五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立

目的 建立5种生物恐怖细菌的快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法 ,即炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的多重检测.方法 针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性基因序列设计6对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交,用悬浮芯片扫描仪检测.结果 多重PCR悬浮芯片检测体系能够正确的检测和鉴定5种生物恐怖细菌,特异性好,灵敏度高,可用于恐怖样本的高通量筛查.结论 建立了多重PCR基因悬浮芯片快速检测几种生物恐怖细菌的方法 .     

三基因PCR检测志贺菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的研究

目的探索一种快速、经济、敏感的诊断方法,对常见的食品中的腹泻致病菌进行基因检测研究。方法建立一种快速标本处理和多基因PCR反应(multiplePCR)诊断方法,在一次PCR反应中同时扩增3种菌的致病基因:志贺菌的侵袭性(ipaH)基因、副溶血弧菌的热稳定直接溶血素(tdh)基因和霍乱弧菌Ο139的霍乱毒素(ctx)基因。扩增产物经电泳,出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为阳性标本;另外对这些标准菌株进行Southernblot杂交鉴定。结果对标准志贺菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测,多基因PCR法检测为阳性;PCR作为诊断方法较培养法阳性率高。结论三基因PCR具有简便、快速、特异、经济和不需要培养等特点,适用于食品检测。     

临床常见致病菌快速诊断用芯片的初步构建

目的:构建针对21种常见致病菌的快速诊断用芯片.方法:针对细菌的高度保守区域设计特异探针,优化条件下与细菌的PCR扩增产物进行杂交.结果:得到特异的杂交结果.结论:芯片方法可用于快速鉴别不同种类的细菌,该方法简便可行,优于传统诊断方法.     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

16S-23S rRNA基因区间细菌鉴定实验研究

目的 :探讨 16 S- 2 3S r RNA基因区间对细菌鉴定的应用。方法 :以 16 S- 2 3S r RNA基因区间为靶序列设计引物 ,采用聚合酶链反应检测标准菌株及临床菌株 DNA。结果 :对 2 7株代表 2 7个菌种的标准菌株进行 PCR扩增 ,分别出现不同的 DNA图谱 ,该图谱能直接或经核酸内切酶处理后用于细菌分类 ,敏感性可达 2 .5 CFU/ml的细菌 ,与人外周血白细胞 DNA和真菌及病毒无交叉。 32株临床细菌标本均扩增出与相应标准菌株一致的图谱。结论 :16 S- 2 3S r RNA基因区间 PCR扩增技术检测细菌 ,具有敏感、特异、快速、准确的优点 ,为临床败血症病原的快速诊断提供了新的方法     

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的 建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法.方法 根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病-(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法.根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1,KRV和RMV的引物.结果 两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL.双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本.结论 本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法.     

PCR法检测人类脲原体U.Parvum和U.Urealyticum

目的 建立2个快速、同步检测脲原体U. Parvum和U. Urealyticum的PCR反应体系.方法 根据脲原体尿素酶B基因序列,设计2对分别针对U. Parvum和U. Urealyticum的特异性引物,建立2个PCR反应体系.通过脲原体标准株和临床阳性标本的PCR产物测序以及进行特异性和敏感性实验,对2个PCR体系进行评价.应用2个PCR反应体系对48例临床标本进行脲原体检测以及与培养法检测脲原体进行方法学比较.结果 2个PCR体系能够检测U. Parvum、U. Urealyticum标准株和临床标本中脲原体,扩增产物长度与目的片段大小一致.标准株和2个临床阳性标本扩增产物测序结果与GenBank中公布的序列完全一致.2个PCR体系与其他14株细菌(包括5株有尿素酶细菌)无交叉反应,检测限度均为10拷贝/ul的重组质粒DNA.对48例临床标本同时进行PCR和培养法脲原体检测,PCR的阳性检出率为54.2%,培养法为39.6%(P＜0.05).与培养法比较,PCR的灵敏度为94.7%,而与PCR法相比,培养法的灵敏度为69.2%.结论 2个PCR反应体系能够快速、同步进行临床标本中脲原体的分种鉴别,具有高度特异性和灵敏度.     

