中国炭疽芽胞杆菌中11个串联重复序列位点的特征和分布

目的检测炭疽芽胞杆菌中可变数量串联重复序列(VNTR)的变化,分析我国菌株中VNTR的特征和分布规律。方法 PCR扩增,琼脂糖电泳和毛细管电泳,测序验证,BLAST比对等。结果 11个VNTR位点中有4个在所有菌株中没有差别,另外7个位点只在个别菌株中检测到差别,有差别的菌株多分布在新疆;11个VNTR位点均位于基因编码区内,编码对细菌生存重要的蛋白和一些功能不明蛋白。结论结果提示新疆的菌株类型较复杂;本研究中的VNTR位点比较保守,可能不能用于区别不同的炭疽芽胞杆菌,但对于了解炭疽芽胞杆菌的基因组特征以及鉴定炭疽芽胞杆菌具有一定的作用。     

单核细胞增多性李氏杆菌TA分离株P60基因的克隆与表达

目的对单核细胞增多性李氏杆菌TA分离株入侵相关蛋白P60基因进行克隆、测序和表达。方法利用PCR方法扩增P60基因,克隆入T载体中进行测序,并亚克隆到大肠埃希菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1122bp,编码374个氨基酸,其中前25个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank已经报道的5个不同分离株P60基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分别在96.4%～99.6%和97.1%～99.8%之间。在推导的P60蛋白氨基酸序列中,存在9个潜在的N-联糖基化位点,5个Thr-Asn重复序列区,Thr占所有氨基酸残基的16.3%。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子质量单位为45.6ku的重组蛋白,Western blot分析表明重组蛋白为特异的。经凝胶薄层扫描,重组蛋白表达量可占菌体蛋白的31.6%。结论成功克隆和表达了单核细胞增多性李氏杆菌TA分离株P60基因。     

新疆结核分枝杆菌临床分离株VNTR基因型的初步研究

目的研究新疆结核分枝杆菌可变数目串联重复序列（variable number tandem repeats,VNTR）基因分型,初步了解其基因型多态性状况及主要流行株。方法在新疆维吾尔自治区胸科医院收集一个连续时间段的结核分枝杆菌临床分离菌株,采用多位点可变数目串联重复序列分析（the Multiple Loci VNTR Analysis, MLVA）方法进行基因分型研究。基因聚类分析采用BioNumerics 5.0数据库软件。结果共收集到结核分枝杆菌临床分离菌株175株,运用MLVA 175株菌可分为8个基因群（分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ）119种基因型,其中Ⅰ群所占比例最大,达69.14%,经与Spoligotyping结果综合分析,I群即是北京家族,Ⅱ群为CAS家族。结论新疆结核分枝杆菌临床菌株存在明显的VNTR基因多态性,主要流行菌株为VNTR Ⅰ群（北京基因型）,首次发现新疆临床菌株中存在CAS家族。     

荧光定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究

目的利用LightCycler建立一种简便、特异的实时荧光定量PCR检测方法,用于炭疽芽孢杆菌的快速检测。方法采用SYBR GreenⅠ随机掺入法,利用本实验室建立的实时荧光定量PCR反应体系,根据炭疽芽孢杆菌荚膜和水肿因子设计引物,同时检测两个毒力相关质粒的存在,检测其灵敏度和特异性,并以盲测试验进行验证;在此基础上鉴定14株炭疽芽孢杆菌,并测试该法检测土壤模拟污染标本的灵敏度,实验中设置内对照以排除假阴性结果的存在。结果炭疽杆菌基因组DNA的检测灵敏度可达每反应体系0.53pg,两个克隆株提取质粒的检测限分别为每反应体系12拷贝、140拷贝;检测14株炭疽芽孢杆菌及29株非炭疽芽孢杆菌的PCR扩增结果表明,炭疽芽孢菌DNA均出现特异的扩增结果,29株对照菌的DNA均为阴性;土壤模拟污染标本检测灵敏度可达每反应体系36个芽孢;20次重复实验结果表明其平均值与标准差为14.602±0.640。结论该方法检测炭疽芽孢杆菌具有简便、快捷、灵敏度高和特异性好的特点,为临床诊断、环境监测、卫生防疫等方面,快速检出炭疽芽孢杆菌提供了有利的手段。     

