HBx—DNA探针的研制及在肝癌发生机制研究中的应用

将非放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ／ＥｃｏＲ Ｉ酶切片段（３．２ｋｂ）制备ＨＢＶ－ＤＮＡ探针及由ＨＢＶ／ＢａｍＨ Ｉ、Ｂｇｌ Ⅱ酶切片段（０．５９ｋｂ）制备ＨＢｘ－ＤＮＡ探针。将Ｄｉｇ－ＨＢＶ ＤＮＡ探针用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测筛选肝细胞性肝癌ＨＢＶ－ＤＮＡ整合型标本，进而用Ｄｉｇ－ＨＢｘ ＤＮＡ探针检测ＨＢＶ－ＤＮＡ纯整合型肝细胞性肝癌中ＨＢｘ的存在情     

HBx-DNA探针的研制及在肝癌发生机制研究中的应用

将非放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ／ＥｃｏＲⅠ酶切片段（３．２ｋｂ）制备ＨＢＶ－ＤＮＡ探针及由ＨＢＶ／ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ酶切片段（０．５９ｋｂ）制备ＨＢｘ－ＤＮＡ探针。将Ｄｉｇ－ＨＢＶＤＮＡ探针用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测筛选肝细胞性肝癌ＨＢＶ－ＤＮＡ整合型标本，进而用Ｄｉｇ－ＨＢｘＤＮＡ探针检测ＨＢＶ－ＤＮＡ纯整合型肝细胞性肝癌中ＨＢｘ的存在情况。结果显示，７５％（３３／４４）的肝癌ＤＮＡ中有ＨＢＶ－ＤＮＡ存在，其中，以纯整合型方式存在的为６３．６％（２１／３３），混合型为３６．４％（１２／３３），无游离型。纯整合型ＨＢＶ－ＤＮＡ片段中，ＨＢｘ－ＤＮＡ阳性率为９０．５％（１９／２１）。提示ＨＢＶ在肝细胞性肝癌的发生中起着重要的作用，ＨＢＶ－ＤＮＡ可能以片段性整合的方式存在于肝癌细胞染色体上，其中以ＨＢｘ基因的整合为主。     

HBVDNA基因型与肝细胞肝癌的预测相相关研究

将百放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ重组质粒ＥｃｏＲＩ酶切片段制备了乙型肝炎病毒ＤＮＡ探针。用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、原位杂交技术，结合乙肝血清学指标、ｓＩＬ－２Ｒ测定等综合分析了慢性乙型肝炎１７８例及肝细胞肝癌５４例的肝细胞、血清、淋巴细胞、唾液内ＨＢＶＤＮＡ存在类型、复制表达状态、分布定位特点与病发展趋势的相关性，探讨了肝癌高危人群肝组织可能发生恶性转化的预测     

人肝细胞癌及癌旁肝组织HBV—DNA的原位杂交检测

探讨乙型肝炎病毒ＤＮＡ五增生结了和肝癌的关系，应用原位杂交技术检测５８例肝细胞癌及癌旁组织中ＨＢＶ－ＤＮＡ的表达。结果 肝细胞癌及癌旁组织中ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率分别为３７．９％和４４．８％〉差异无显著性。ＨＢＶ－ＤＮＡ在癌旁组织中主要位于胞浆内，而肝癌组织中以胞核定位为主。     

肝细胞癌患者血清与癌组织中抗HCV及HCVRNA的检测

８８例经病理确诊的肝细胞癌患者，用ＥＬＩＳＡ法检测其血清抗－ＨＣＶ与ＨＢＶ－Ｍ，阳性率分别为１４．７７％和９０．９１％。用ＰＣＲ法检测发现血清ＨＣＶＲＮＡ阳性１２例（１３．６４％）；１１例血清ＨＢＶＤＮＡ阳性病人的肝癌组织中８例ＨＢＶＤＮＡ阳性；１例肝癌组织中同时检出ＨＣＶＲＮＡ与ＨＢＶＤＮＡ。结果表明，本组肝癌的发生主要与ＨＢＶ感染有关。而与ＨＣＶ感染也可能有一定关系。     

