低氧对rAAV-2介导的 hVEGF165基因在大鼠心肌细胞中表达的影响

目的探讨低氧对人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因在心肌细胞中表达的影响。方法以重组2型腺相关病毒(rAAV-2)为载体,构建rAAV2/hVEGF165,转染大鼠原代心肌细胞。对心肌细胞进行低氧培养,并于培养的0、24、48、72h,分别应用RT-PCR技术检测VEGF165 mRNA表达、ELISA法检测hVEGF165蛋白的水平,并与对照组(予以常氧培养)进行比较。结果rAAV2/hVEGF165体外转染后,低氧培养的心肌细胞在24、48、72hhVEGF165 mRNA转录水平均明显高于对照组,有显著性差异(P<0.05);在低氧培养的24、48、72h其培养上清中hVEGF165蛋白含量亦明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.05)。结论低氧可促进重组2型腺相关病毒介导的人血管内皮生长因子(hVEGF165)基因在心肌细胞中表达。     

AAV介导NGF过表达载体转染BMSCs对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型保护作用

目的干细胞是当前研究的热门领域,利用干细胞定向分化作用可以促进神经损伤修复,但是干细胞具有分化方向不定和易老化的特点。本研究探究腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)过表达载体转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型的保护作用。方法分离和培养人源BMSCs,采用流式细胞仪检测BMSCs的CD29,CD45和CD90等表面蛋白表达。采用免疫组织化学染色鉴定BMSCs表面CD34和CD44表达。AAV腺病毒构建NGF过表达质粒,通过高强度聚焦超声制备SD大鼠坐骨神经损伤模型,根据处理方式不同,将SD大鼠分成空白对照组,模型组,BMSCs组和NGF过表达组。利用HE染色,电镜方法观察坐骨神经形态,示踪金染色观察神经接头的聚集,TUNEL染色检测细胞凋亡,RT-qPCR检测NGF和caspase-3mRNA表达。结果流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白,CD29阳性率为98.03%,CD90阳性率为96.92%,CD45阴性率为77.2%,共表达CD29、CD90且CD45表达阴性的细胞数占总细胞数的96.89%。BMSCs细胞表面CD34和CD44免疫组织化学染色呈阳性。慢病毒转染效率>90%,转染效率较高。HE染色结果中模型组大鼠坐骨神经有明显断裂,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组裂痕缩小,而NGF过表达组断裂处几乎不可见。电镜结果显示,模型组大鼠坐骨神经密度少,且形态不规则,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组密度大,且周边为纤维组织填充,NGF过表达组大鼠坐骨神经密度大,排列较为规则。示踪金染色显示NGF过表达组神经接头处可见神经聚集。RT-qPCR结果显示空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组NGF mRNA相对表达量分别为1.18±0.05、0.77±0.06、1.75±0.07和3.09±0.08,F=9.082,P=0.019;空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组caspase-3mRNA表达量分别为2.03±0.09、5.05±0.23、3.12±0.09和1.23±0.22,F=9.177,P=0.011。空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组细胞凋亡率分别为(9.34±0.32)%、(31.24±3.43)%、(22.09±2.66)%和(4.97±1.05)%,F=9.664,P=0.014。结论腺病毒介导NGF过表达质粒转染BMSCs可以促进坐骨神经损伤大鼠坐骨神经修复,其机制可能是通过升高NGF mRNA,降低caspase-3mRNA水平实现。     