不同疟区恶性疟原虫地理株谷氨酸富有蛋白基因R2区序列分析及分型

[目的 ]测定云南与海南两省不同疟区恶性疟原虫分离株谷氨酸富有蛋白 (GLURP)基因的部分序列及了解其分型。[方法 ]采用套式PCR方法特异性扩增GLURP基因R2区片段 ,并将该基因片段克隆于T载体 ,用双脱氧末端终止法测定不同长度的阳性克隆核苷酸序列 ,并应用DNAStar软件对云南与海南两省分离株GLURP基因及蛋白序列进行比较和分析。[结果 ]首次发现云南与海南两省恶性疟原虫至少存有 7个大小不同的GLURP等位基因型虫株 ,其基因片段变化范围为 6 0 0～ 15 0 0bp。不同分离株的GLURP基因R2区具高度保守性 ,其由编码 19～ 2 0个氨基酸的碱基的基本重复单位构成 ,该基因具有长度的多态性 ,表现在碱基基本重复单位的数目不同。序列分析结果表明 ,我国不同分离株之间或同一地区不同株之间GLURP基因及氨基酸序列具有高度的同源性 ,无明显的地理差异。 [结论 ]不同分离株GLURP基因结构的高度保守性及碱基重复片段数目的多态性 ,对研究疫苗候选抗原和建立疟原虫基因分型方法具有一定理论价值。     

依赖利福平结核分枝杆菌相关蛋白的氨基酸及其编码基因序列研究

目的 研究临床依赖利福平结核分枝杆菌（依R菌）相关蛋白的氨基酸及其编码基因序列。方法以罗氏绝对浓度法药敏实验鉴定临床依R菌株（49株）、耐R菌株（54株）和R敏感菌株（30株），用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）法对不同临床菌株及H37Rv标准株共计134株菌株的菌体蛋白质图谱进行比较分析，通过Q-TOF2型毛细管液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱仪（LC-ESI-MS-MS）对其差异表达蛋白的氨基酸序列进行鉴定，并用对其蛋白的编码基因进行DNA序列分析。结果不同菌株的SDS-PAGE菌体蛋白图谱基本相似。49株依R菌有4l株（84％）在含R管中的菌体蛋白图谱有一条相同的高表达蛋白带（相对于标准物分子质量43000的下端），约占总菌体蛋白的30％～50％，H37Rv标准株、28株R敏感菌（28／30）及44株耐R菌（44／54）的含R管和对照管的蛋白图谱相似，且无相应的高表达现象；该高表达蛋白经氨基酸序列鉴定为结核分枝杆菌H37Rv假设蛋白Rv0341，相对分子质量为43894，等电点（PI）5．25，得分183。不同菌株的Rv0341编码基因1440bp扩增片段，经DNA测序分析均未发现突变。结论利福平对Rv0341在依R菌中的表达有上调作用，Rv0341与依R菌相关，可视为依R菌的相关蛋白或标志物；Rv0341与依R菌的毒力及细胞壁的合成是否相关有进一步的研究价值。     

莱姆病螺旋体P39蛋白的基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的　克隆并表达我国莱姆病螺旋体分离株 Bm p A即 P39基因 ,为制备莱姆病螺旋体基因工程重组抗原以用于我国莱姆病的基础与临床诊断研究奠定基础。方法　应用 PCR方法及基因重组技术对我国莱姆病螺旋体分离株 P39蛋白进行全基因克隆 ,并在此基础上去掉信号肽序列 ,将 P39基因插入原核表达载体 L KB2 ,在大肠杆菌 BL 2 1(DE3)中进行诱导表达。表达产物以 SDS— PAGE电泳、Western blot、薄层扫描分析。结果　成功地克隆了 P39基因 ,序列分析显示 ,P39基因全长 10 2 0 bp,其核苷酸序列及氨基酸序列同源性与国外分离株均较高 ,与 Sh- 2 - 82株皆为 99% ,P39基因在大肠杆菌中以天然蛋白形式得到高效表达 ,扫描分析其分子量为 37k Da,单株表达量占菌体总蛋白的 5 8% ,Western blot实验表明其可与莱姆病患者血清发生特异性反应。结论　成功克隆了莱姆病螺旋体国内分离株 P39蛋白基因并且在原核系统中得到高效表达。重组 P39蛋白具有较好的免疫活性 ,可作为莱姆病新型诊断试剂理想的候选抗原     