肝细胞癌患者血清与癌组织中抗HCV及HCVRNA的检测

８８例经病理确诊的肝细胞癌患者，用ＥＬＩＳＡ法检测其血清抗ＨＣＶ与ＨＢＶ－Ｍ，阳性率分别为１４．７７％和９０．９１％。用ＰＣＲ法检测发现血清ＨＣＶＲＮＡ阳性１２例（１３．６４％）；１１例血清ＨＢＶＤＮＡ阳性病人的肝癌组织中８例ＨＢＶＤＮＡ阳性；１例肝癌组织中同时检出ＨＣＶＲＮＡ与ＨＢＶＤＮＡ。结果表明，本组肝癌的发生主要与ＨＢＶ感染有关，而与ＨＣＶ感染也可能有一定关系。     

人肝细胞癌及癌旁肝组织HBV-DNA的原位杂交检测

①目的探讨乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ与增生结节和肝癌的关系。②方法应用原位杂交技术检测５８例肝细胞癌（ＨＣＣ）及癌旁组织中ＨＢＶ－ＤＮＡ的表达。③结果肝细胞癌及癌旁组织中ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率分别为３７．９％（２２／５８）和４４．８％（２６／５８），差异无显著性（χ２＝０．５６，Ｐ＞０．０５）。ＨＢＶ－ＤＮＡ在癌旁组织中主要位于胞浆内，而肝癌组织中以胞核定位为主。２２例ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性的ＨＣＣ中，１６例ＨＣＣ及癌旁组织均阳性，６例ＨＣＣ单独阳性，两者差异有显著性（χ２＝９．０９，Ｐ＜０．０１）。６例癌旁增生结节中ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性（６／２７），以胞核定位为主。④结论ＨＢＶ感染与ＨＣＣ存在密切关系。癌周组织ＨＢＶ－ＤＮＡ以复制型为主，癌组织内ＨＢＶ－ＤＮＡ以整合型为主；癌旁增生结节为ＨＣＣ的癌前病变。     

肝硬变和肝癌组织内乙型和丙型肝炎病毒核酸的表达

肝硬变和肝癌组织内乙型和丙型肝炎病毒核酸的表达王春杰，王文亮，王伯潭我们应用地高辛贰元－１１－ｄＵＴＰ标记ＨＣＶ５＇非编码区（５＇－ＮＣ）ｃＤＮＡ及ＨＢＶＸ基因为探针，采用原位分子杂交法对５０例肝硬变和４１例肝细胞癌进行ＨＣＶＲＮＡ及ＨＢＶＤＮＡ定位...     

肝硬变及肝癌组织内原位杂交检测HCV RNA及HBV DNA

肝硬变及肝癌组织内原位杂交检测ＨＣＶＲＮＡ及ＨＢＶＤＮＡ王春杰，王文亮，王剑波，王伯（病理学教研室）关键词肝细胞肝癌；肝硬变；丙型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；原位分子杂交中图法分类号Ｒ７３５．７近年来国外非常重视丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）与肝细胞肝癌（ＨＣＣ...     

PCR证明肝癌细胞有HBV－DNA复制

用恰跨过ＨＢＶ－ＤＮＡ的ＤＲ１、ＤＲ２两个缺刻的特制引物对２１例肝癌及其癌旁组织作巢式ＰＣＲ。其目的基因为ＨＢＶ的复制模板ｃｃｃＤＮＡ。同时作ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ免疫组化。结果４例癌组织、６例癌旁组织呈ｃｃｃＤＮＡ阳性，其ＰＣＲ产物在３３５ｂｐ处，条带清晰；阴性对照呈阴性，首次发现肝癌细胞内有ｃｃｃＤＮＡ，证明了肝癌细胞有ＨＢＶ复制模板，有复制。该４例ｃｃｃＤＮＡ阳性中其癌细胞的ＨＢｓＡｇ、ＨｋＡｇ阳性率亦显著高于ｃｃｃＤＮＡ阴性者。此外，ＨＢＶ复制可发生于各种不同分化的肝癌细胞。     

