小鼠胚胎原始生殖细胞的体外培养

采用细胞生物学方法和组织培养技术研究小鼠胚胎原始生殖细胞(PGCs)的一般形态学特征及生物学特点.在体外培养条件下,PGCs 按体积大小可分大、中、小3类。本研究发现,中、小型原始生殖细胞在培养的第2、3 d 增多,形态似大型原始生殖细胞。培养中的 PGCs 不贴壁而悬浮生长于培养液中,培养到第6～7 d时开始死亡。体细胞(间充质细胞或间皮细胞)贴壁生长,生长旺盛,与PGCs 同时死亡。     

小鼠早期胚胎原始生殖细胞的组织化学研究

对妊娠12.5～16.5d小鼠胚胎的原始性腺做恒冷箱切片与胶原酶分离标本进行组织化学研究。结果证明,原始生殖细胞含有丰富的碱性磷酸酶(AKP)和亮氨酸氨基肽酶(LNAse),后者为作者第一次发现。酸性磷酸酶(ACP),非特异性酯酶(NSE),葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase),琥珀酸脱氢酶(SDH),3-磷酸腺苷酶(ATPase),糖原及脂类含量极少。用AKP染色可把原始生殖细胞分为大、中和小3类,后者与体细胞很难区别。     

小鼠原始生殖细胞源胚胎干细胞的分离培养和建系

目的 :对小鼠胚胎干细胞分离材料的获取及处理、胚胎干细胞分化抑制培养、细胞系的建立及保存所用技术进行探讨。方法 :取胎鼠生殖嵴及其周围组织 ,采用胎鼠的胚胎干细胞与其成纤维细胞共培养的方式进行。结果 :分离得到大量原始生殖细胞(PGCs)集落。多次克隆传代具有胚胎干 (ES)细胞的诸多特征 ,如有连续传代的能力 (有两组分别传至 3代和 4代 ) ,有典型鸟巢状结构 ,AKP染色阳性 ,体外分化实验具有形成类胚体的能力。结论 :从胎鼠生殖嵴中能够获得大量的ES细胞。采用的胚胎干细胞与其成纤维细胞共培养的方式进行胚胎干细胞的分离培养和建系是可行的     

小鼠原始生殖细胞分离培养方式和生物特性研究

目的：探索一种简单高效的分离、培养小鼠原始生殖细胞（PGCs）的方法,为小鼠模型提供充足的PGCs来源。方法体外分离小鼠12.5 dpc胚胎生殖嵴,剪碎后用含血清、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、卵泡刺激素、重组表皮生长因子的α-M EM培养基进行组织块贴壁培养;于倒置显微镜下观察细胞形态,采用流式细胞术检测阶段性特异性胚胎抗原,采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）、细胞免疫荧光等方法检测干细胞的多能性基因Oct4及减数分裂Ⅰ期的几个特异性基因的表达。结果体外分离培养的小鼠 PGCs具有良好的细胞形态、极强的增殖能力,SSEA-1表达阳性,SSEA-4表达阴性,同时检测到Oct4、Stra8、Vasa、SCP3、ZP3表达均为阳性。结论利用该实验方法能培养出高纯度、具有良好干性及极强增殖能力的小鼠PGCs ,并使该细胞进入减数分裂。     

人原始生殖细胞的分离和培养

目的 探讨体外分离培养人原始生殖细胞的条件和方法.方法 分离、培养2～3个月人胚胎的成纤维细胞,经60Co照射后作为饲养层;从5～9周人胚胎的生殖嵴和肠背系膜组织中分离原始生殖细胞,培养在含有bFGF、LIF和Forskolin的人胚胎成纤维细胞饲养层上;同时采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测人原始牛殖细胞阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4以及特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZL的表达,并进行类胚体培养.结果 分离的人原始生殖细胞在饲养层上可以增殖形成典型的鸟巢状集落;细胞染色体均为正常的二倍体核型;阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4表达阳性,同时检测到生殖干细胞特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZI.表达.人原始生殖细胞在悬滴培养时能够形成类胚体,表明其具有多项分化潜能.结论 用人胚胎成纤维细胞作为饲养层进行体外培养人胚胎生殖嵴和肠背系膜组织,分离的原始牛殖细胞形成EG细胞集落,初步鉴定为人胚胎生殖细胞.     

