血管内皮生长因子反义RNA对人脑垂体瘤细胞的作用

目的 :研究血管内皮生长因子 (VEGF)反义RNA对人脑垂体瘤细胞的抑制作用 ,探讨以VEGF反义RNA进行垂体瘤基因治疗的可行性。方法 :将VEGF反义cDNA、正义VEGFcDNA质粒转染垂体瘤细胞 ,通过Northern印迹杂交鉴定其表达 ,测定被转染细胞生长率 ,用原位杂交和免疫组化法检测VEGFmRNA及蛋白表达。结果 :经鉴定被转染的垂体瘤细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达 ,其VEGFmRNA及蛋白表达水平降低 ,但其生长速率无明显减慢。结论 :VEGF在垂体瘤血管形成及发生、发展中起重要作用 ,可能成为基因治疗垂体瘤的优选靶的之一。     

人反义VEGF121 cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121cDNA真核表达质粒，研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法 将VEGFl21反向克隆人真核表达载体pcDNA3中，酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24，G418筛选获得阳性克隆，RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达，ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24．细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121cDNA质粒表达重组质粒。VEGFl21反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达，转染后肿瘤细胞VEGFmRNA和VEGF蛋白表达都明显减少；转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱；形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀，核染色质边集，凝集成块，可见明显的凋亡改变。结论 成功构建了反义VEGF121cDNA真核表达质粒，转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖，为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

血管内皮生长因子_(165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的　探讨应用血管内皮生长因子165(VEGF165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的可行性。方法　构建和鉴定反义VEGF165真核表达载体 ;将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44 ,检测其转染前、后的生物学性状 ;比较转染前、后SHG44细胞的裸鼠皮下致瘤性 ;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果　成功构建反义VEGF165真核表达载体并在SHG44细胞获得表达 ,该细胞生物学性状不受外源基因表达影响 ,其在裸鼠皮下致瘤性和血管生成能力明显下降。肿瘤终体积 :实验组 2 12mm3,对照组 7897mm3(P <0 .0 1) ;血管计数 :实验组 5 .5 0 ,对照组11 2 2 (P <0 .0 1)。结论　VEGF165反义RNA能有效抑制人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长 ,为基因治疗实体瘤奠定了基础     

人反义VEGF_(121) cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法将VEGF121反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达,ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121 cDNA质粒表达重组质粒。VEGF121反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达,转染后肿瘤细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达都明显减少;转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。结论成功构建了反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖,为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

VEGF165反义RNA表达对人胃癌细胞恶性生物学行为的影响

目的利用本室构建的反义VEGF165（血管内皮生长因子,vascular endothelial growth factor）真核表达载体,研究VEGF反义RNA表达对人胃癌细胞生物学表型的影响. 方法用阳性脂质体介导的基因转染技术,将VEGF反义RNA重组体转入人胃癌细胞系,观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学表现. 结果 VEGF反义RNA重组体转染胃癌细胞后,斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,反义RNA基因转染技术可使VEGF的表达明显减弱;与未转染的细胞相比,G2/M期细胞增加(0.39),而S期细胞减少(0.54);克隆形成率(2.2%)低于未转染细胞(4.0%);肿瘤细胞接种裸鼠后33 d时,VEGF反义RNA表达人胃癌细胞所致的移植瘤体积（345±136) mm3明显小于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF反义RNA可以通过抑制肿瘤组织血管生成而防治肿瘤的生长,另外VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。     

血管内皮生长因子反义RNA抑制人喉鳞癌的生长

目的　观察血管内皮生长因子1 6 5反义 RNA对人喉鳞癌细胞 Hep- 2的作用 ,探讨其治疗喉癌的可行性 .方法　采用亚克隆技术 ,构建并鉴定反义 VEGF1 6 5真核表达载体 ;重组质粒转染人喉鳞癌细胞 Hep- 2后 ,将其接种于裸鼠皮下 ,利用原位杂交、EL ISA、激光共聚焦、图像分析及微血管计数等方法 ,观察转染前后 Hep- 2细胞的生物学性状和致瘤性的改变 .结果　构建的 VEGF1 6 5反义真核表达载体在 Hep- 2细胞中获得表达 ,转染后的细胞 VEGF1 6 5的表达下降 70 % ,其生物学性状不受外源基因表达的影响 ,但其在裸鼠皮下的致瘤性和血管生成能力明显下降 ,实验组、空载体组和对照组肿瘤体积分别为 (736± 2 6 2 ) ,(74 4 0± 335 )和 (772 0± 35 0 ) mm3(P<0 .0 1) ,微血管密度分别为 (9.6± 5 .4 ) ,(45 .5± 8.4 )和 (48.4± 7.6 ) mm- 2 (P<0 .0 1) .结论　 VEGF1 6 5反义 RNA能够显著减少喉癌细胞内 VEGF1 6 5的表达 ,具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用 ,有望成为抗喉癌的新基因治疗手段 .     