TTV与HBV混合感染的研究

目的：探讨输血传播病毒（TTV）与HBV混合感染对HBV复制的影响。方法：应用微板核酸杂交-ELISA法检测175例HBV患者血清中的TTV-DNA，ELISA法进行乙型肝炎相关病毒标志物检测。结果：175例HBV患者中TTV-DNA阳性30例（17．1％），其中无症状携带者、慢性肝炎、活动性肝硬化、原发性肝癌患者中的TTV-DNA检出率分别为3／21（14．3％）、13／76（17．1％）、8／50（16．0％）、6／28（21．4％），各组间差异无统计学意义。在慢性肝炎、活动性肝硬化、原发性肝癌患者中，TTV-DNA阳性组与阴性组各项肝功能指标改变相似。HBV和TTV混合感染组中HBeAg和抗-HBcIgM阳性率低于单纯HBV感染组（P〈0．01和P〈0．05），而血清抗-HBe阳性率则高于单纯HBV感染组（P〈0．01）。结论：TTV的混合感染似乎并不影响HBV所致的肝脏病变程度，对HBV的复制可能有一定的抑制作用。     

乙型肝炎表面抗原定量与原发性肝癌的相关性研究

目的：比较慢性乙型肝炎( CHB)与HBV相关性原发性肝癌患者中乙肝表面抗原( HBsAg)和HBV DNA载量情况。方法采用化学发光法检测403例CHB及肝细胞肝癌( HCC)患者血清乙型肝炎病毒标志物滴度,采用荧光定量PCR技术检测患者血清HBV DNA载量。403例患者按照临床诊断分为CHB组(209例)和HCC组(194例)。结果 CHB组：血清HBsAg 滴度≥250 IU/mL者占89．00%;HBV DNA≥1000 copies /mL者占88．40%。 HCC组：血清HBsAg滴度≥250 IU/mL者占79．90%;HBV DNA≥1000 copies /mL 者占67．70%。两组HBsAg≥250 IU/mL患者的比例差异、HBV DNA≥1000 copies/mL 患者的比例差异均有统计学意义(P<0．05)。结论与CHB相比,HBV相关性原发性肝癌患者HBsAg、HBV DNA载量较低。     

乙肝大蛋白在慢性肝病进展中的检测及临床意义

目的 探讨血清中乙肝大蛋白(LHBs)及HBV DNA水平与慢性肝脏疾病进展的关系.方法用ELISA方法检测161例慢性乙型肝炎、84例HBV源性肝硬化及58例HBV源性肝癌患者血清中大蛋白的表达情况,并与HBV DNA定量分析结果进行比较.结果 慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌患者血清中大蛋白的量分别为(104.31±84.15),(55.83±43.01),(37.81±30.35)g/L.患者外周血中HBVDNA及大蛋白检测阳性率分别为84.16％,83.83％,表现出很好的相关性(r=0.862),且随着疾病进展逐渐降低.结论 乙肝大蛋白检测方便可靠,且与慢性肝病的进展密切相关.     

HBV-M表达模式和HBV-DNA定量与原发性肝癌的关系研究

目的 探讨乙型肝炎病毒血清学标志物(HBV-M)表达模式、HBV-DNA复制水平与原发性肝癌(HCC)的关系.方法 216例原发性肝癌(HCC组),353例慢性乙型肝炎(CHB组),应用酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应方法分别检测两组血清HBV-M和HBV-DNA水平.结果 两组HBV-M表达模式构成差异有统计学意义(P＞0.05),HCC组血清学小三阳(HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性)表达率(62.04%)显著高于大三阳(HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性)表达率(18.98%);CHB组小三阳表达率为61.47%,大三阳为36.83%;CHB组大三阳表达率高于HCC组(P＜0.05).HBV-DNA阳性率HCC组为56.5%,CHB组为79.0%,差异无统计学意义(P＞0.05),但在HBV-DNA阳性患者中,HCC组HBV-DNA复制水平显著低于CHB组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 HCC患者HBV-M表达模式以小三阳为主,其HBV-DNA复制水平较CHB患者低.     