Galectin-9基因转染诱导大鼠肾移植免疫耐受的实验研究

[目的]探讨半乳凝素-9(Galectin-9)在大鼠肾移植免疫耐受中的作用及意义。[方法]建立大鼠同种肾移植模型,分为Lentiviral-Galectin-9组、雷帕霉素组、对照组和Lentiviral组。lentiviral-Galectin-9组供肾移植前用含慢病毒lentiviral-Galectin-9的肾脏冷保存液经肾动脉灌注。分别观察肾功能测定、生存期,检测尿蛋白和血肌酐含量,移植肾病理检查并半定量评分,比较各组间的不同。[结果]Lentiviral-Galectin-9治疗组肾移植受体大鼠平均存活天数为30.2d,与对照组的存活时间比较差异显著。Lentiviral-Galectin-9治疗组的移植肾功能基本保持稳定。脾细胞增殖反应显示:Lentiviral-Galectin-9组和雷帕霉素组对供体脾细胞的刺激增殖反应显著低于对照组和Lentiviral组,Lentivi-ral-Galectin-9组对供体脾细胞的刺激增殖反应显著低于和雷帕霉素组,差异均有统计学意义。Lentiviral-Galectin-9组和雷帕霉素组的尿蛋白水平明显低于对照组和Lentiviral组,差异均有统计学意义(P﹤0.05);Lentiviral-Galectin-9组与雷帕霉素组差异有统计学意义(P﹤0.05),对照组和Lentiviral组差异无统计学意义(P﹥0.05)。第6周和第12周时,Lentiviral-Galectin-9组和雷帕霉素组的血肌酐浓度明显低于对照组和Lentiviral组,差异均有统计学意义(P﹤0.05);Lentiviral-Galectin-9组与雷帕霉素组差异有统计学意义(P﹤0.05),对照组和Lentiviral组差异无统计学意义(P﹥0.05)。移植术后12周时,Lentiviral-Galectin-9组和雷帕霉素组大鼠移植肾组织的间质炎症和纤维化、血管内膜增厚、肾小球硬化和小管萎缩等慢性损害明显轻于对照组和Lentiviral组,Lentiviral-Galectin-9组损害轻于雷帕霉素组,差异均有统计学意义(P﹤0.05);对照组和Lentiviral组差异无统计学意义(P﹥0.05)。[结论]慢病毒lentiviral载体可成功介导Galectin-9基因对大鼠肾脏的转染,并对移植肾起免疫保护作用、延长移植肾的存活时间。     

携带人肿瘤抑素Tumstatin基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达研究

目的构建携带人肿瘤抑素Tumstatin基因的重组腺相关病毒载体,研究其在乳腺癌细胞MCF-7中的表达。方法以人胚肾293细胞为材料,用RT-PCR方法获取人肿瘤抑素Tumstatin基因,将其克隆入pAAV-MCS载体中形成重组载体pAAV-Tum质粒。用脂质体介导法将重组载体导入乳腺癌细胞株(MCF-7)建立一株稳定的表达Tumstatin基因的乳腺癌细胞株MCF/AAV-Tum,并用RT-PCR检测该细胞系中Tumstatin基因的表达。结果成功构建了pAAV-Tum重组腺相关病毒载体,筛选出乳腺癌细胞株MCF/AAV-Tum,该细胞能表达Tumstatin基因。结论构建的pAAV-Tum重组载体能在MCF-7细胞中表达,为其后的肿瘤抗血管生成治疗研究奠定了基础。     

携带有Foxp3基因慢病毒载体的构建及其转染大鼠T细胞的实验研究

[目的]构建携带有Foxp3基因的慢病毒载体,使之能高效地转染原代大鼠T细胞。[方法]采用PCR技术从携带有Foxp3基因的FL24796质粒扩增出Foxp3基因序列,并将其接入慢病毒载体pRRLSIN-LacZα中,经PCR、酶切和测序鉴定后,转染人293细胞和大鼠T细胞,并通过流式细胞技术观察病毒转染效果。[结果]经过PCR、酶切和测序鉴定,pLenti-Foxp3-EGFP慢病毒载体被成功构建,其转染T细胞的最佳感染复数为50︰1,所包装的病毒对大鼠T细胞的感染效率可达28.5%左右。[结论]成功地构建出携带有Foxp3基因的慢病毒载体,并能高效地转染进入原代大鼠T细胞。     

