高梁肉桂酸羟化酶基因SbC4H1降低拟南芥的木质素合成

肉桂酸羟化酶（C4H）是苯丙烷代谢通路的关键酶,其活性和含量直接影响木质素合成的效率。本文研究通过高粱bmr突变体的抑制差减杂交筛选、克隆到了一个C4H基因sbC4H。半定量RT-PCR发现,SbC4H1在多个bmr突变体中上调表达。将SbC4H1-GFP融合基因转化拟南芥原生质体进行瞬时表达,发现SbC4H1表达产物蛋白定位于细胞质。SbC4H1在拟南芥中的异源表达明显降低其茎的木质素含量,并且下调了拟南芥4CL1、FSH和HCT质素合成基因的表达。这些结果表明,高粱SbC4H1抑制了拟南芥木质素的合成。     

人凋亡相关基因TFAR19缺失突变体的原核表达、产物纯化及鉴定

构建TF 1细胞凋亡相关基因 19(TF 1cellapoptosisrelatedgene 19,TFAR19)缺失突变体的原核表达载体 ,获取缺失突变体蛋白 ,用于TFAR19促凋亡分子机理的研究 .从真核表达载体pcDI TFAR19扩增出野生型TFAR19和 4个缺失突变体 ,重组到原核表达载体pGEX 4T 2 .经亲和层析方法对缺失体蛋白进行纯化后 ,再利用凝胶过滤的方法进一步纯化 .利用抗GST和抗TFAR19的单克隆抗体对蛋白进行免疫学鉴定 .用白血病细胞株HL 6 0检测蛋白活性 .成功地克隆并重组了野生型TFAR19及缺失突变体 pGEX 4T 2表达载体 ,对融合蛋白的表达条件进行了优化 .SDS PAGE结果显示 ,各个缺失突变体融合蛋白均有较高水平的表达 .免疫学检测证实获得了正确的表达产物 .活性检测证实 ,野生型TFAR19和缺失突变体 4可以明显促进去血清诱导的HL 6 0细胞凋亡 ,第 6外显子可能是一个与TFAR19促凋亡活性密切相关的功能结构域     

IQM1基因过量表达对拟南芥气孔运动及根系生长的影响

拟南芥钙调素结合蛋白IQM家族共有6个成员,已证实IQM1是一个不依赖Ca2+的钙调素结合蛋白,其功能缺失突变体iqm1表现气孔开度小和根短的表型,而且突变体气孔开度并不因光、暗、脱落酸等诱导而变大或变小。该实验构建了IQM1基因双元表达载体并转化拟南芥,通过分子筛选及IQM1表达量分析,获得了IQM1基因过量表达植株。表型分析发现,IQM1过量表达植株在光诱导气孔开放处理后气孔开放度明显比野生型和iqm1-1增大,在暗诱导气孔关闭处理后气孔开度则显著变小;IQM1过量表达植株的主根比野生型和iqm1-1长,侧根数量比野生型和iqm1-1多,但IQM1过量表达对植株的生长形态、抽薹期、开花期及座果等方面却没有明显影响。研究表明,IQM1基因在植物气孔运动及根系生长中起着重要作用。     

拟南芥非生物胁迫应答基因表达的调节子研究概况

分子生物学研究表明,植物中由诸如干旱、高盐和低温等环境胁迫因子诱导的几个基因具有多种功能。大多数干旱应答基因是由植物激素脱落酸（ABA）诱导的,但也有少数基因例外。对模式植物拟南芥基因表达中的干旱应答基因的分析表明,至少存在4个独立调节系统（调节子）。对典型胁迫诱导表达的一些基因中启动子的顺势作用元件和影响这些基因表达的转录子也已进行了分析。已经分离出与脱水效应元件/C重复序列（DRE/CRT）顺势作用元件结合的转录因子,并命名为DRE结合蛋白1/C重复序列结合因子（DREB1/CBF）和DRE结合蛋白2（DREB2）。在转基因拟南芥植株中,DREB1/CBF过量表达可增加其抗寒、抗旱和抗盐碱的能力。DREB1/CBF基因已成功地在许多不同作物中得到应用,从而提高作物对非生物胁迫的耐受性。与胁迫反应相关的其他转录因子的研究也正在取得进展。     

盐芥热激同源蛋白70基因(Thhsc70)的分子克隆及鉴定(英文)

热激蛋白70(hsp70s)具有分子伴侣的功能,其中在非胁迫条件下表达的hsp70s称为热激同源蛋白70(hsc70)。为更好地了解hsc70基因的特性,鉴定了盐芥(Thellungiella halophila(C. A. Mey. )O. E. Schulz)中编码胞质hsc70蛋白的基因Thhsc70。实验结果表明:在非胁迫条件下,Thhsc70基因具有组织特异性表达;Thhsc70基因受热胁迫和冷胁迫的诱导表达,但几乎不受盐诱导和干旱诱导。Thhsc70基因在拟南芥中过量表达后提高了转基因拟南芥的热耐受性和冷耐受性。     

