人骨形态发生蛋白7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究

目的:构建重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP7)表达质粒,并研究其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达。方法:将hBMP7重组表达质粒电转到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,并用DOT-BLOT和ELISA方法分析检测rhBMP7在重组CHO细胞中的表达。结果:hBMP7 cDNA整合到CHO细胞基因组中并被转录。点杂交和ELISA检测证实rhBMP7在CHO细胞中得到表达。结论:hBMP7成功在CHO表达系统中得到表达。     

重组人骨形态发生蛋白-2生物学活性测定新方法的建立

目的:采用小鼠异位成骨技术及甲基麝香草酚蓝比色法检测重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的生物学活性。方法:将rhBMP-2埋入小鼠肌间隙内,14d后取出新生组织,采用血清钙试剂盒检测其钙含量。结果:随着给药组剂量递增,相应地钙含量也增加,二者具有较强的量效关系。结论:此方法为本实验室独创,较传统的血清碱性磷酸酶方法更为方便、快捷,是一种能够定量检测rhBMP-2活性的新方法。     

重组人骨形态发生蛋白2在CHO细胞中的表达、鉴定及活性分析

构建真核表达载体pCDNA3.1( )-hBMP-2,与质粒pSV2-dhfr共转染CHO-dhfr-细胞,以含有700μg/mLG418的IMDM进行选择性培养,筛选抗性克隆,并用MTX扩增,提高rhBMP-2的表达量。收集的rhBMP-2蛋白进行Westernblot检测,还原蛋白样品电泳产生一条大小约为18kD的特异性条带,非还原蛋白样品电泳产生一条大小约为30kD的特异性条带,提示表达的rhBMP-2是经过糖基化修饰的,且以同源二聚体形式分泌表达。单细胞分离培养得到14株rCHO(hBMP-2)单克隆细胞株,ELISA法检测rhBMP-2表达水平,最高可达7.83μg/24h/106cells。活性分析结果表明,表达的rhBMP-2具有很强的生物学活性。     

重组人骨形态发生蛋白-7与脱钙骨基质复合物双重骨诱导作用的生物学评价

将不同剂量的重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)与脱钙骨基质(DBM)分别复合后,植入小鼠股部内侧肌间隙,三周后取材,通过组织学检查、碱性磷酸酶(ALP)及钙含量的测定比较各组的骨诱导活性。结果显示,三组复合物均有骨组织生成,中、高剂量组可见骨小梁、板层骨和原始骨髓腔,血管和骨髓丰富;低剂量组的成骨量明显少于中、高剂量组,且新骨的成熟度低于其他两组,DBM少部分吸收;单独植入rhBMP-7组有编织骨形成;而DBM组可见成骨细胞的聚集。rhBMP-7/DBM复合组在ALP和Ca含量水平上与同等剂量的两对照组相比均有显著性差异(P<0.01),而rhBMP-7三种剂量之间均有显著性差异(P<0.01)。这充分说明DBM作为rhBMP-7的合适载体,具有缓释作用,且二者复合可起到双重骨诱导活性;而且rhBMP-7的骨诱导活性具有一定的剂量依赖性。     

骨形态发生蛋白家族及其受体在生殖调控中的作用

骨形态发生蛋白 (bonemorphogenelicprotein ,BMP)又称骨形成蛋白 ,属于转化生长因子超家族成员。本文从理化特性、受体种类、信号转导机制 ,以及在动物生殖调控中的作用和受体基因突变所导致的多胎机制等方面 ,详细阐述了有关BMP近年来的研究状况 ,旨在为研究绵羊或其它物种的多胎机制提供参考     

人骨形态发生蛋白—7全长cDNA的克隆及序列测定

从人胎儿肾中提取总ＲＮＡ,反转录得ｃＤＮＡ,ＰＣＲ扩增获得１．３ｋｂ的骨形态发生蛋白－７（ＢＭＰ－７）的全长ｃＤＮＡ。克隆的ＢＭＰ－７基因编码的氨基酸序列与献报道相同。     

骨形态发生蛋白与细胞外基质磷酸化糖蛋白相关性研究进展

骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子β超家族成员,细胞外基质磷酸化糖蛋白(MEPE)是一种细胞外基质的非胶原磷酸化糖蛋白,两者都是成骨信号通路中的重要蛋白。近年来发现MEPE表达水平受BMP的调节,并在磷酸盐代谢调节、成骨细胞增殖分化中发挥重要作用,同时与肿瘤细胞的骨转移有着密切的关联。在此,我们简要综述近年来BMP与MEPE的关系以及它们在肿瘤细胞骨转移方面的作用。     

