鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

【目的】探明上海某养殖场的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)发生死亡的病因,研究致病菌分类地位和毒力基因携带情况。【方法】通过病原菌的筛查和回感试验,确定发病原因,对16S rRNA基因、gyrB和rpoB管家基因测序,建立病原菌系统进化树,结合API-32E细菌鉴定系统对菌株的生理生化进行鉴定,综合判定致病菌的种类及其分类地位;根据已报道的7个毒力基因fimA、citC、gadB、mukF、katB、esrB和sodB序列,设计引物进行PCR扩增,研究病原菌毒力基因携带情况。【结果】致病菌GY15是导致异育银鲫发病的原因,GY15的16S rRNA、gyrB和rpoB基因与已报道的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)相似性在99%以上,构建系统进化树和API鉴定确定该菌株为E.tarda,腹腔注射回感可导致异育银鲫死亡,半致死浓度(LD_(50))为4.26×105 CFU/m L;已报道的7种毒力基因在该致病菌中均能被检测到;药敏试验结果显示,该菌对恩诺沙星、氟苯尼考和氧氟沙星等15种药物敏感,对新霉素、四环素和复方新诺明等18种药物表现为耐药。【结论】首次报道E.tarda可感染异育银鲫,它对异育银鲫的养殖造成威胁。     

迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型构建及病理分析

【目的】本研究旨在建立迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型,以提供疾病模型用于病理学、药理学和药物学研究。【方法】通过不同途径对斑马鱼进行人工感染,模拟自然感染状态,并研究迟缓爱德华氏菌对斑马鱼的致病机理,包括死亡率、行为变化、生化指标和病鱼机体抗氧化能力的变化情况。【结果】比较3种感染途径,显示腹腔注射的致病力最强。迟缓爱德华氏菌感染后,斑马鱼表现出眼球突出、肛门出血、溃疡和腹水等症状。病理检查显示,感染后的斑马鱼发生急性炎症,可见肝细胞广泛坏死脱落,肝小叶萎缩,周围见吞噬细胞聚集。从患病斑马鱼体内分离出TX菌株,并通过特异性引物聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定为迟缓爱德华氏菌,确定该菌的半致死浓度LD50为3.65×102菌落形成单位(colony forming units, CFU)尾。与对照组相比,注射感染组的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力降低22.26%,丙二醛(malondialdehyde, MDA)显著升高16倍,酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)活性和碱性磷酸...     

迟缓爱德华氏菌EcoRⅠ核糖体自动化分型与聚类分析

【目的】对26株迟缓爱德华氏菌进行自动化核糖体分型,并进行聚类分析。【方法】采用RiboprinterTM全自动微生物鉴定系统对分离自斑点叉尾鮰、日本鳗、多宝鱼、比目鱼、斑醴等宿主体内的迟缓爱德华氏菌进行核糖体分型,以限制性内切酶Eco RⅠ处理、切割菌株DNA;运用Bio Numerics软件分析图像数据。【结果】迟缓爱德华氏菌核糖体图谱与数据库中已有信息进行比对,ATCC15947和BYK00685的比对相似值0.85,分别为0.95及0.90。条形码经软件分析共产生21种核糖体条带,聚类分析分为3个群。条带之间呈现明显的地域性差异和宿主差别。来自北方及南方的菌株除少数几株以外,各自聚集为一个群;所有人源株则分布在第三群。【结论】自动化核糖体分型可以方便快捷地用于不同物种的菌株分型与流行病学追踪溯源。     

致病性迟缓爱德华菌的检测

系统检测了 2 5株迟缓爱德华菌 (Edwardasiellatarda ,Et)的胞外产物 (ECP) ,包括溶血素、胞外蛋白酶 (ECPase) ,并用Et强致病株JEL4的ECP抗血清作Dot ELISA检测各株Et的ECP ,同时对小鼠和剑尾鱼作致病性试验。试验表明 ,具动物致病性的菌株溶血素检测均为阳性 ,ECPase与致病性无关。JEL4ECP的Dot ELISA结果与动物致病性的符合率达 1 0 0 %。在此基础上 ,建立了致病性Et的检测方法 ,该方法只需作简便的平板溶血试验和Dot ELISA ,即可检测Et的ECP ,无须作动物试验 ,从而简化了致病性Et的检测程序 ,为研制检测试剂盒奠定了基础。     

迟缓爱德华氏菌对Hep-2细胞的侵袭特性

用细胞裂解计数法及超薄切片电镜观察法分析了迟缓爱德华氏菌侵袭Hep—2细胞的基本特性。在15株来源各异的迟缓爱德华氏菌中,有6株细菌具有对Hep—2细胞的侵袭能力。细菌侵入细胞后,主要位于空泡内。侵入细胞内的迟缓爱德华氏菌不仅可在细胞内增殖,而且可从细胞内释放出来。用细胞松弛素破坏微丝后可抑制其侵袭作用,而且表现出剂量依赖关系,而用秋水仙素破坏微管后不影响其侵袭力。这表明在迟缓爱德华氏菌对Hep—2细胞的侵袭过程中,细胞骨架中有微丝的参与,未发现微管的参与。     