2012-2015年贵州省炭疽芽胞杆菌分离鉴定及MLVA分型分析

目的 了解菌株的分子流行病学特征,为贵州省炭疽疫情的预防控制提供科学依据。方法 对2012-2015年贵州省间不同地区的409份标本(外环境388份、患者19份和牲畜2份)进行炭疽芽胞杆菌分离培养,采用革兰染色镜检、青霉素抑制试验和噬菌体裂解试验对可疑炭疽菌落进行鉴定,分析菌株检出情况。运用MLVA-15技术对炭疽芽胞杆菌分离株进行基因分型获得各VNTR位点的扩增长度并计算重复单元的重复数目。结合各VNTR位点重复数目,利用NTsys 2.10e软件对不同地区菌株进行聚类分析。结果 从409份标本中分离出34株炭疽芽胞杆菌,检出率为8.31%。其中341份土壤检出33株,检出率为9.68%;17份患者皮肤病灶渗出液检出1株,检出率为5.88%。2015年分离出炭疽杆菌的阳性率最高,占48.72% (19/39)。MLVA-15分析显示,34株菌株被分为3个MLVA型;聚类分析显示,34株菌株被分为A和B两簇,其中A簇又被进一步分为A1和A2分支。来自相同地区或年份的多数菌株聚类关系相对较近。结论 2012-2015年贵州省间各种疑似炭疽送检标本中,土壤的检出阳性率最高,贵州省炭疽芽胞杆菌菌株具有MLVA型别多样性,型别分布和聚类关系具有明显的地域性。     

辽宁省炭疽芽胞杆菌MLVA分型研究

目的 了解辽宁地区炭疽芽胞杆菌的流行特征及菌型基因特征。方法 通过多位点可变数目串联重复序列(Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis,MLVA)分型实验,对2001—2011年辽宁省分离到的6株炭疽芽胞杆菌分离株DNA进行检测,DNA指纹图谱使用BioNumerics 4.0 软件进行统计分析,得出聚类分析结果。结果 聚类分析发现,6株炭疽芽胞杆菌株可分为2个基因型。对于炭疽暴发而言,其可变数目串联重复序列遗传标记具有高度相似性。结论 炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标,在炭疽暴发事件中的病原体溯源上具有重要的意义。     

MLVA方法在军团菌分子分型中的应用评价

目的 探讨MLVA方法在军团菌分型中的可应用性。方法 选用文献报道的9个军团菌VNTR位点,对我国环境水中分离的81株Lp1型军团菌菌株和2株参考菌株进行分子分型研究,并与PFGE和SBT分型结果进行了比较。结果 81株分离菌株9个VNTR位点的等位基因型别数分别为1,3,4,2,3,3,2,4和7,其中部分菌株的某些位点无扩增产物或产物为非目的片断。7个位点PCR产物具有重复单元;Lpms3位点PCR产物无重复单元;Lpms31位点部分菌株PCR产物有重复单元,另一些菌株无重复单元。对于具有重复单元的序列,不同菌株间以及同一菌株内各重复单元的序列变异均较大,3个位点存在不完整的重复单元。根据8个位点的PCR产物电泳结果,81株Lp1型分离菌株分为19个MLVA型。通过PFGE和SBT方法,81株Lp1型分离菌株分别分为46种PFGE带型和21种ST型。结论 MLVA方法的分型能力不及PFGE方法,而与SBT方法分型能力相当。但是,MLVA方法操作简单、成本低廉,而且可对培养阴性的标本进行分型,因此,该方法适合在基层推广应用。     

应用荧光PCR检测土壤、脏器中的炭疽芽孢杆菌

目的用荧光定量PCR方法检测土壤、动物脏器和血液中炭疽芽孢杆菌,评价并优选目标核酸纯化方法。方法采用TaqMan荧光定量PCR技术,以炭疽芽孢杆菌pagA、rpoB2引物探针和相应外标、内标为手段,比较4种从土壤中检测炭疽菌及3种从感染脏器及血液中检测炭疽菌的方法,探讨环境和组织样品中抑制因素对荧光定量PCR检测的影响,优选并确定纯化检验手段。结果应用NaI裂解glassmilk纯化炭疽菌核酸并用荧光定量PCR检验,检出底限为2·5万拷贝/g土壤(pagA),从血液样本的检出限为1000拷贝/ml。结论荧光定量PCR技术和NaI裂解glassmilk纯化制备模板的联合应用可灵敏、特异地从土壤、血液中检测炭疽芽孢杆菌。     

