黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

【目的】对黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶基因进行克隆和密码子优化,使其在毕赤酵母(Pichia pastoris X-33)中高效表达。【方法】以黑曲霉基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(Anfae A),并对Anfae A基因进行毕赤酵母密码子偏好性"随机优化"和"一对一优化",全基因合成后分别与表达载体pPICZαA连接,构建表达载体pPICZαA-Anfae A、pPICZαA-op Anfae A I和pPICZαA-op Anfae A II。经Sac I线性化后电转化至P.pastoris X-33中,筛选阳性转化子。摇瓶发酵4.5 d后,测定并比较重组阿魏酸酯酶(re Anfae A)酶活。【结果】密码子优化前阿魏酸酯酶酶活为6.8±0.1 U/m L,基因"一对一优化"和"随机优化"后的重组酶酶活分别为5.2±0.1 U/m L和39.9±0.1 U/m L,"随机优化"后酶活比优化前提高了近6倍,而"一对一优化"后酶活仅为优化前酶活的76.5%。重组阿魏酸酯酶的最适p H为5.5,且在pH 4.5-7.0稳定性较好;最适反应温度50°C,在45-50°C较稳定。【结论】阿魏酸酯酶基因经密码子"随机优化"后进行重组表达,酶活显著提高,对研究阿魏酸酯酶在毕赤酵母及其它宿主中的高效表达具有一定的借鉴意义,也为大规模工业化应用奠定了基础。     

定点突变提高N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活和温度稳定性

【目的】提高N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AiiA)酶活及温度稳定性。【方法】本研究基于AiiA同源蛋白的三维结构对AiiA进行定点突变,分析野生型AiiA及其突变蛋白酶活和温度稳定性。【结果】野生型AiiA较不稳定,在45℃下温浴30 min,或4℃储存5 d后均失去降解N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)的活性。但是突变AiiA蛋白(N65K,T195R和A206E)的酶活力较野生型AiiA均提高了20%以上,且4℃储存时间延长到7 d。此外,突变株N65K比野生型AiiA对高温具有更强的耐受性,在45℃温浴后剩余酶活力达到45%以上,55℃温浴30 min后仍保留5.0%的酶活力。【结论】通过定点突变改造AiiA蛋白结构,提升了AiiA蛋白的酶活和温度稳定性。     

毕赤酵母的密码子用法分析

通过分析Pichia pastoris的28个蛋白编码基因的同义密码子使用情况并计算该酵母的密码子用法,首次确定出P.pastoris的19个高表达优越密码子。这些结果经与已知的Saccharomyces cerevisiae及Kluyveromyces lactis的密码子用法基本相似,但在氨基酸谷氨酸的密码子选择上截然相反,提示这可能属于P.pastoris所偏爱的密码子用法。     

基于密码子优化的蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及分离纯化

【目的】提高蛋白酶K在毕赤酵母中的表达产量,建立分离纯化方法。【方法】首先对蛋白酶K密码子进行优化,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达。然后对甲醇浓度、发酵温度和p H等表达条件进行优化,再对硫酸铵沉淀、亲和层析等纯化工艺进行比对分析。【结果】蛋白酶K密码子优化后实现了在毕赤酵母中的高效表达。在甲醇量0.75%、温度25°C和p H 7.0条件下进行发酵罐培养,蛋白酶K表达量达到2.2 g/L。采用Ni-NTA亲和柱对发酵液进行纯化可以得到较好的纯化效果。【结论】密码子优化后的蛋白酶K在毕赤酵母中高效表达并可以利用Ni-NTA亲和柱进行有效分离纯化。     

密码子优化后的柞蚕溶菌酶在酵母中的表达及活性测定

【目的】提高柞蚕溶菌酶在毕赤酵母中的表达量,对柞蚕溶菌酶活性进行测定。【方法】根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶基因进行优化,并在目的基因3′端加上6个组氨酸标签,优化后的基因克隆至表达p PIC9K载体中,并通过电转化的方法导入毕赤酵母GS115中。利用不同浓度梯度的G418进行高拷贝转化子的筛选,经甲醇诱导实现分泌表达。通过硫酸铵盐析、镍柱亲和层析等工艺分离纯化柞蚕溶菌酶,利用琼脂扩散方法测定柞蚕溶菌酶对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、苍白杆菌及过氧化醋杆菌的抑菌作用,利用比浊法测定酶活大小。【结果】密码子优化后的柞蚕溶菌酶在诱导温度25°C、甲醇量0.75%和p H 7.0条件下实现了最高表达,表达量达到了2.4 g/L,并且纯化后的柞蚕溶菌酶酶活达到23 970 U/mg。【结论】密码子优化后的柞蚕溶菌酶在毕赤酵母中实现了高效表达,纯化后的柞蚕溶菌酶对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、苍白杆菌及过氧化醋杆菌均有抑菌作用。     