迟缓爱德华氏菌对Hep-2细胞的侵袭特性

用细胞裂解计数法及超薄切片电镜观察法分析了迟缓爱德华氏菌侵袭ＨＥｐ－２细胞的基本特性。在１５株来源各异的迟缓爱德华氏菌中,有６株细菌具有对ＨＥｐ－２细胞的侵袭能力。细菌侵入细胞后,主要位于空泡内。侵入细胞内的迟缓爱德华氏菌不仅可在细胞内增殖,而且可从细胞内释放出来。用细胞松弛素破坏微丝后可抑制其侵袭作用,而且表现出剂量依赖关系,而在秋水仙素破坏微管后不影响其侵袭力。这表明在迟缓爱德华氏菌对ＨＥｐ－     

爱德华氏菌人工经口感染及病理观察

用从病鱼体内分离到的福建爱德华氏茵（Ｅｄａｗａｒｄｓｉｅｌｌａｆｕｊｉａｍｅｎｓｉｓ）人工经口感染鳗鲡获得成功,证明该菌由消化道传染。人工感染后一系列组织病理观察表明：该菌对肝脏的损害是致肝细胞融解形成灶性坏死,对肾脏引起造血组织增生。当继发感染气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏ－ｎａｓ）后,灶性坏死区形成脓肿。继发感染是爱德华氏病致死的原因,同时也是鳗鲡爱德华氏病症伏表现为肝脏型或肾脏型两种类型的原因。     

迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体的制备及鉴定

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是肠杆菌科爱德华菌属的一种条件致病菌,可引起败血病,危害鲆、鲤等经济养殖鱼类。但是,经过20余年的研究,虽有各种灭活疫苗和组分疫苗的试验,却无针对该菌病的商品化疫苗的使用报道。抗独特型抗体疫苗技术已成功用于肿瘤、细菌、病毒、寄生虫的防治,具有安全、易大规模生产等优点。鉴于药物防治鱼菌病的局限性,作者在制备了抗迟缓爱德华菌单克隆抗体的基础上,制备抗该菌的抗独特型单克隆抗体,用该菌抗独特型抗体免疫牙鲆, 为预防该菌病提供一种安全有效的新方法。       

迟缓爱德华氏菌中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的胞外分泌调控

【目的】迟缓爱德华氏菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中关键酶之一,前期研究证实是一种广谱性抗原,可作为水产养殖细菌病免疫防治中疫苗的开发靶点。本文探究迟缓爱德华氏菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的胞外分泌机制。【方法】通过Western blot和ELISA方法考察迟缓爱德华氏菌经典分泌系统缺失株GAPDH胞外分泌情况;使用ELISA方法对迟缓爱德华氏菌突变体文库的GAPDH胞外分泌进行了大规模筛查,并结合q RT-PCR对筛查得到的插入失活株进行了表达分析。【结果】经典分泌系统与GAPDH的胞外分泌存在一定相关性。突变体文库的大规模筛查得到两株GAPDH分泌量明显增加的插入失活株Δesr A和Δesr C,这两个基因的失活会导致GAPDH的胞外分泌量显著上调。【结论】迟缓爱德华氏菌GAPDH的胞外分泌受Esr A和Esr C负调控。     

鳗鲡爱德华氏菌病的组织病理学研究

鳗鲡爱德华氏菌病病变性质为化脓性炎症。症理分型主要有两种：化脓性肝炎型、混合型。较早发生病变部位主要在肝脏,其化脓性病杜按病程分为初、中、晚期。肾脏、脾脏、胃粘膜、体表出现散在的脓肿、脓性溃疡、炎性血栓及血斑。此外,肝脏、肾脏实质细胞均出现变性和坏列、血管充血、出血等。本文详细报告了肝脏、脾脏、肾脏的超微结构变化并初步讨论了细胞、组织损伤的过程及细胞病理学、超微病理学意义。     