双重PCR-毛细管电泳法快速检测大豆中转基因成分

目的　建立抗草甘膦转基因大豆的快速检测方法。方法　针对转基因大豆基因组中被导入的 35 S启动子、NOS终止子和 CP4 - EPSPS抗草甘膦基因等外源基因 ,自行设计了两对引物 ,采用双重 PCR同时扩增上述基因 ,用 8g/L羟丙基甲基纤维素为筛分介质 ,在 5 0 cm× 10 0μm i.d.涂壁毛细管中 ,于 - 10 k V电压下用激光诱导荧光 -毛细管电泳检测转基因大豆的 PCR扩增产物。结果　在优化的 PCR反应和毛细管电泳条件下 ,本法可以同时检测出转基因大豆样品中三种外源基因 ,双重 PCR扩增产物经测序证实与原基因序列完全一致 ,表明本研究设计的引物合理 ,扩增结果可靠。毛细管电泳进样量仅需 5 nl,分析时间为 2 4 min,迁移时间的相对标准偏差≤ 3.2 %。结论　本方法较常规琼脂糖凝胶电泳特异性高 ,分析时间短 ,重现性好 ,检测灵敏 ,适合于大豆中转基因成分的快速检测     

探析细菌快速裂解方法

16S-23S rRNA基因是位于16S rRNA基因与23S rRNA基因之间的区间序列,具有较好的保守性和相对性,被认为是细菌鉴定的合适部位[1,2].我们认为能否快速有效地开展扩增该区间,聚合酶链反应(PCR)扩增前的标本处理是关键.故比较了3种裂解细菌的方法.……     

多重PCR技术检测病毒性肝炎相关病毒的研究

目的建立一种快速、特异的可同时检测血中多种病毒性肝炎相关病毒的多重PCR方法。方法参照各病毒特异性核酸序列,按多重PCR引物设计的特殊要求设计引物,以核酸测序确证扩增产物,用标准病毒株及临床阳性血清样本DNA、RNA为模板优化PCR反应体系和反应条件,建立病毒性肝炎相关病毒多重PCR检测方法。应用建立的多重检测方法对120例ALT升高的血清标本进行多重检测,并将检测结果与单一PCR检测结果进行比较。结果采用多重PCR技术可同时对EBV、TTV、HBV、HSV 4种DNA病毒进行扩增;采用多重RT-PCR技术可同时对Cox-V、HEV、HCV 3种RNA病毒进行扩增。各病原体单一及多重扩增条带均清晰、均一,无非特异性扩增条带,片段长度与理论值一致;核酸测序证实各扩增产物属各病原体特异性基因片段。临床标本检测多重感染率为19.2%,与单一检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法稳定可靠,敏感度、特异度好,适用于病毒性肝炎相关病毒的实验室诊断与临床筛查。     

日本血吸虫精氨酸酶基因启动子序列的扩增及序列分析

目的获取日本血吸虫(Sj)精氨酸酶(ARG)新基因的DNA编码序列及其启动子序列,实验验证ARG基因编码序列的完整性。方法以日本血吸虫成虫DNA做模板,PCR扩增ARG基因编码区的DNA序列并测序;根据Sj ARG基因已扩增的DNA序列设计2条巢式引物,用BaKaRa LA Taq PCR Cloning in vitro Kit,扩增Sj ARG基因的启动子序列;对已扩增得到的序列进行TATA盒的寻找以分析启动子序列的位置,实验验证我们曾获取的SjARG新基因编码序列的完整性。结果扩增得到长约1000bp ARG基因DNA序列,SjARG基因DNA序列内没有内含子,与cDNA序列完全一致。对启动子序列扩增后,得到一略大于250bp的序列,测序后分析发现其中有36bp与ARG基因DNA序列的5’端重叠。因此,将精氨酸酶基因的DNA序列又向前延伸了221bp,与前面得到的序列拼接后得到一条1486bp的总序列,将该序列在NCBI上进行ORF的寻找发现其最长的ORF达1164bp,起始密码子在第156位,终止密码子在第1319位,该起始密码子前32位为TATA盒的位置。因此,确定该SjARG基因全长cDNA编码序列长应为1164bp。结论成功扩增获得了日本血吸虫精氨酸酶基因编码区的DNA序列,其不舍有内含子;并扩增得到了该基因的启动子序列,从而获得了SiARC基因真正的全长cDNA序列,为进一步的功能鉴定奠定了基础。     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

间日疟原虫海南株SSUrRNA编码基因的克隆及其序列分析

目的克隆间日疟原虫海南株红内期小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）编码基因片段,并进行序列特征分析。方法采用聚合酶链反应技术从海南间日疟患者血样DNA中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切和PCR鉴定后,进行序列测定,采用BLAST软件分析其特征。结果 PCR扩增出间日疟原虫红内期SSUrRNA基因特异性片段大小约为998 bp;阳性克隆重组质粒经双酶切及PCR鉴定与预期结果一致;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有998个核苷酸,与GenBank中的间日疟原虫Sal 1株、Pv2008/TR/DEL株及El Salvador株相同序列进行比对,其同源性均大于99%。结论成功克隆间日疟原虫海南株红内期SSUrRNA编码基因序列,该序列在不同地理株间相对稳定保守。     

16SrRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的：运用16SrRNA基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法：提取细菌DNA,采用通用引物PcR扩增16SrRNA基因片段并测序。将测序结果用Blastn在线软件在Nucleotide数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果：12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。结论：16SrRNA基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

