裂解酶抑制剂的高通量筛选.     

青霉素酶分离纯化及酶学性质研究

本文对蜡状芽孢杆菌CMCC(B)63301产青霉素酶的分离纯化工艺及酶学性质进行了研究。粗酶液通过硫酸铵分级盐析、超滤除盐浓缩、SephadexG-75凝胶层析纯化后得到的青霉素酶液的比活力为68.2×106u/mg,纯化倍数为11.32,酶活回收率为35.04%。经SDS-PAGE检测为单一区带。该酶作用的最适温度为37℃,最适作用pH范围为6.5～7.0,在0～20℃下存放比较稳定。酶液中添加5%NaCl或5%甘油可提高酶的保存稳定性。     

蚯蚓纤溶酶的药用淀粉化学修饰

用活化的药用淀粉对蚯蚓纤溶酶进行化学修饰 ,并筛选优化了化学修饰条件。其中以 1mg/ml的淀粉二醛对相同体积的酶液 (酶的比活力为 390U/mg蛋白质 ;底物为酪蛋白 )进行修饰 ,于4℃反应 2h ,制备的修饰酶效果最佳。实验结果表明 ,修饰酶的Kmapp(底物为碱性氨基酸的酯 )为 8.6 9× 10 5mg/ml,较原酶降低了近 2倍 ,修饰酶的反应最适 pH值为 8.6 ,原酶为 7.2 ;原酶和修饰酶的反应最适温度均为5 5℃。     

青霉素酰化酶提取及其与固定化酶的动力学参数测定和比较

采用冻融-溶媒法从大肠杆菌中提取青霉素酰化酶(经硫酸铵沉淀、透析、冷冻干燥),制得酶粉,活力为1100.37u/g,经六批提取试验,平均提取收率47.93％。分别测定游离酶及其固定化酶米氏常数Km值。游离酶的Km值为2.39mM,固定化酶按其颗粒大小不同,Km值分别为5.62、8.46、8.42mM。 在对pH稳定性测定中,游离酶最适pH为7～8,而固定化后在pH5～9之间都较稳定。对温度的稳定性测定中,游离酶与固定化酶在40℃以下都较稳定,但在45℃保温一小时后,游离酶只存留活力39.51％,而固定化酶却存留活力86.92％,二者有显著差异、温度再高相差更大。因此酶经固定化后,对pH和温度的稳定性都有明显提高。金属离子对青霉素酰化酶的活力有所影响。特别是铁离子和铜离子影响较大,故酶反应容器不能采用铁和铜的材料。     

一种新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶酶学性质的研究

目的研究蚯蚓组织中1种新型脱氧核糖核酸酶(EWD1)的主要酶学性质。方法用SDS-PAGE凝胶电泳、质谱分析、毛细管等点聚焦电泳法和酶活性测定等方法。结果EWD1的相对分子质量约为157000。Mn2+、Ca2+是该酶的抑制剂,Mg2+对酶的活性基本上没有影响。该酶的最适温度为37℃,最适pH值为5.2,等电点为6.12。以小牛胸腺DNA为底物,测得Km为1.58 mg/mL,Vmax为5.36 mg/(mL.min)。结论蚯蚓组织中发现的此种脱氧核糖核酸酶EWD1具有特殊的酶学性质,明显区别于已知的脱氧核糖核酸酶类。     

石刁柏细胞的L-天冬酰胺酶发酵条件的研究

优化了石刁柏细胞L-天冬酰胺酶发酵条件并对其粗提进行了探索。其最佳产酶条件为:最适培养基为MS 蔗糖(35 g/L) 6-(苄胺基)嘌呤(0.01 mg/L) α-奈乙酸(3 mg/L)最适pH值为6.4、最适温度为27℃、最适转速为110 r/min、接种量为5.0×104个/ml。在此发酵条件下,L-天冬酰胺酶发酵液酶活力的峰值可达到22.37 U/ml、产酶稳定期持续7~8 d,利用吴氏提取工艺可以得到回收率为30.8%,纯化倍数为9.85,比活力为0.55 U/mg的L-天冬酰胺酶。     

幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白高效表达研究

目的高密度培养重组细菌和高效表达重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白。优化细菌培养和重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白表达的发酵工艺条件。重组细菌的培养条件：培养温度为35℃，培养基pH值为7．0～7．5，葡萄糖浓度为0．5％～2．0％，采用合理的策略控制发酵过程代谢副产物乙酸盐浓度不高于4mg/ml,，在BiofloⅢ发酵罐中，3批实验结果表明：重组细菌的平均生物量大约为60g/L发酵液(DCW)，重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白平均表达量为35％左右。