毕赤酵母优化表达外源蛋白策略

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种异源蛋白表达的理想系统,但目前并非所有的外源蛋白都能在毕赤酵母中成功高效表达,不同的蛋白表现为不同表达水平、生物活性及稳定性。从遗传因素和表达条件综述了外源蛋白在毕赤酵母中的优化表达策略。     

毕赤酵母表达系统外源基因表达序列优化的软件设计

作为真核生物表达系统,毕赤酵母已成功表达了包括病毒、细菌和真核生物在内的多种外源蛋白。但并非所有的外源序列在毕赤酵母中都能得以高表达,外源序列含有毕赤酵母中低频密码子或是序列中A T含量不合理是限制高表达的重要原因。根据毕赤酵母密码子使用的有关特性,利用遗传算法,建立外源基因表达序列优化的数学模型,并依此设计一套毕赤酵母外源基因表达序列的优化软件。     

密码子优化后的αB-晶状体蛋白基因毕赤酵母重组质粒的构建及表达的初步研究

αB-晶状体蛋白属于小热休克蛋白家族,具有分子伴侣活性。在阿尔茨海默病大脑中,星形胶质细胞表达的αB-晶状体蛋白明显上调,并且这些上调的αB-晶状体蛋白紧密地分布在β-淀粉样蛋白沉积周围。为了在分子水平上研究胞外αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中的作用机制,需要获得大量具有生物学活性的αB-晶状体蛋白。根据毕赤酵母密码子偏好性对人αB-晶状体蛋白基因进行优化,并在目的基因3'端加上6个组氨酸标签,优化后的基因克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体p PIC9K上;电转入毕赤酵母GS115中;优化确定最佳表达条件为:BMGY与BMMY的转接比为2∶1,表达时间为72h,甲醇补加终浓度为0.5%;经Western blotting鉴定,获得20kDa的目的蛋白,以及18.6kDa和13.1kDa两个蛋白质片段,重组目的蛋白出现了部分降解,纯化获得20kDa目的蛋白;利用胰岛素还原法测定该片段具有分子伴侣活性,为进一步研究外源αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中对星形胶质细胞的保护机制奠定基础。     

抗菌肽magainin Ⅱ的密码子优化及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

Magainin Ⅱ是非洲爪蟾皮肤分泌的一种抗菌肽,在低浓度下即能够对细菌、真菌、原虫、肿瘤等都具有杀伤作用,并且与同是来源于非洲爪蟾皮肤的另一种抗菌肽PGLa在杀菌、抗肿瘤等方面具有很好的协同效应。文中分别按照大肠杆菌和毕赤酵母的密码子利用频率,对抗菌肽magainin Ⅱ以及杂合抗菌肽magainin Ⅱ-PGLa,进行了密码子优化。构建了高效表达抗菌肽magainin Ⅱ的原核表达载体,经过蛋白酶切割获得纯化的抗菌肽magainin Ⅱ。同时进一步构建了杂合抗菌肽magainin Ⅱ-PGLa的分泌型毕赤酵母表达载体,实现了杂合抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达。本研究为magainin Ⅱ和magainin Ⅱ-PGLa的生产与应用奠定了基础。     

甲醇毕赤酵母表达木质素过氧化物酶的研究

将含有黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosprium)木质素过氧化物酶基因的甲醇毕赤酵母工程菌进行了鉴定和筛选,筛选得到木质素过氧化物酶活力高的菌株PMLIP08。确定了一步法发酵的最优葡萄糖浓度,优化其发酵培养条件,结果表明葡萄糖的添加量为10g/L时,发酵条件为pH3.0,诱导温度24℃,培养时间12h,甲醇添加量1.1%,诱导时间72h后发酵液中酶活可达4888U/L。     

基因表达水平与同义密码子使用关系的初步研究

提出一个预测基因表达水平和同义密码子使用的自洽信息聚类方法。将同义密码子分成最适密码子、非最适密码子和稀有密码子,认为三者的使用频率是调控基因表达水平的主要因素。基于这一观点,对Ｅｃｏｌｉ和Ｙｅａｓｔ两类生物的基因表达水平和密码子的使用,用自洽信息聚类方法进行了预测。发现高低表达基因明显分开,基因表达水平被分为四级;甚高表达基因（ＶＨ）、高表达基因（Ｈ）、较低表达基因（ＬＭ）和低表达基因（ＬＬ）;     

人重组白蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

The yeast Pichia pastoris was transformed by the multi\|copy Pichia expression vector that can express secreted human albumin.The high level expression of cell line was selected after screening.The expression of human recombinant albumin in Pichia pastoris induced by different methods were compared.The retio of secreted human albumin is 80% in total secreted proteins and the expression level reaches as high as is 10g/L.     