乙醇对小鼠胚胎体外发育影响的研究

用含不同浓度乙醇的Whitten氏培养液对小鼠2细胞、4细胞、8细胞和桑葚期胚胎分别进行体外培养，研究乙醇对小鼠不同发育时期胚胎体外发育的影响。首先利用含0、0．1％、0．5％、1．0％、1．5％、2．0％、3．0％、5．0％、10．0％乙醇的Whitten氏培养液对2细胞胚胎进行培养，观察研究小鼠2细胞胚胎对培养液中乙醇浓度的耐受极限。然后再用含1％和3％乙醇的Whitten氏培养液分别对小鼠2细胞、4细胞、8细胞和桑葚期胚胎进行培养。结果：含低浓度乙醇（1％以下）的培养液对8细胞胚胎和桑葚胚的囊胚形成有促进作用，而在2细胞和4细胞胚胎中则影响不明显。含高浓度乙醇（≥3％）的培养液则对各期胚胎有不同程度的抑制作用，但随着胚胎发育其对乙醇的耐受力将逐渐增强。     

乙醇对小鼠胚胎体外发育影响的研究

用含不同浓度乙醇的 Whitten氏培养液对小鼠 2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎分别进行体外培养 ,研究乙醇对小鼠不同发育时期胚胎体外发育的影响。首先利用含 0 .0 1%、0 .5 %、1.0 %、1.5 %、2 .0 %、3.0 %、5 .0 %、10 .0 %乙醇的 Whitten氏培养液对 2细胞胚胎进行培养 ,观察研究小鼠 2细胞胚胎对培养液中乙醇浓度的耐受极限。然后再用含 1%和 3%乙醇的 Whit-ten氏培养液分别对小鼠 2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎进行培养。结果 :含低浓度乙醇 (1%以下 )的培养液对外细胞胚胎和桑椹胚的囊胚形成有促进作用 ,而在 2细胞和 4细胞胚胎…     

不同发育阶段人胚胎原始生殖细胞的定位及体外培养

目的:对不同发育阶段的人胚胎原始生殖细胞(PGC)进行定位并比较其体外培养的差异.方法:取4～7周发育阶段的人胚胎,应用组织化学法检测PGC内碱性磷酸酶(AP)以对其定位.体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织进行培养,第1次传代后,用AP标记,计数不同发育阶段AP阳性的PGC和体外培养的阳性克隆并进行比较.结果:在卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处有AP强阳性细胞,阳性信号位于胞质内.阳性细胞散在分布,在生殖嵴处聚集成团.不同发育阶段的胚胎组织培养均有阳性克隆出现.统计学分析结果表明,4～7周人胚胎内AP阳性的PGC数目及细胞内信号强度无明显差异(P>0.05);由胚胎组织培养获得的AP阳性克隆数也无显著差异.结论:人PGC位于卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处.4～7周发育阶段,胚胎内PGC数目和体外培养的克隆数无明显变化.     

小鼠原始生殖细胞定向分化为神经样细胞的研究

目的：探讨微囊对原始生殖细胞（PGCs）定向分化为神经样细胞的诱导效果。方法：用原代PGCs经悬浮培养获取类胚体（EBs）;将孕13d胎鼠的大脑半球取出,将其中的神经干细胞（NSCs）作为包在微囊里的成分。待EBs贴壁后将含有NSCs的微囊放入其中,同时另外孔板中放入等量的EBs让其自然分化。将微囊诱导分化出的细胞进行NESTIN、NSE和GFAP免疫染色鉴定。结果：用微囊诱导定向分化为神经样细胞的比例显著高于自然分化的比例。结论：悬浮培养可使PGCs形成EBs,将EBs贴壁培养可自发分化形成内、中和外三个胚层的细胞,即上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞。通过微囊的诱导方法可以使EGs定向分化为神经样细胞。     

亚砷酸钠对雄性小鼠生殖细胞损伤的实验研究

用浓度为1、3、5mg/kg 的亚砷酸钠及40mg/kg 环磷酰胺分别给雄性小鼠腹腔注射5天,于染毒后1、3、5周观察其精子,结果表明,亚砷酸钠是诱发雄性小鼠生殖细胞畸变的诱变剂.     

PDCD4在雄鼠生殖细胞中的表达研究

目的：验证程序性细胞死亡因子4 (programmed cell death 4,PDCD4)在小鼠雄性生殖细胞中的表达。方法：RT-PCR检测PDCD4在不同周龄小鼠睾丸的基因表达情况;Western blot法检测PDCD4在不同周龄小鼠睾丸中蛋白表达水平;免疫荧光法检测PDCD4在雄性生殖嵴以及在不同周龄小鼠睾丸的定位情况。结果：RT-PCR和Western blot结果均显示PDCD4在0周龄小鼠睾丸中开始有表达,并持续表达至成年;免疫荧光显示PDCD4在胚胎期雄性小鼠生殖细胞中也有表达;在出生后0周和1周龄小鼠睾丸中,PDCD4特异表达于精原细胞;在2周龄小鼠睾丸中,PDCD4分布于精原细胞和精母细胞;而在3、4和5周龄小鼠睾丸组织中,PDCD4主要分布于精原细胞、精母细胞与圆形精子细胞。结论：PDCD4分布于胚胎期和出生后各阶段生精细胞,这为进一步研究PDCD4在精子发生中的作用打下基础。     