Survivin与VEGF基因反义寡核苷酸联合应用人肺腺癌A549细胞作用研究

目的：探讨脂质体介导的血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）与生存素（Survivin）基因反义寡核苷酸联合应用对人肺腺癌细胞系A549生长的影响。方法：构建 VEGF 与 Survivin基因反义寡核苷酸,以脂质体转染人肺腺癌A549细胞。实验分为对照组、脂质体对照组、VEGF反义转染组（VEGF ASODN组）、Survivin反义转染组（Survivin ASODN组）、联合转染组（VEGF ASODN+Survivin ASODN组）。采用RT-PCR检测VEGF与Survivin基因表达;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡、检测VEGF与Survivin蛋白表达;MTT观测细胞生长;平板集落实验分析细胞增殖克隆能力。结果：脂质体介导的VEGF与Survivin基因反义寡核苷酸联合转染组A549细胞存活率和增殖克隆能力明显低于其余组,差异有统计学意义（P=0.043,P=0.049,P=0.038,P=0.023）。流式细胞仪分析显示联合转染组细胞周期被阻滞,Survivin蛋白表达低于其余组,与对照组差异有统计学意义（P=0.017,P=0.002）,VEGF蛋白表达低于其余组,与对照组差异有统计学意义（P=0.013,P=0.003）。RT-PCR检测结果显示联合转染组VEGF与Survivin基因表达低于其余组。结论：VEGF与Survivin基因反义寡核苷酸联合应用抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,延长细胞周期,抑制 VEGF与Survivin基因表达。为后续的动物实验打下了理论依据。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制Lewis肺癌的血管形成

目的 探讨反义寡核苷酸(ASODN)抑制Lewis肺癌细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达的效应.方法 将人工合成的VEGF反义寡核苷酸(ASODN)、正义寡核苷酸(SODN)加入培养的Lewis肺癌细胞中,检测Lewis肺癌细胞中VEGF蛋白的表达,同时测定各上清液刺激血管内皮细胞生长的受抑情况.结果 VEGF-ASODN能明显抑制Lewis肺癌细胞VEGF蛋白的表达,而且可以通过抑制VEGF的表达抑制内皮细胞的生长.结论 VEGF反义寡核苷酸抑制肺癌细胞表达VEGF,有望成为肺癌基因治疗的一种新的治疗手段.     

肝癌相关抗原HAb18G反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的 构建HAb18G反义RNA表达质粒载体。方法 用DNA重组技术将人HAb18G基因反向克隆到真核表达质粒PCI－neo中，构建成HAb18G反义RNA表达质粒PCI－asHAb18G。用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HHCC，经G418筛选后获得的克隆进行鉴定。结果 HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。流式细胞仪及免疫组化SP法染色均证实：转染细胞HHCC／asHAb18G中HAb18G表达为阴性，而转染空载体的HHCC／neu及HHCC均为强阳性。结论 成功构建了HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G。为进一步研究HAb18G蛋白分子的生物学功能及肝癌的基因治疗研究奠定了基础。     

反义人端粒酶RNA诱导肝癌细胞凋亡的分子生物学机制研究

目的 探讨反义人端粒酶RNA( human telomerase RNA,hTR)基因对肝癌细胞株Bel-7402凋亡的诱导作用及其分子生物学机制.方法 利用前期实验成功转染人端粒酶正、反义RNA基因的肝癌细胞,分为正义转染组(Bel-7402-hTR-EcoRI)、反义转染组(Bel-7402-hTR-BamHI)和空白对照组(Bel-7402).PCR鉴定转染结果,hoechst 33258荧光染色观察3组细胞的变化,实时荧光定量PCR法和Western blot法分别检测凋亡相关基因p53、Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白的表达水平.结果 与正义转染组及空白对照组细胞相比,反义转染组部分细胞出现凋亡特征性改变,p53、Bax的mRNA和蛋白表达水平明显升高(P＜0.05),Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05).结论 反义端粒酶RNA可诱导肝癌细胞凋亡,其机制可能是通过上调p53和Bax的表达并下调Bcl-2的表达.     