植物基因表达的代谢调控

通过通过代谢物,激素和环境因素对植物几种基因表达的影响,就植物基因表达的代谢调控进行了讨论,提出了开展有关这方面研究的一些设想。     

基因偏好模及其与基因表达水平关系的研究

利用重新定义的碱基片段的相对模式含量,研究了大肠杆菌和酵母基因序列的三碱基偏好模。发现在前导区,起始密码子模式的相对模式含量明显低于其它区,大肠杆菌基因拖尾区和编码终止区中,“SSS”型模式的相对模式含量平均较高。并研究了基因前导区和拖尾区偏好模或禁用模出现频数与基因表达水平的关系,发现基因前导区偏好模使用频数的多少与基因表达水平成正相关关系,而禁用模使用频数的多少与基因表达水平则成反相关关系;在基因拖尾区,偏好模或禁用模使用频数的多少与基因表达水平的关系对于两种生物是不同的。     

pBV220载体中外源基因表达水平定量分析

运用基于螺旋区随机堆积的ＲＮＡ二级结构预测与密码子偏性计算等序列分析技术,分析了ｐＢＶ２２０载体中携带的人白细胞介素２、人白细胞介素４等２２个外源基因的表达水平,结果表明：５‘－３０－３９区域和３’端３０－－３９区域的二级结构有与表达水平具有显的统计学意义;其次是３端９ｂｐ的局部密码子偏性,ＳＤ序列与起始密友子ＡＴＧ之间碱基数在８±３范围内与表达水平无显关系。另外,运用判别分析方法构建了判别函     

不同结构的蛋白编码基因的密码子偏性研究

利用聚类分析方法,对两类具有不同三级结构的75个蛋白的编码基因的密码子使用偏性进行了分析。75个基因样本序列按照对应蛋白的三级结构被很清晰的分成了两类,从而发现密码子的使用与蛋白质的三级结构有很大的相关性。这一重要结果证实了DNA的一维信息中蕴含着蛋白质的三级结构信息。     

HIV－1外膜（env）基因在重组痘苗病毒中的高效表达

应用重组痘苗病毒作载体,在ＡＴＩ、Ｐ７．５突变型早期启动子控制下,高效表达了（经定点突变去除一处早期终止信号的）ＨＩＶ－１ｅｎｖ基因。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证明,晚期启动子活性强的ｐＳＦＪ２－３８能更高效地表达ｅｎｖ基因。经Ｌｅｎｔｉｌ－Ｌｅｃｔｉｎ提取以及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后的激光扫描测定结果,在１０７个感染细胞中可产生５０－７０μｇ的Ｅｎｖ蛋白。     

抗氧化剂对农杆菌介导的大豆下胚轴GUS基因瞬时表达的影响

大豆(Glycine max)下胚轴作为大豆遗传转化的外植体材料,能快速高频再生不定芽。然而,在遗传转化过程中褐化影响基因转化效率。在该研究中,我们用含有GUS染色基因和hpt II(Hygromycin phosphotransferase II)筛选基因的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404侵染大豆下胚轴,并用组织化学定位法测定了GUS基因的瞬时表达,以确定大豆的优化基因转化条件。结果显示,在共培养基中加入硫代硫酸钠、L_半胱氨酸以及二硫苏糖醇等抗氧化剂,可以有效地抑制大豆下胚轴在组培过程中褐化的发生,并大幅度提高农杆菌在下胚轴的瞬时表达率。这些结果说明抗氧化剂可以降低这种影响并有效提高基因转化效率。     

人白细胞介素—2 cDNA在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

白细胞介素—2(IL-2),过去曾称为T细胞生长因子(TCGF),是在促有丝分裂素或特异性抗原刺激下,由辅助性T细胞产生的一种淋巴因子,能在体外长期维持T细胞生长。它可调节免疫反应,促进细胞毒性T细胞和NK细胞增殖,诱生γ干扰素。因而是治疗肿瘤和免疫缺陷病人的非常有希望的药物之一。