2006-2016年贵州省炭疽芽胞杆菌SNR分型分析

目的 对贵州省2006-2016年分离的炭疽芽胞杆菌进行单核苷酸重复序列分型分析(SNR),了解菌株SNR型别特征,为炭疽疫情监测、调查与溯源提供技术手段和科学依据.方法 提取贵州省2006-2016年间不同地区的炭疽芽胞杆菌菌株基因组DNA,应用SNR各位点引物进行PCR扩增,将扩增产物进行毛细管电泳分析获得各位点序...     

Saccharides cross-reactive with Bacillus anthracis spore glycoprotein as an anthrax vaccine component

Bacillus anthracis is a spore-forming bacterium that causes anthrax in humans and in other mammals. The glycoprotein BclA (Bacillus collagen-like protein of anthracis) is a major constituent of the exosporium, the outermost surface of B. anthracis spores. The glycosyl part of BclA is an oligosaccharide composed of 2-O-methyl-4-(3-hydroxy-3-methylbutanamido)-4,6-dideoxy-d-glucose, referred to as anthrose, and three rhamnose residues. A structure similar to anthrose, 4-(3-hydroxy-3-methylbutanamido)-4,6-dideoxy-d-glucose is found in the side chain of the capsular polysaccharide (CPS) of Shewanella spp. MR-4. Under certain growth conditions the bacteria produce a variant CPS lacking one methyl group on the hydroxybutyrate, 4-(3-hydroxybutanamido)-4,6-dideoxy-d-glucose. Contrary to anthrose, neither of the Shewanella CPSs is 2-O methylated. Here, we report that both Shewanella CPS variants react with anti-B. anthracis spore sera. We also found that these antisera reacted with flagellae of Pseudomonas syringae, reported to be glycosylated with a similar terminal saccharide, 4-(3-hydroxybutanamido)-4,6-dideoxy-2-O-methyl-d-glucose. Sera produced by immunization with Shewanella or P. syringae cells bound to B. anthracis spores but not to Bacillus cereus spores in a fluorescent microscopy assay. These experiments show that methylation of the anthrose at the O-2 of the sugar ring and at the C-3 of 3-hydroxybutyrate are not essential for induction of cross-reactive antibodies. We report the preparation, characterization, and antibody responses to protein conjugates of the two variants of Shewanella CPS. Both conjugates induced antibodies that bound to both Shewanella CPS variants by ELISA and to B. anthracis spores, as detected by fluorescent microscopy. We propose the use of Shewanella CPS conjugates as a component of an anthrax vaccine.     

The integrin Mac-1 (CR3) mediates internalization and directs Bacillus anthracis spores into professional phagocytes

Anthrax, a disease caused by Bacillus anthracis, affects animals and humans. Because the inert spore is the infectious form of the organism that first contacts the potential host, the interaction between the host and spore exosporium is vital to the initiation of disease. Here, we demonstrate that the integrin Mac-1 is essential for the recognition of the major exosporium protein BclA by phagocytic cells. Expression of Mac-1, but not p150/95, in CHO cells markedly enhanced infection with Sterne strain of B. anthracis spores (WT spores). Conversely, CD11b(-/-) macrophages demonstrated a significant decrease in spore uptake when compared with macrophages from normal C57BL/6 mice. However, when CD11b(-/-) macrophages were infected with DeltabclA spores, spore ingestion was no different from their C57BL/6 counterparts. DeltabclA spores were also efficiently internalized by all CHO cell lines tested, independently of Mac-1 expression. Taken together, these results show that there is an alternative Mac-1-independent pathway involved in spore uptake that is unmasked only in the absence of BclA. Survival studies, using C57BL/6 and CD11b(-/-) mice, revealed that CD11b(-/-) mice are more resistant to infection with WT but not DeltabclA spores. Our experiments also show that DeltabclA spores are more virulent than WT spores in C57BL/6 and A/J mice. Overall, our data indicate that the Mac-1/BclA interaction may play a major role in B. anthracis pathogenesis by promoting spore uptake by professional phagocytes and subsequent access to a favorable niche for transport, germination, and outgrowth in lymphoid tissues.     