重组腺病毒介导人野生型p53基因转染神经母细胞瘤细胞系的实验研究

目的 观察人野生型p53基因(wt-p53)转染对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.结果 以携带绿色荧光蛋白的腺病毒质粒(Ad-GFP)转染SH-SY5Y细胞,通过流式细胞仪(FCM)判断转染效率.确定合适的感染倍数(MOI).分别以空病毒质粒(Ad)及携带wt-p53的腺病毒质粒(Ad-p53)转染SH-SY5Y细胞,即对照组和p53组;并以未转染的肿瘤细胞为空白对照(空白组).采用Western blot免疫印迹法检测p53蛋白的表达.观察转染前后细胞生长情况,绘制生长曲线,通过FCM分析细胞周期分布及细胞凋亡情况.结果 检测结果 表明腺病毒对SH-SY5Y细胞有较高的转染率,100MOI为合适的转染倍数.Ad-p53转染SH-SY5Y细胞后,wt-p53基因得到了高效表达.与空白组和对照组相比,p53组细胞生长曲线上升减缓,生长速度减慢,细胞凋亡增加,G1期细胞比例增加(P<0.01).结论 wt-p53基因转染可以有效抑制SH-SY5Y细胞的生长,这为p53基因修饰的肿瘤疫苗用于神经母细胞瘤的临床治疗提供了体外实验依据.     

hPARP-1高表达HaCaT细胞株的建立

目的建立hPARP-1过表达的HaCaT细胞株,观察过表达该基因后所引起的生物学效应。方法常规提取人皮肤角质细胞HaCaT的总RNA,RT-PCR扩增PARP-1全长cDNA基因片段,构建含PARP-1全长cDNA基因片段的真核表达载体pEGFP-PARP-1,通过BglⅡ、xhoⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pEGFP-N2和pEGFP-PARP-1分别转染人皮肤角质细胞HaCaT,通过G418加压筛选,建立稳定高表达hPARP-1的HaCaT-PARP-1细胞株,并采用Realtime Q-PCR和Western blotting检测其mRNA和蛋白的表达水平。结果 RT-PCR扩增产物经BglⅡ、xhoⅠ双酶切后,与pEGFP-N2连接构建的重组体经酶切和测序,结果与GeneBank报道序列一致。Realtime Q-PCR及Western blotting结果显示,转染pEGFP-PARP-1质粒的细胞其PARP-1在mRNA及蛋白的表达水平均显著高于对照组。结论 PARP-1高表达细胞株成功建立。     

序贯联合应用HIV-1 gp160腺病毒载体疫苗的体液免疫效果研究

目的探讨序贯联合应用Ad5-HIVgp160疫苗与其他艾滋病疫苗所诱导的特异性体液免疫反应效果。方法用Ad5-HIVgp160疫苗、其他腺病毒载体和腺病毒相关载体疫苗以不同免疫程序分别免疫豚鼠,通过ELISA和中和实验方法检测其诱导的免疫反应,比较疫苗联合免疫组豚鼠与疫苗单独免疫组豚鼠诱导的体液免疫反应的强度。结果不同免疫程序的豚鼠均能检测到针对HIV gp120的HIV结合抗体和针对HIV敏感株sf162的中和活性;联合疫苗组诱导的gp120特异性抗体滴度和病毒中和活性高于单独免疫组,但无显著性差异。结论 Ad5-HIVgp160疫苗单独或与其他疫苗联合使用均能诱导高水平的体液免疫反应,能激发针对HIV敏感株产生中和活性的抗体。     

THY1基因影响上皮性卵巢癌SKOV3细胞株生长的体内和体外实验研究

目的构建THY1基因真核表达载体，并转染卵巢癌细胞株SKOV3，观察重组载体在体内和体外对SKOV3生长的影响。方法本研究于2005年3月至2007年3月通过目的基因克隆、载体构建技术构建重组载体pcDNA3．1（＋）-THY1，转染SKOV3（SKOV3-THY1组），同时设空载体转染组（SKOV3-Null组）和空白对照组（SKOV3组），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）测定法及流式细胞术检测细胞生长及细胞周期变化；并建立雌性裸鼠异体移植卵巢癌模型，观察瘤体生长速率。结果PCR、酶切及DNA测序证实，THY1基因正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），RT—PCR和蛋白质斑迹法（Westernblot）证实重组载体已整合于SKOV3；SKOV3-THY1组细胞抑制率明显高于SKOV3-Null组（P〈0．05）；建立裸鼠致瘤模型4周后，SKOV3-THY1组瘤体体积较SKOV3-Null组和SKOV3组显著降低（P〈0．05）。结论THY1真核表达载体能抑制SKOV3的恶性增殖，THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生发展中起重要作用。     