Ⅱ.地高辛标记探针原位杂交检测HCC组织中HBV-DNA的研究

用地高辛标记HBV-DNA探针原位杂交技术检测了25例肝细胞性肝癌组织内HBV-DNA的分布状态。结果表明,25例中原位杂交阳性者20例(80%),有HBV血清学标志的23例中,19例癌组织原位杂交阳性(82.6%)。无HBV血清学标志的2例中,癌组织有1例原位杂交阳性。HBV-DNA在癌细胞内的分布以核内为主,也可见于胞浆中,因而可能有整合型和复制型两种形式。提示HBV感染与肝癌的发生发展密切相关,慢性HBV感染可能成为致癌或促癌的重要因素。     

不良结局家族聚集性乙肝感染者HBV基因分型

目的 探讨不良结局家族聚集性乙肝感染者HBV基因分型情况。方法 A组选择15个家系中54份HBV感染者血清,其中HBV携带者（ASC）30例,慢性乙型肝炎（CHB）7例,肝硬化（LC）13例,肝细胞癌（HCC）4例。B组选择非家族聚集性乙肝感染者60份血清,其中HBV携带者（ASC）36例,慢性乙型肝炎（CHB）10例,肝硬化（LC）9例,肝细胞癌（HCC）5例;应用HBV基因型特异性引物进行聚合酶链反应,经琼脂糖凝胶电泳分析其基因型并进行HBVDNA定量检测。结果 114份血清标本中109份HBVDNA阳性,A组有5份血清HBVDNA检测失败,余49份血清标本中,HBV基因型为C型46例,B/C混合型3例,未检测到其他基因型。B组60份血清标本中,HBV基因型为C型44例,B/C混合型5例,B型11例。两组相比在不同临床类型分布方面均无显著差异。但在肝硬化及肝细胞癌患者中,C型所占比例高,分别为80%和100%。结论 不良结局家族聚集性乙肝感染者,以C型为主,基因型与乙肝病情发展有一定关系。     

原发性肝癌内HBV DNA及HBAg的分布与意义

采用原位分子杂交和免疫组化及双标记技术,对44例原发性肝细胞肝癌及痛旁肝组织进行了乙型肝炎病毒DNA及其表达产物x抗原、核心抗原检测。癌组织中HBV DNA、HBxAg、HBcAg检出率分别为70.5％、65.9％及20.5％;癌旁肝组织依次为76.5％、76.5％及29.4％。HBV DNA及HBxAg主要位于肝细胞浆中,在HBcAg阳性组中的检出率高于HBcAg阴性组(P<0.05)。9例枯否氏细胞浆有HBxAg检出。HBVDNA在癌及癌旁组织中的检出有“伴随现象”。HBcAg多位于核内,部分为核浆型,且总是伴随HBV DNA和(或)HBxAe检出,无一例单独检出HBcAg者。此外,HBxAg可由肝内游离型HBV DNA所表达;肝内核型或浆型HBcAg均可反映HBV的复制。因此,肝内HBxAg的检测可作为HBV感染的灵敏指标之一,进一步证实HBV感染与HCC的发生有密切关系。     