Analysis of the renin gene intron A tandem repeat region of Milan and Lyon hypertensive rat strains

The region of intron A of the rat renin gene containing a unique tandemly repeated sequence was analysed in the Milan and Lyon hypertensive rat strains and their controls, and in several Sprague-Dawley rats, using an oligonucleotide probe complementary to the tandemly repeated sequence and a renin complementary DNA probe. In the Milan rats, the size of the Bgl II DNA fragment encompassing the tandem repeat region was the same in the hypertensive (MHS) and normotensive (MNS) strains. In the Lyon model, a difference of 1.1 kilobase (equivalent to about 28 copies of the 38 basepair tandem repeat sequence) was observed in the size of the Bgl II fragment of the hypertensive (LH) and normotensive (LN) strains. However, the finding that the size of the fragment in the Lyon low-blood-pressure (LL) strain was the same as that in the LH strain rather than the LN strain suggests that the difference between the two latter strains is not by itself a major cause of the blood pressure difference between them in the intron A tandem region. An analysis of Sprague-Dawley rats, from which the Lyon strains are derived, showed that at least three different renin gene alleles, two with Bgl II fragments of the same size as those seen in the Lyon strains, are randomly segregating in this population.     

4株狂犬病街毒的分离及其核蛋白和糖蛋白序列分析

目的以4株狂犬病街毒分离株及我国南北方不同地区狂犬病病毒街毒为研究对象,通过其核蛋白及糖蛋白基因的同源性及进化分析,比较我国狂犬病流行毒株与人用及兽用狂犬病疫苗株间的基因及抗原性差异,为相关疫苗的研究奠定理论基础。方法以直接免疫荧光法(DFA)检测疑似狂犬病的犬脑标本,以乳鼠颅内接种法(MIT)和细胞培养分离技术(CIT)分离狂犬病病毒,并进行TCID50和LD50测定;以RT-PCR法扩增其核蛋白(N)和糖蛋白(G)基因,克隆入T载体并测序后,下载GenBank内已有的狂犬病病毒数据资源,以(Clustal和MEGA3软件)进行基因同源性比对及系统发生分析。结果从广东、河北两省分离到狂犬病病毒街毒4株,分别命名为GN07、WJ07-1、WJ07-2、GC07;序列分析表明4株狂犬病病毒均为基因1型,其N基因与G基因核苷酸的同源性分别为89.5%~99.9%和87.9%~99.9%,其中GN07与WJ07-1、WJ07-2、GC07的同源性较低。与己知的基因1型狂犬病毒相比,WJ07-1、WJ07-2、GC07与湖南、湖北、云南、浙江等地分离株及印度尼西亚分离株核苷酸同源性最高,分别为97.8%~99.4%和92.2%;GN07与CTN疫苗株核苷酸同源性最高,为94.5%。系统发育分析表明,4株病毒与CTN疫苗株同源性较高,与人用狂犬病疫苗3aG、PV株及兽用狂犬病疫苗ERA株和Flury疫苗株的同源性相对较远。适应细胞培养后,四株街毒的LD50和TCID50最高者为GN07,而WJ07-1较低,差别较大。结论4株狂犬病分离株与我国南北方不同地区狂犬病流行毒株的基因和氨基酸序列存在一定差异,在进化关系上分属于不同的分支。     

Typing of Thai clinical isolates of Mycobacterium leprae and analysis of leprosy transmission by polymorphism of tandem repeats

Mycobacterium leprae isolates from Thai leprosy patients were typed for strain differentiation and analysis of leprosy transmission using the six base tandem repeat, GACATC, in rpoT gene and TTC repeat as genetic markers. M. leprae DNA was isolated from skin biopsies of new untreated leprosy patients living in remote areas or in suburban regions of Thailand where leprosy is in low prevalence. In M. leprae strains of 100 patients, TTC alleles exhibited variations in length with 10 to 30, 33 and 35 repeats, the most common alleles being 15, 16, 17 and 19 repeats. All isolates contained three copies of the six base repeat in rpoT gene. Application of TTC repeats in tracking leprosy transmission in two families with multi-cases identified a single (but different) strain of M. leprae in each family.