骨形态发生蛋白6对机体铁代谢调控的机制

骨形态发生蛋白6(BMP6)为TGF-β超家族中的一员,已有的研究表明BMP6具有成骨和成软骨作用,最新的研究发现了它对机体的铁代谢也具有重要的调控作用,通过调节铁调素(hepcidin)的表达,在调节机体铁稳态过程中扮演着重要角色。     

人骨形态发生蛋白-2重组腺病毒的构建与制备

将人BMP-2的编码区cDNA克隆至穿梭载体pShuttle,以PI-SceI和I-CeuI切下含BMP-2编码区cDNA的片断,在体外与PI-SceI/I-CeuI切开的腺病毒DNA连接,构建重组有BMP-2全长编码区基因的腺病毒DNA,PCR鉴定正确后,经PacI酶切线性化,在脂质体介导下转染HEK293细胞,反复冻融制备重组腺病毒,空斑形成试验测定病毒滴度约为7.5×106～1.5×107pfu/ml。以BMP-2重组腺病毒感染体外培养的小鼠成肌细胞C2C12,Westernblot检测证实有BMP-2表达。     

利用慢病毒载体观察microRNA-194 对人骨肉瘤细胞系U2-OS 生物学特性的影响

目的：通过构建携带针对microRNA-194 的shRNA载体及过表达载体,包装慢病毒,感染人骨肉瘤细胞系U2-OS,改变细胞 内microRNA-194 基因的表达水平,研究microRNA-194 对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,为探索microRNA-194作为骨肉瘤 生物治疗的新靶点提供理论和实验依据。方法：PCR扩增pri-miR-194 及miR-194-5 成熟体,克隆于慢病毒载体plent-i GFP 中,转 染大肠杆菌感受态细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,感染人骨肉瘤细胞系U2-OS。进行MTT,流式,平板克隆等试验。结果：1.重组慢 病毒表达质粒构建正确,过表达及抑制过表达重组慢病毒的滴度分别为1.5× 108 TU/ml及4× 108 TU/ml;2. microRNA-194过表 达的人骨肉瘤细胞系U2-OS 细胞增殖速度,凋亡率及细胞周期相较于其它实验组都有明显变化(P<0.01)。结论：成功构建了 microRNA-194 过表达及抑制过表达慢病毒表达载体;miR-194 的表达水平对U2-OS 细胞的增殖和凋亡造成显著影响。 microRNA-194 可能成为骨肉瘤治疗的潜在新靶点,但该基因对骨肉瘤发生发展的作用及其机制尚待进一步研究。     

利用慢病毒载体观察microRNA-194对人骨肉瘤细胞系U2-OS生物学特性的影响

目的：通过构建携带针对microRNA-194的shRNA载体及过表达载体,包装慢病毒,感染人骨肉瘤细胞系U2-OS,改变细胞内microRNA-194基因的表达水平,研究microRNA-194对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,为探索microRNA-194作为骨肉瘤生物治疗的新靶点提供理论和实验依据。方法：PCR扩增pri-miR-194及miR-194-5成熟体,克隆于慢病毒载体plent-i GFP中,转染大肠杆菌感受态细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,感染人骨肉瘤细胞系U2-OS。进行MTT,流式,平板克隆等试验。结果：1.重组慢病毒表达质粒构建正确,过表达及抑制过表达重组慢病毒的滴度分别为1.5×108TU/ml及4×108TU/ml;2.microRNA-194过表达的人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞增殖速度,凋亡率及细胞周期相较于其它实验组都有明显变化（P〈0.01）。结论：成功构建了microRNA-194过表达及抑制过表达慢病毒表达载体;miR-194的表达水平对U2-OS细胞的增殖和凋亡造成显著影响。microRNA-194可能成为骨肉瘤治疗的潜在新靶点,但该基因对骨肉瘤发生发展的作用及其机制尚待进一步研究。     

重组人骨形态发生蛋白-7表达系统研究进展

骨形态发生蛋白-7（BMP-7）在胚胎发育、肾脏保护、骨形成、代谢、再生等各个方面发挥着重要的作用,现已进入了临床应用阶段。我们简要综述了重组人BMP-7（rhBMP-7）的原核表达系统及真核表达系统,并对各表达系统的优缺点进行了分析。     