反义血管内皮生长因子原位表达抑制白血病细胞系K562在裸鼠体内生长并诱导其凋亡

目的观察反义血管内皮生长因子(anti-VEGF)原位表达对白血病细胞系K562在裸鼠体内生长的影响。方法选用白血病细胞系K562裸鼠体内接种成瘤后,肿瘤内注射重组反义VEGF真核表达质粒及空载体和PBS,检测反义VEGF体内转染情况及其对肿瘤生长的影响;免疫组化法比较实验组和对照组移植瘤微血管密度(MVD)及白血病细胞的凋亡情况。结果注射反义VEGF表达质粒能抑制肿瘤的生长,使肿瘤的MVD显著降低(25.6±5.77VS41±3.8,P<0.05),并且使肿瘤细胞凋亡增加。结论肿瘤内注射反义VEGF重组表达质粒在体内能有效转染肿瘤及其周围组织,反义VEGF体内的表达能抑制白血病细胞肿瘤的生长,降低肿瘤内MVD,促进白血病细胞的凋亡。反义VEGF基因治疗策略提供了一种新的白血病辅助治疗方案。     

靶向沉默大鼠星形胶质细胞VEGF表达siRNA的筛选

目的 筛选靶向沉默大鼠星形胶质细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的短链干扰RNA(short interfering RNA,siRNA).方法 建立大鼠星形胶质细胞培养模型,根据siRNA原理设计、构建、合成、纯化和定量4种靶向大鼠VEGF的siRNA(T1,T2,T3,T4),应用琼脂糖凝胶电泳观察其纯度.将合成的4种siRNA转染至星形胶质细胞,应用实时荧光定量RT-PCR检测星形胶质细胞VEGF mRNA含量,应用免疫细胞化学及Western蛋白印迹法半定量星形胶质细胞VEGF的表达.结果 合成的4种siRNA纯度高.转染T1、T2、T3后,培养的星形胶质细胞VEGF mRNA含量、VEGF表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).而转染T4 siRNA的星形胶质细胞其VEGF mRNA、VEGF的表达与对照组相比显著下降(P<0.01).结论 筛选出的T4 siRNA对培养的星形胶质细胞VEGF的表达起特异性抑制作用,其机制与T4 siRNA 使VEGFmRNA的含量减少有关.     

增殖性疤痕中表皮细胞增殖、血管新生与VEGF的表达

目的研究增殖性疤痕中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达,及其与疤痕表皮细胞增殖和血管新生的关系.方法应用免疫组化和RT-PCR法,以正常皮肤、正常疤痕为对照,检测增殖性疤痕中VEGF表达,并研究VEGF与表皮细胞增殖、血管新生的相关关系.结果增殖性疤痕内VEGF蛋白及VEGFmRNA表达明显升高,与正常疤痕、正常皮肤有显著差别.VEGF主要由疤痕表皮角朊细胞分泌,且VEGF蛋白和VEGFmRNA的表达与疤痕组织表皮细胞增殖、血管新生高度相关.结论增殖性疤痕中VEGF蛋白和VEGFmRNA的表达与疤痕增殖密切相关.     