鼠原始生殖细胞报告基因系统的建立及验证

目的:构建小鼠原始生殖细胞（PGCs）报告基因系统。方法:根据CRISPR基因编辑技术结合同源重组原理,针对鼠Prdm1和Dppa3基因的翻译起始位点ATG附近位置分别设计一对sgRNA,并根据Cas9切割位点以及拟插入目的片段构建相应的用于同源重组的供体质粒,将sgRNA与Donor质粒同时转染入小鼠胚胎干细胞（ESCs）中,并利用质粒携带的抗性基因筛选出目标单克隆细胞,并进行基因型鉴定。结果:通过提取单克隆细胞的基因组DNA进行基因型鉴定,PCR和Sanger测序结果显示,单克隆细胞的基因组中,Prdm1和Dppa3基因翻译起始位点后分别成功插入eGFP和mCherry荧光蛋白编码序列。利用细胞因子诱导eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3mESCs（mouse ESCs）定向分化为mPGCs（mouse PGCs）,流式细胞仪检测显示诱导分化的mPGCs特异表达eGFP和mCherry荧光信号。结论:成功构建mPGCs报告基因系统,可用于后续研究mPGCs命运决定的分子机制,对于研究小鼠早期胚胎发育过程具有重要意义。     

甲基汞对雄性小鼠生殖细胞的毒性作用

目的：研究甲基汞（MeHg）对雄性小鼠生殖细胞氧化损伤、细胞周期、细胞凋亡及其凋亡相关蛋白表达的影响。方法：应用MTT法检测MeHg对雄性小鼠生殖细胞的毒性;采用TBA比色法、OPA荧光法和KI比色法分别检测睾丸生殖细胞中脂质过氧化产物MDA、H₂O₂的含量和GSH-Px酶活性;采用AO/EB染色法和流式细胞术2种方法检测细胞凋亡;采用流式细胞术检测MeHg对细胞周期的影响;应用免疫组织化学方法检测与线粒体途径细胞凋亡相关Caspase-9和CytC蛋白表达。结果：体外给予0.1、1.0、10.0和100.0 μmol•L^-1 的MeHg,随着甲基汞染毒剂量的增加,细胞存活率逐渐降低,作用2、4、8、24和48 h时,1.0、10.0和100.0 μmol•L^-1各剂量组与对照组比较差异有显著性（P<0.05）。体内给予1/100、1/50和1/10 LD₅₀的MeHg,随着甲基汞染毒剂量的增加,睾丸组织中MDA和H₂O₂含量有所增加,各剂量染毒组MDA含量与对照组比较差异具有显著性（P<0.05）。H₂O₂含量随着甲基汞染毒剂量的增加,1/50 LD₅₀、1/10 LD₅₀组与对照组比较差异有显著性（P<0.01）。GSH-Px酶活性随着甲基汞染毒剂量的增加有所降低,各剂量染毒组与对照组比较差异均具有显著性（P<0.05）。随着染毒剂量的增大,凋亡率先增加,1/50 LD₅₀达到最大,1/10 LD₅₀组逐渐降低,1/10 LD₅₀组与对照组比较差异具有显著性（P<0.05）。采用流式细胞术检测,G₂/M期细胞百分数增加,1/50 LD₅₀染毒组时与对照组比较差异具有显著性（P<0.05）。Caspase-9与CytC阳性表达为棕黄色染色。分析结果表明,MeHg各剂量染毒组CytC表达先增加,随着染毒剂量的增加而逐渐降低,CytC表达各剂量染毒组与对照组比较差异具有显著性(P<0.01),Caspase-9 的表达在1/50 LD₅₀组达到最高,1/50和1/10 LD₅₀ 组与对照组比较差异具有显著性(P<0.01)。结论：甲基汞可以引起生殖细胞氧化损伤,影响细胞周期进程,使细胞有丝分裂延迟,并可能诱导细胞凋亡和凋亡相关蛋白的改变,对雄性生殖细胞具有细胞毒性作用。     