人骨形成蛋白-2C端102肽的诱骨活性

为分析更短的Hbmp-2C端肽是否具有诱骨活性 ,寻求新型的有诱骨活性的基因工程Hbmp-2产品。利用温度诱导的大肠杆菌表达系统表达肽段长度为102个氨基酸的Hbmp-2C端肽及其Cys的突变体。表达产物经纯化复性后 ,植入小鼠肌袋模型中测试其诱骨活性。获得了能稳定表达Hbmp 2C端肽的工程菌 ,测序结果与预期的序列完全一致。表达产物以包涵体形式存在 ,表达量占细胞总蛋白的 3 0 %。产物经纯化复性后 ,小鼠肌袋模型测试结果表明 :Hbmp 2 10 2肽仍具有诱骨活性 ,而将C端第一位Cys突变的 10 2肽诱骨活性丧失。实验表明 :比Hbmp 2成熟肽 ( 114个氨基酸 )更短的C端 10 2肽仍具有良好诱骨活性 ,这 10 2肽N端第一个Cys对其诱骨活性可能是必需的。     

表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的:研究表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵和表达产物的纯化工艺。方法:利用16L发酵罐发酵培养工程菌,设定了溶氧、搅拌速度、诱导时机、补料和培养基pH值等发酵条件;通过包涵体洗涤、离子交换层析法纯化目的蛋白。结果:工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的30%以上,纯化后目的蛋白的纯度可达98%。结论:建立了大肠杆菌高效表达人骨形态发生蛋白-7的发酵及纯化工艺。     

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游,受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带,分子量约为１２ｋＤ,约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。     

beta-catenin 基因在人骨肉瘤MG63 细胞系的表达变化

目的：观察分析beta-catenin 基因在人骨肉瘤MG63 细胞系的表达变化。方法：培养MG63 细胞株,用不同浓度的Wnt3a 蛋白或 相同浓度、不同时间段的Wnt3a 蛋白刺激液MG63细胞生长,用FQ-PCR在mRNA 水平检测beta-catenin 在MG63 细胞系的表达 变化。培养MG63 细胞株,用相同浓度的Wnt3a 蛋白刺激,比较刺激组与空白对照组的细胞数目的差别。结果：在细胞生长的第 0,1 天两组的MG63 细胞数量对比没有统计学差异（P＞0.05）;而在第2,3,4 天对照组细胞增殖速度较刺激组缓缓,经比较（t=4. 109,3.892,5.215,均P＜0.05）。beta-catenin 基因表达不会因为Wnt3a 的浓度增加而增加。100 ng/mL的Wnt3a 蛋白刺激beta-catenin 基 因表达最高,其他几个浓度的beta-catenin 基因表达对比没有统计学差异（P>0.05）。在100 ng/mL的Wnt3a蛋白刺激下,beta-catenin 基 因表达会随时间延长而增加,6 h时茁-catenin基因表达最高（P<0.05）,随后茁-catenin基因表达则没有统计学差异（P>0.005）。结 论：Wnt蛋白对MG63 细胞有正向增加增殖作用。激活Wnt/beta-catenin 信号通路能促进MG63 的细胞增殖。     

重组人骨形成蛋白-3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％．目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽．表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续洗涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽．经复性处理成可溶性蛋白,植入小鼠肌肉内,第１４ｄ组织切片显示有软骨细胞和软骨基质形成,第２１ｄ可见成骨细胞和骨基质形成．将ｒｈＢＭＰ－３Ｃ与脱矿去免疫原性异种骨粒复合后作小鼠肌肉植入试验,２１ｄ组织切片上可见硬质骨形成．结果表明：大肠杆菌表达的ｈＢＭＰ－３Ｃ经复性后具有诱骨活性,糖基化并非ＢＭＰ－３活性所必需．     

microRNA-194模拟物对成骨肉瘤细胞系SOSP_9607生物学特性的影响

目的：观察miR-194模拟物对于成骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法：四甲基偶氮唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞凋亡和周期。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-194模拟物（hsa-miR-194mimics）转染成骨肉瘤细胞系SOSP_9607,增强SOSP_9607细胞内miR-194的活性。结果：与对照组比较,实验组细胞的增殖能力明显下降。实验组凋亡率（10.1±0.22）%与阴性对照组凋亡率（3.3±0.19）%相比明显增高（P〈0.01）。与对照组比较,实验组细胞周期G0/G1细胞比例显著增加,G2/M期细胞比例显著减少,S期细胞比例显著减少（P〈0.01）。结论：通过转染miR-194模拟物增强SOSP_9607细胞中miR-194的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡造成显著影响。