16S rRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的: 运用16S rRNA 基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法: 提取细菌DNA,采用通用引物PCR扩增16S rRNA 基因片段并测序。将测序结果用Blastn 在线软件在Nucleotide 数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果: 12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。 结论: 16S rRNA 基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

Surgical strategy for mild ischemic mitral insufficiency

Background Accurate identification of bacterial isolates is an essential task in clinical microbiology. This study compared culturing to analyzing 16S rRNA gene sequences as methods to identify bacteria in clinical samples. We developed a key technique to directly identify bacteria in clinical samples via nucleic acid sequences, thus improving the ability to confirm pathogens.Methods We obtained 225 samples from Beijing Tongran Hospital and examined them by conventional culture and 16S rDNA sequencing to identify pathogens. This study made use of a modified sample pre-treatment technique which came from our laboratory to extract DNA. 16S rDNA was amplified by PCR. The amplified product was sequenced on a CEQ8000 capillary sequencer. Sequences were uploaded to the GenBank BLAST database for comparison.Results Among the positively cultivated bacterial strains, seven strains were identified differently by Vitek32 and by 16S rDNA sequencing. Twelve samples that were negative by standard culturing were determined to have pathogens by sequence analysis.Conclusion The use of 16S rRNA gene sequencing can improve clinical microbiology by providing better identification of unidentified bacteria or providing reference identification of unusual strains.     

乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定

【目的】构建乳酸菌同源重组载体,实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。【方法】根据乳酸菌L.lactis MG1363全基因组中ThyA基因序列设计引物,PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码上游及终止密码下游约1000bp的基因序列,将获得的目的基因依次克隆至载体pMUTIN4中,以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,以双酶切技术、DNA测序予以确证。【结果】琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因成功扩增,双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pThyA-up-down。【结论】乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。     

一种新型双重靶向性抗乳腺癌融合蛋白原核表达质粒的构建

目的：利用基因重组技术,构建Del1-9-G129R-T3双重靶向性抗乳腺癌融合蛋白的原核表达质粒。方法：以质粒pET22b-G129R-G129R为模板,PCR扩增两端带有NdeI和BamHI识别序列的目的基因Del1-9-G129R-hPRL。根据T3的碱基序列,采用重叠延伸PCR技术人工设计合成三段引物,扩增两端带有BamHI和XhoI识别序列的T3目的基因片段。将纯化的Del1-9-G129R-hPRL、T3作为模板,利用前者的上游引物和后者的下游引物,PCR扩增带有NdeI和XhoI识别序列的融合基因Del1-9-G129R-T3,克隆到T载体,双酶切后插入pET22b（＋）多克隆位点,构建原核表达载体pET22b-Del1-9-G129R-T3。经DNA测序正确后,将重组表达质粒转化原核表达菌BL21（DE3）。结果：质粒测序显示重组融合蛋白基因序列除两处同义突变外与GenBank中记载的碱基序列完全一致。结论：成功构建了融合蛋白Del1-9-G129R-T3基因原核表达质粒。     

金黄色葡萄球菌SEB基因的克隆及其系统发生分析

目的克隆和测定金黄色葡萄球菌深圳分离株S4070肠毒素B（SEB）基因序列,并作系统发生分析。方法采用PCR法从金黄色葡萄球菌S4070基因组中扩增出SEB基因片段,纯化后与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB,并转化E.coli DH5α;阳性克隆质粒经双酶切法鉴定后,采用双脱氧末端终止法作序列测定,并以BLAST和MEGA4软件分析其分子特征。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约704bp的基因片段,阳性克隆质粒鉴定结果与预期一致;序列测定结果显示,所克隆的SEB基因片段含704个碱基,与GenBank中17株金黄色葡萄球菌SEB基因序列比对,无碱基的插入或缺失,同源性均为98%以上;基于SEB基因序列,采用邻位连接法（Neigh bor-joining）构建系统发生树,深圳S4070株与日本分离株NN35、NN37、NN41-F1D、NN41-F1F和NN41-F1G以及印度分离株DQ535901、DQ535902的遗传距离小,同处在一个分支群上。结论实验成功克隆了金葡菌深圳株S4070 SEB基因,不同分离株间SEB基因序列相对保守,本分离株与日本和印度分离株遗传关系较近。     

2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3'旁侧序列比较

目的：比较扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列的2种PCR方法。方法：用pvuⅡ、EcoR Ⅴ和StuⅠ3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后，供2种PCR用，一种是连接介导法PCR(LMPCR)，与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列；另一种是反向PCR(IPCR)，酶切后的DNA自身环化做模板，用2对基因特异引物反向扩增。结果：2轮PCR后，LMPCR中得到大量的非特异扩增产物，测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和Stu Ⅰ消化的自连文库中扩增得到2．5kb特异产物，经测序发现，片段两侧为基因特异引物，部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论：IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。