肾综合征出血热病毒气溶胶动物实验感染研究

为了研究HFRSV的吸入感染性和动物与动物间空气传播感染,用TK_2型气溶胶发生器发生H8205株病毒气溶胶,引入动态气溶胶暴露装置并对实验动物进行暴露.以AGI微生物气溶胶采样器进行采样,以Vero-E_6细胞空斑法分析病毒含量,对病毒耐气溶胶化和吸入病毒剂量进行了测定.对染毒动物产生气溶胶引起交叉感染能力进行了观察.结果表明:HFRS病毒雾化30min回流液病毒存活50%,AGI冲击5分钟其效价下降不明显.数种动物对该病毒气溶胶比较敏感.在本实验装备和条件下其气溶胶乳小鼠吸入0.065pfu全部感染;离乳小鼠吸入0.72pfu几乎全部感染;乳小鼠半数吸入致死量(ILD50)为0.57pfu.从乳小鼠脏器组织分离出了HFRS病毒.结果认为,气溶胶传播是HFRS流行的重要危险因素.     

地塞米松对Wistar大鼠涎腺基因表达的影响

目的：观察腺病毒介导荧光素酶基因转导至大鼠颌下腺后地塞米松对基因表达的影响及IgG的变化.方法：将40只Wistar大鼠随机分为5组,经颌下腺导管转导腺病毒荧光素酶基因重组体即AdCMVLuc,3 d、1周、2周、4周、8周后观察肌注地塞米松对基因表达的影响.结果颌下腺转基因表达3 d最高,在注射地塞米松组明显大于未注射地塞米松组;以后逐渐下降,至4周、8周时仍可测到基因表达,但两组无明显差异.结论：肌注地塞米松能有效地减轻腺体的急性炎症反应,增加腺病毒介导涎腺短期基因表达,说明免疫及炎症反应直接影响转导基因的表达.     

河北省2005～2006年H1N1亚型流感病毒血凝素HA1基因特征研究

[目的]研究2005～2006年河北省分离的H1N1型流感病毒毒株HA1基因特性。阐明HA1基因的变异与流感流行的关系。[方法]用MDCK分离培养流感病毒,提取病毒核糖核酸（RNA）,采用RT-PCR扩增病毒HA1基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件作分析处理。[结果]2005～2006年在河北省流行的H1N1型流感病毒HA1基因核苷酸和氨基酸序列与同时期的H1N1亚型疫苗株A/NewCaledonia/20/1999相比已发生较大变异,核苷酸同源性为97.0%～98.1%,氨基酸同源性为97.9%～98.7%,有5～7个氨基酸发生了替换,但均不在抗原表位。种系进化结果显示A/河北南市/37/2005与A/河北新市/56/2005和A/河北新市/129/2006位于2个小分支,均距A/NewCaledonia/20/1999较远,A/河北南市/37/2005与A/NewYork/221/2003有较近的亲缘关系。[结论]H1N1型流感病毒HA1基因已发生明显变异,但对抗原性改变意义不大;近几年H1N1持续低流行使人群易感性得以积累是今年H1N1型流感流行的主要原因;2005～2006年河北省同时流行着至少2支种系发生距离较远的H1N1型流感病毒。     

过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子-1多态性与2型糖尿病相关性研究

[目的]探讨廷边地区朝鲜族、汉族人群中过氧化物酶体增殖受体γ辅激活园子-1(PGC-1)多态性与2型糖尿病的相关性.[方法]采用聚合酶链反应一单链构泉多态性(PCR-SSCP),对104例正常人群和113例2型糖尿病患者的PGC-1基因Thr394Thr、Leu410Iso和Leu438Ser多态性基因型进行对照分析.[结果]朝鲜族和汉族正常人群pGC-1基因Thr394多态性的A等位基因频率分别为23.3%和20.7%,两民族间无统计学差异;糖耐量正常组的PGC-1基因Thr394Thr多态性的A等位基因频率为22.1%,2型耱尿病组的A等位基因频率为22.1%,两组间无差异;未检测出Leu410Iso和Leu438Ser多态性.[结论]PGC-1基因Thr39Thr多态性在延边朝鲜族和汉族人群之间无差异;PGC-1基因Thr394Thr与2型糖屎病无相关性.     