养殖中华鳖蜡样芽孢杆菌的分离、鉴定和致病性研究

2016年夏杭州某中华鳖(Pelodiscus sinensis)养殖场出现大量发病, 病鳖呈厌食、反应迟钝、四肢无力、池边独游、濒死前不停摇头等病症, 死亡率20%以上。用营养琼脂从典型症状濒死中华鳖分离到革兰阳性短杆状, 芽孢近中生或中生的分菌株; API 50 CHB对分离菌株T91-1鉴定结果显示与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)参考菌株ATCC 14579 97.4%相似; T91-116S rDNA和gyrB基因序列与ATCC 14579相似度为99%, 确认T91-1为蜡样芽孢杆菌。T91-1在羊血平板呈典型β溶血, 牛奶平板上出现明显透明圈, 表明存在溶血性和胞外蛋白酶类毒素。用T91-1肌肉注射感染健康中华鳖LD₅₀为4.91×105CFU/ind., 死亡鳖出现与自然发病鳖类似症状; 感染发病中华鳖血和肝印/涂片瑞氏-姬姆萨染色可见组织间隙有大量芽孢杆菌。自然发病鳖肾、肝、肺、心病理切片可见大量芽孢杆菌, 病鳖血管扩张充血, 嗜酸性粒细胞浸润。T91-1灌胃ICR乳鼠3d后可全部死亡, 死亡鼠呈皮下出血等症状; T91-1腹腔注射和灌胃ICR 4周龄小鼠12—24h可出现迟钝、厌食等症状, 1周内未出现死亡。上述结果表明蜡样芽孢杆菌对中华鳖有很强毒力, 对小鼠有较强肠毒性, 是引起本次杭州中华鳖暴发性疾病的病原。     

鳜鱼细菌性病原的分离鉴定及致病性初步研究

对广东省各地区患病的鳜鱼进行病原分离,通过细菌学鉴定和应用VITEK-AMS-60鉴定系统,并以有关的标准菌株为对照,初步鉴定为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、少动假单胞菌（Pseudomonas paucimobilis）、脑膜脓毒性黄杆菌（Flavobacterium meningosepticum）、施氏假单胞菌（Pseudomonas statzeri）、美人鱼弧菌（Vibrio damsela）、鲁氏不动杆菌     

一株产类胡萝卜素细菌的分离与鉴定

从武汉东湖发生水华的水样中分离到一株产橙黄色色素的菌株OB 2 ,经可见光光谱扫描分析 ,证明该菌株所产色素为类胡萝卜素。为了确定OB 2的分类学地位 ,PCR扩增后测定其 16SrRNA基因序列 ,在GenBank中进行同源性比较 ,并与一些相关细菌构建系统发育树。综合分析后将菌株OB 2鉴定为Microbacteriumkitamiense。     

一株高产黑色素细菌的分离及鉴定*

从武汉东湖中分离出一株高产胞外黑色素的细菌(BFHM2002)。BFHM2002具有产黑色素速度快,产量高且不需要酪氨酸诱导等优点;而且经酪氨酸诱导可显提高BF-HM2002胞外黑色素的产量,初步鉴定BFHM2002属坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)。鉴于BFHM2002的产黑色素特性,将成为芽孢杆菌属的一个新的菌种资源。     

红拟石首鱼海豚链球菌分离、鉴定及致病性研究

2001年9月-12月,浙江舟山部分网箱养殖红拟石首鱼发生了陆续死鱼,发病鱼表现为眼球突出、浑浊,失去方向性,皮肤溃疡等症状。从病鱼的肾脏和肝脏中分离到菌株SO-2和SO-3,对两分离株进行了致病性试验,发现两者对红拟石首鱼、罗非鱼及小白鼠均有致病力,SO-2和SO-3对红拟石首鱼、罗非鱼及小白鼠的LD50分别为4.8×108CFU/尾和1.9×107CFU/尾2、.8×108CFU/尾和8.3×107CFU/尾及9.6×106CFU/只和4.2×106CFU/只,试验感染鱼出现眼球突出、浑浊及失去方向性等与自然发病相似症状,确定该两株菌为致病菌。两分离株为革兰氏染色阳性,呈链状球菌,β溶血,10℃生长,45℃不生长;接触酶阴性,水解七叶灵、精氨酸;VP试验、脲酶和马脲酸试验阴性,发酵葡萄糖、水杨苷、蔗糖和淀粉,不发醇阿拉伯糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖和山梨醇。分离株对氨卞青霉素、万古霉素和先锋Ⅴ等高度敏感,对庆大霉素、复方新诺明、林可霉素、氟哌酸等不敏感。应用16SrRNA基因进行的菌株PCR鉴定,确定该两株菌为海豚链球菌。       