血清学标志阴性的慢性肝炎患者病理与临床

目的了解血清学标志阴性的慢性肝炎患者病理与临床特征。方法对62例血清学标志阴性反复肝功能异常的肝炎患者进行血清肝炎病毒学检测、肝穿刺病理和免疫组化检查、肝功能和凝血功能检查,对其中乙肝患者采用荧光定量PCR方法检测血清乙肝病毒DNA（HBVDNA）。结果62例患者临床诊断与病理诊断的符合率为53．2％,慢性肝炎轻度的符合率较高为69．1％。62例患者肝组织免疫组化检查示28例（45．2％）HBsAg和／或HBcAg阳性,可确诊为乙型肝炎。28例乙肝患者肝组织病理均有炎症病变,其中G1最高占13例（46．4％）,其次G2占10例（35．7％）,G4最少占2例（7．1％）;肝纤维化分期S0占12例（42．9％）,S1占7例（25％）,S4最少占1例（3．6％）。28例患者中10例（35．7％）检测血清HBVDNA阳性,平均（3．3±2．2）×10^3拷贝／ml,肝脏炎症分级及纤维化分期各组之间血清HBVDNA定量水平比较差异无统计学意义（P〉0．05）。HBVDNA阳性和阴性患者的各项指标比较差异无统计学意义（均P〉0．05）。乙肝患者和非乙肝患者各项指标比较差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论血清学标志阴性HBV感染仍是我国原因不明肝病的主要病因之一,且多为慢性肝炎,HBVDNA仍低水平复制,临床表现轻,炎症分级和纤维化程度较轻,但仍可发展为肝硬化。     

HBV感染患者外周血T细胞PD-1基因表达水平的变化与意义

目的:分析HBV感染不同阶段患者外周血T淋巴细胞中PD-1(program death factor-1)分子的基因定量表达情况,探讨PD-1表达水平与血清学指标的相关性。方法:采集并筛选HLA-A2阳性的31例慢性乙型肝炎(CHB)患者、9例急性恢复期乙型肝炎患者(AHB)、15例乙肝相关性肝硬化患者(LC)和10例健康献血者的外周血,实时荧光定量PCR分析总T细胞内PD-1的mRNA水平,同时测定其配体PD-L1、PD-L2在外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清标记物水平,荧光定量PCR检测血清HBV DNA载量,同时进行肝功能检测。结果:以各基因在正常对照组的定量表达水平为基础值,HBeAg阳性CHB组T细胞内PD-1和PBMCs内PD-L1的mRNA表达水平明显升高,与HBeAg阴性CHB组和AHB组比较均有显著性差异,但与LC组比较无统计学意义(P>0.05)。外周血PBMCs内PD-L2的mRNA水平在各实验组中无明显差异(P均>0.05)。在所有检测的CHB患者中,外周血T细胞内PD-1表达水平在高病毒载量组(HBV DNA≥107拷贝/ml)明显高于低病毒载量组(HBV DNA<107拷贝/ml)和正常对照组,且与血清HBV病毒载量成正相关(r=0.41,P<0.01),但与血清ALT水平无明显相关性。结论:外周血T细胞中PD-1基因水平在慢性乙型肝炎患者组,尤其是在HBeAg阳性组和高病毒载量组明显上调,提示T细胞高表达的PD-1可能通过与其配体PD-L1作用而抑制T细胞免疫应答,并导致病毒持续感染。     

原发型肝癌的HBV感染及肝内的HBVDNA

应用~(32)P标记的3.2kb克隆HBVDNA探针对36例原发型肝癌患者的血清和肝组织作HBVDNA斑点杂交,结果:血清、肝癌组织、癌近邻肝组织和癌远邻肝组织的阳性率分别为56％、91％88％和80％,皆高于国内外一些同类研究,说明其HBV感染率比一般认为的还要常见,尽管肝内良恶组织的HBV DNA阳性率未见显著差别。此外,尚对HBV6项血清标记作了检测,结果HBsAg和PHSA·Re的阳性率均较高,分别为83％和75％,说明多数病例的HBV感染仍然处于病毒活动复制阶段。由于血清HBsAb阳性者,肝内HBV DNA全阳性,提示HCC阶段的“保护性抗体”并不能清除病毒感染。