麻疹减毒活疫苗病毒续发传染免疫的实验研究

以１７对孪生婴儿作配对研究对象，３５名幼儿园半寄宿生为分组研究对象。两者均采取一组接种麻疹疫苗（ＭＶ），另一组不予接种的方式，通过血清学检测，观察ＭＶ病毒能否引起“续发传染免疫”。结果在接种ＭＶ组免疫成功的情况下，另一组未能相应获得免疫。说明ＭＶ病毒难以通过空气传播途径在人间互传，提示了在ＭＶ接种覆盖面不完全的情况下，无法由ＭＶ病毒的续发传染免疫来增强人群免疫屏障。     

p27kip1基因转移抑制大鼠胶质瘤生长的实验研究

[目的]探讨重组腺病毒介导的人突变型p27kip1基因（Ad-p27kip1）表达对大鼠神经胶质瘤移植瘤生长的抑制作用。[方法]建立大鼠胶质瘤移植瘤模型,随机分成3组：Ad-p27组、Ad-LacZ组、PBS组。Ad-p27组给予腺病毒介导的人p27 kip1基因（Ad-p27kip1）瘤内注射,另2组分别给予Ad-LacZ和PBS瘤内注射,观察对肿瘤生长的抑制情况,并用免疫荧光法检测P27和CyclinD1的表达;原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡情况。[结果]给予Ad-p27kip1基因治疗的实验组大鼠肿瘤生长受到明显抑制;在颅内肿瘤模型组给予Ad-p27治疗的大鼠生存时间明显延长;免疫荧光染色显示移植瘤P27表达明显增强,CyclinD1的表达受到抑制。Ad-p27组细胞凋亡显著多于Ad-LacZ组和PBS组。[结论]腺病毒介导的人p27基因（Ad-p27kip1）对大鼠胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,其机制是增强p27表达、抑制CyclinD1的表达、诱导胶质瘤细胞凋亡。     

聚合酶链反应检测门诊STD患者泌尿生殖道EB病毒感染的实验研究

[目的]了解四川泸州地区门诊STD患者泌尿生殖道感染EB病毒情况。[方法]采用聚合酶链反应（PCR）方法检测868例门诊STD患者泌尿生殖道EB病毒。[结果]在868例患者中,有192例被检出感染了EB病毒,阳性率为22.12%（192/868）;其中单纯感染EB病毒者34例,占17.71%（34/192）;混合感染者158例,占82.29%（158/192）。[结论]PCR检测技术具有简便、快捷、准确、特异性强的特点,其检测的结果可以作为临床诊断泌尿生殖道感染EB病毒的可靠依据,有较高的临床实用价值。     

一对父亲与胎儿所携乙型肝炎病毒前S基因的序列分析

目的：筛选一位父亲HBsAg,HBeAg,抗HBc均阳性的慢性携带者和母亲无任何乙型肝炎病毒（HBV）标志的子宫内受染胎儿为研究对象,分析父、儿所携带HBV前S基因的基因序列,探讨HBV男性垂直传播的存在。方法：应用半套式PCR检测父亲、胎儿的PreS1/S2基因,将扩增的片段克隆到PGEM－T载体进行克隆测序,并与文献中的中国人参照株序列相比较,结果：父、儿血清中均扩增出前S基因,测序结果表明二者的基因同源性达99％以上,且均有183bp的PreS1基因缺失,而与中国人参照株序列的同源性为89％,结论：父、儿前S序列的高度一致性表明HBV极可能存在男性垂直传播。     

密切关注新禽流感A(H7N9)的科研进展

目的及时了解国内外对新禽流感A(H7N9)的科研进展,把握防治禽流感A(H7N9)的主动权。方法及时收集国内外新发表的论文及报道,进行分析综合。结果初步证明了新禽流感A(H7N9)病毒的性质,基因特点,致病性,传播性,及其对药物的敏感性和防控要点。结论禽流感A(H7N9)病毒是一种三原重组的新病毒,对禽类及哺乳动物(包括人)都有致病性,且对人的毒性较强;但可防,可控,可治。目前对其认识还在随科研深入而发展,仍有不少不定因素,必须保持高度警惕,继续密切关注。