中华鳖源致病性产吲哚金黄杆菌分离、鉴定及药敏特性分析

对患病中华鳖(Pelodiscus sinensis)进行病原分离、鉴定及药敏实验, 从患病中华鳖皮肤、肝肾脾重要器官分离纯化病原菌, 经理化特性测定及16S rRNA序列分析对其进行鉴定及人工感染试验, 并利用K-B及二倍稀释法进行药敏特性分析。结果表明分离株J22是为中华鳖腐皮病病原, 其对中华鳖的LD₅₀为3.30×104 CFU/g。J22株理化特性与产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)一致, 16S rRNA序列与产吲哚金黄杆菌同源性为99%, 综合判定J22株是产吲哚金黄杆菌。分离株对新霉素、庆大霉素及阿莫西林等12种抗生素高度敏感, 对氟苯尼考及多西环素等抗生素耐药; 二氧化氯、漂白粉及高铁酸钾对分离株消毒效果较好。分离菌株J22是中华鳖病原菌, 养殖时可选用庆大霉素、新霉素或者阿莫西林内服, 配合使用二氧化氯、漂白粉及高铁酸钾等外用进行防控。     

克氏原螯虾源维氏气单胞菌的分离鉴定及组织病理学观察

为确定克氏原螯虾(Procambarus clarkii)暴发性死亡的病原体, 研究从一例患病克氏原螯虾的肝胰腺分离到了一株优势菌株QD160502, 根据菌株形态、生理生化特性, 16S rDNA及gyrB序列分析, 将其鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。回归感染实验证明, 该分离株可使克氏原螯虾出现与自然发病相同症状。组织病理学观察可见克氏原螯虾肝胰腺、肠道与心脏组织病理损伤, 且随感染持续时间而逐渐加重, 在感染12h后肝小管分泌细胞中出现内含棕色颗粒的转运小泡; 感染24h后肝小管间炎性细胞浸润, 肠道结缔组织萎缩, 心脏组织出现空泡样扩张; 感染48h后肝小管储存细胞与分泌细胞大量解体并空泡化, 肠道上皮皱嵴减少, 心肌空泡样扩张增加; 感染72h后肝小管和肠道上皮细胞坏死, 且在心脏组织中发现透明血细胞聚集。药物敏感性检测发现QD160502菌株对恩诺沙星、诺氟沙星、四环素、强力霉素等敏感, 但对青霉素、链霉素、卡那霉素等抗生素耐药。研究为克氏原螯虾的健康养殖和细菌性疾病的防控提供指导依据。     

罗氏沼虾源维氏气单胞菌的分离鉴定、毒力基因检测及组织病理学观察

为鉴定江苏省高邮市某养殖场罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)发病死亡的病原体,研究从患病濒死的罗氏沼虾肝胰腺中分离出一株优势菌WSQ-1,对其进行纯化培养、革兰氏染色、生理生化特征鉴定、16S rRNA及gyrB基因序列分析,鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。回归感染实验表明,分离株WSQ-1对罗氏沼虾有较强致病性,且出现与自然发病类似的症状:感染虾活力减弱,食欲下降,肌肉发白; 72h半致死浓度(LD50)为2.51×10⁶ CFU/mL。组织病理学观察可见其肝胰腺组织病理损伤,并随感染浓度的增加或感染持续时间的延长而逐渐加重:低浓度或感染前期结缔组织间隙增大并积聚少量炎性细胞;继而肝小管管腔变形,肝细胞空泡化,部分组织坏死;高浓度或感染后期肝小管及结缔组织大面积坏死导致不可逆损伤。毒力基因检测显示该菌携带Acsv、AexT、Act、Aer、GcaT、Acg和OmpAI共7个毒力基因,表明分离菌具有较强致病性。药敏试验显示,该分离菌对头孢哌酮等16种药物敏感,对克拉霉素等10种药物耐药,仅对卡那霉素表现为中度敏...     

棘胸蛙致病性蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及病理组织观察

试验从患烂皮病棘胸蛙(Quasipaa spinosa)中筛选出3种致病性菌株BS₁、BS₂和BS₃, 对其进行革兰氏染色、形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析, 鉴定上述3株菌均为蜡样芽孢杆菌。同时观察人工感染棘胸蛙的组织病理切片, 发现经病原菌感染的棘胸蛙肝、肺、舌和肌肉的损伤较严重, 表现出明显变性、坏死和炎症细胞浸润, 且在肺部组织内发现嗜碱性包涵体。药敏试验表明, 在所试的7种抗生素中, 致病性蜡样芽孢杆菌对庆大霉素和链霉素高度敏感, 对妥布霉素、卡那霉素和四环素中度敏感, 对氨苄西林和头孢他啶产生抗药性。实验初步探究了棘胸蛙烂皮病的发病机理, 为棘胸蛙烂皮病的防治提供理论依据。     

一株氨化细菌的分离、鉴定及氨氮降解能力的初步分析

养殖水体中高浓度的氨态氮及硝态氮是导致鱼虾发病的直接或间接因素1, 特别是近几年来,不断发生养殖生物氨氮中毒的事件, 给水产养殖业带来了严重的经济损失2, 因此对养殖水体中氨氮浓度的控制以及如何解决养殖水体中的氨氮污染问题, 已成为净化养殖水质的研究热点。