正、反义VEGF基因转染对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖行为的影响

目的探讨正、反义血管内皮生长因子(VEGF)基因对人增生性瘢痕成纤维细胞(HHSFb)增殖行为的影响。方法采用组织块法获取HHSFb,行细胞免疫化学鉴定。构建靶向VEGF基因pcDNA3.1(+)/hVEGF165(正义组)、pcDNA3.1(-)/hVEGF165(反义组)和空质粒pcDNA3.1(+)(空载体组)转染人成纤维细胞,以及未行转染处理的人成纤维细胞(对照组),共设为4组。经G418筛选获得阳性转染细胞克隆。逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)显示VEGF基因在细胞内的表达,上清行酶联免疫吸附反应(ELISA)检测VEGF蛋白表达水平,MTT测定细胞体外生长情况。结果成功构建正、反义VEGF基因表达载体。经统计学分析,与对照组和空载体相比,正义组VEGF mRNA表达增强,蛋白表达增强;反义组VEGF mRNA表达明显减弱,蛋白表达明显降低。MTT结果显示,转染前后细胞体外生长速度基本一致。结论正义VEGF基因重组质粒对HHSFb内源性VEGF的表达有促进作用,反义VEGF基因重组质粒可有效抑制HHSFb内源性VEGF的表达。     

G4PAMAM/VEGFASODN抗乳腺癌血管生成的体外实验研究

目的：探讨G4PAMAM／VEGFASODN复合物体外对乳腺癌细胞MDA—MB-231VEGF、VEGF mRNA表达的影响及血管内皮细胞生长的抑制作用。方法：用透射电镜观测G4PAMAM／VEGFASODN的粒径，在不同的酸碱度下观察G4PAMAM／VEGFASODN的稳定性；将G4PAMAM／VEGFASODN进行体外转染，流式细胞仪测定其转染率，激光共聚焦检测转染阳性细胞，MTT法检测转染后细胞的存活率；免疫组化检测VEGF蛋白的表达，RT—PCR检测VEGFmRNA的表达，MTT法测定此复合物对血管内皮细胞生长的抑制作用。结果：G4PAMAM／VEGFASODN的直径约10nm，呈较均匀的网状排列；酸碱度在5到10的范围内具有较高的稳定性，不同电荷比的G4PAMAM／VEGFASODN均没有出现被解离的现象；48h时G4PAMAM／VEGFASODN组在1：40的条件下转染率明显高于脂质体组；各组转染物均对细胞无明显毒性；VEGF蛋白在G4PAMAM／VEGFASODN转染后的MDA—MB-231细胞胞浆中的染色强度明显减弱，阳性表达率显著降低，VEGFmRNA的表达也受到有效的抑制。结论：G4PAMAM／VEGFAsODN复合物稳定性好、转染率高，是一种有良好应用前景的新型纳米载体基因转移系统；G4PAMAM／VEGFASODN复合物能够高效特异地抑制目的基因VEGF的表达，为进一步进行体内动物实验提供了依据。     

EphA2对结肠癌细胞株HCT116中VEGF和MMP9蛋白表达的影响

目的:探讨EphA2对结肠癌细胞株HCT116中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9, MMP9)蛋白表达的影响.方法:用Western 印迹验证选择高表达EphA2蛋白的结肠癌细胞株HCT116;脂质体转染法将EphA2反义寡核苷酸瞬时转染入HCT116细胞,Western 印迹检测反义寡核苷酸转染效率后, ELISA检测转染前后细胞上清液中VEGF蛋白的表达;明胶酶谱分析法检测转染前后细胞上清液中明胶酶的分泌.结果:EphA2 反义寡核苷酸成功抑制了EphA2总蛋白的表达, 降低了VEGF蛋白和MMP9蛋白的表达.结论:EphA2 反义寡核苷酸通过降低结肠癌细胞株HCT116中VEGF,MMP9蛋白的表达来抑制结肠癌细胞株HCT116的侵袭和转移.     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF蛋白表达的影响

目的:探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠食管癌移植瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法:用4条乙酰肝素酶反义寡核苷酸及1条无关寡聚核苷酸(N-ODN)分别体外培养、转染食管癌EC9706细胞。用上述细胞注射到模型左前腿腹侧皮下,构建裸鼠食管癌动物模型,饲养5周后采用免疫组化SP法对裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF蛋白的表达进行了检测。结果:4条乙酰肝素酶反义寡核苷酸(20mol/L)影响裸鼠体内食管癌移植瘤中VEGF蛋白表达表现出不同程度的抑制作用,实验组中VEGF蛋白表达与N-ODN转染组、未经转染的空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:乙酰肝素酶反义寡核苷酸通过影响裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF蛋白表达,从而抑制肿瘤的浸润转移。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSNC）功能的影响。方法：提取人VSMC总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC，采用Western blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论：已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。