大鼠原生殖细胞的形态学及分化特性

目的 研究大鼠胚胎原生殖细胞（Primordial germ cells, PGCs）的形态及其分化特性。方法 取受精后10.5 d的大鼠胚胎作HE染色,取受精后11.0~12.5 d的大鼠胚胎生殖嵴进行PGCs原代培养,光、电镜观察PGCs及其分化细胞的微细结构,碱性磷酸酶 (ALP) 染色检测细胞的分化程度。结果 大鼠PGCs位于卵黄囊内胚层深部的间充质内,体积大,呈椭圆形或不规则形;核大,染色质细密,含1~2个核仁。体外培养可见PGCs大而圆,散在分布,或聚集成团,胞质中含有椭圆形的线粒体和丰富的核糖体,ALP反应呈阳性;培养4~5 d,PGCs形态不规则,有伪足,ALP反应减弱,进一步分化可形成神经元样细胞、表皮细胞、心肌细胞、分泌细胞以及类似血管、心脏的管腔样结构等。由PGCs分化来的细胞ALP反应均呈阴性。结论 大鼠生殖嵴来源的PGCs是一种具有发育全能的、可分化形成3个胚层衍生物的胚胎多能干细胞。     

人原始生殖细胞的体外分离及培养

目的 :探讨人原始生殖细胞 (PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素 .方法 :以胎鼠成纤维细胞为滋养层 ,用1.2 5 g·L-1胰蛋白酶室温下消化胚胎组织 3～ 5min ,分离培养PGCs细胞并观察其克隆形成率 ;进而观察不同浓度白血病抑制因子 (leukemiainhibitoryfactor,LIF)对PGCs克隆在传代及未分化状态的维持等方面的影响 ;最后对PGCs克隆进行碱性磷酸酶活性鉴定及染色体组型分析 .结果 :采用胰蛋白酶消化法可对PGCs进行分离培养 ;PGCs在传代过程中其克隆形成率亦逐渐降低 ;培养基中无LIF时 ,PGCs克隆可分化为心肌样收缩细胞团 ;LIF在阳～ATP掺入法测得不同处理组的MAPK活性分别如下 :Con组 6 9.7± 2 .5 ,Non组 72 .8± 4 .6 ,Lip性 ,在传代过程中其染色体组型未见变异 .结论 :可从人类早期胚胎中分离培养PGCs细胞 ,培养基中LIF的浓度在 5～ 10 g·L-1时以利于提高PGCs培养的成功率并抑制其过早分化 .     

人胚胎原生殖细胞中胚胎干细胞的分离培养

目的：探讨人胚胎原生殖细胞分离培养的条件及在体内、外的分化能力．方法：从5～9wk人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞(PGC），将其置于饲养层上培养，采用大鼠心肌细胞条件培养基(RH-CM)，改变了常规使用添加白血病抑制因子(LIF)的培养液．结果：成功地完成了对PGC的第4代培养；经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合胚胎干细胞(ES)的特性：AP染色呈阳性；体外分化实验显示此细胞具有发育多能性；悬浮培养时能够自然分化成类胚体(EB)．结论：离散生殖嵴和增殖的。PGC克隆的时机和方法是影响建系的关键；PMEF和HEF对人PGC克隆的影响无显差异；添加RH-CM可有效抑制PGC的分化。     

人原始生殖细胞的迁移及表面标志物变化的实验研究

目的探讨人胚胎原始生殖细胞向生殖嵴迁移及其细胞标志物改变.方法人胚生殖嵴或生殖腺经石蜡切片;HE染色,光镜观察;免疫组化方法检测阶段特异性胚胎抗原SSEA-4和SSEA-1的表达;钙-钴法检测碱性磷酸酶(AP)活性;RT-PCR检测4.5、7、9、11周人胚胎生殖嵴中转录因子Oct-4的表达.结果人胚胎第4.5周生殖嵴未见有碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1阳性细胞,且不表达转录因子Oct-4;第5～11周胚胎生殖嵴中持续存在碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1阳性细胞,且表达转录因子Oct-4;第12周胚胎生殖嵴中阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1阳性细胞数量明显减少,但存在碱性磷酸酶阳性细胞.结论人胚胎原始生殖细胞自第5周后开始迁移至生殖嵴,直至第11周后完全分化,其形态学特征为碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1阳性,且表达转录因子Oct-4.     

女性与男性强直性脊柱炎对比研究

目的：了解不同性别的强直性脊柱炎的临床特点。方法：对比性地分析57例女性AS（FAS）患者和114例病程相同的男性AS（MAS）患者（1：2配对）的临床表现及实验室检查结果。结果：平均发病年龄,首发症状,腰椎的X线受累和病情活动指标在两组无差异（P＞0．05）;贫血,外周关节炎和颈椎的受累在女性明显多于男性（P＜0．05）,而全身症状,虹膜睫状体炎,严重的骶髂关节及髂关节的X线受累和HLA－B27的阳性率在女性明显少于男性（P＜0．05）。结论：FAS患者病情发展较慢,预后较好,这与B27阳性率低有一定的关系。