盐芥热激同源蛋白70基因(Thhsc70)的分子克隆及鉴定

热激蛋白70(hsp70s)具有分子伴侣的功能,其中在非胁迫条件下表达的hsp70s称为热激同源蛋白70(hsc70).为更好地了解hsc70基因的特性,鉴定了盐芥(Thellungiella halophila(C.A.Mey.)O.E. Schulz)中编码胞质hsc70蛋白的基因Thhsc70.实验结果表明:在非胁迫条件下,Thhsc70基因具有组织特异性表达;Thhsc70基因受热胁迫和冷胁迫的诱导表达,但几乎不受盐诱导和干旱诱导.Thhsc70基因在拟南芥中过量表达后提高了转基因拟南芥的热耐受性和冷耐受性.     

低温胁迫下拟南芥CBF1超表达突变体胞质中Ca^2＋浓度的变化

低温严重影响植物的生长,低温刺激可引起植物细胞中Ca^2＋浓度迅速升高。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1超表达突变体为材料,研究了低温处理时CBF1基因的表达情况及胞质Ca^2＋的浓度变化。结果表明,CBF1本身可受低温诱导。同时将水母发光蛋白基因转入该拟南芥突变体中并检测Ca^2＋的浓度变化,发现低温刺激时突变体细胞质中Ca^2＋的浓度变化幅度明显高于野生型,但液泡的胞质而两侧Ca^2＋的浓度变化相似。用EGTA和LaCl3处理拟南芥后,胞质Ca^2＋的浓度升高被抑制,并且CBF1突变体及对照胞质中的Ca^2＋浓度下降到同一水平。上述结果表明,Ca^2＋参与了CBF1应答低温信号的转导过程,并且CBF1超表达突变体可能是通过提高胞质Ca^2＋浓度来提高植物的抗低温胁迫能力。     

凋亡抑制因子Survivin在大肠杆菌TB1中的表达纯化及鉴定

 本文旨在克隆凋亡抑制因子Survivin基因,并在大肠杆菌中进行可溶性表达与初步纯化. 采用RT-PCR法,扩增人凋亡抑制因子survivin cDNA,并克隆入原核表达载体pMAL p2X中,转化TB1大肠杆菌感受态细胞.经0.3 mmol/L IPTG诱导2 h后,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE、ELISA及Western 印迹鉴定. 实验获得凋亡抑制因子survivin编码区cDNA,以构建的原核表达载体pMAL-p2X survivin转化菌株后,可表达凋亡抑制因子survivin和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,相对分子质量(Mr) 为58 000.并成功利用Factor Xa将融合蛋白裂解开.ELISA和Western 印迹表明,融合蛋白能与抗凋亡抑制因子survivin单克隆抗体特异性结合.获得的凋亡抑制因子survivin全长cDNA可在大肠杆菌TB1中以MBP survivin融合蛋白的形式表达,成功地将survivin目的蛋白和MBP蛋白分离,为深入研究survivin的结构和功能奠定了基础.     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控。构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)植物和水稻(OryzasativaL.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因。转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高。这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达。在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节。     

过量表达星星革PtSOS1提高拟南芥的耐盐性

将星星草中分离的质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因PtSOSJ（GenBank登录号EF440291）构建到pGWB2植物表达载体上,转化拟南芥,获得抗卡那霉素的抗性植株。PCR和Northem检测表明,PtSOS1已整合到拟南芥基因组中并过量表达。耐盐性实验表明,PtSOS1过量表达提高了拟南芥植株的耐盐性。盐分测定表明,盐胁迫下PtSOS1转基因植株中Na^＋积累低于野生型的,K^＋含量则高于野生型的,转基因植株中K^＋／Na^＋比值高于野生型。     

拟南芥AtPUB18的亚细胞定位和酶活性及AtPUB18的表达

通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆到AtPUB18全长ORF。利用VectorNTI和MEGA 5.0对蛋白序列进行生物信息学分析结果显示,AtPUB18和AtPUB19蛋白序列相似性为74.9%,一致性为63.5%;构建AtPUB18启动子(1 974bp)融合GUS报告基因载体并转化拟南芥,组织化学染色分析显示,低温和干旱诱导后转基因植株中AtPUB18表达水平显著提高;构建AtPUB18与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的瞬时表达载体并转化原生质体,激光共聚焦显微镜观察发现,AtPUB18-GFP融合蛋白分布在细胞核和细胞质中;构建AtPUB18与麦芽糖结合蛋白基因(MBP)融合表达载体并转化大肠杆菌表达融合蛋白,纯化后的蛋白进行泛素连接酶活性检测结果显示,在小麦泛素激活酶E1和人泛素结合酶E2存在时,AtPUB18具有泛素连接酶活性。研究表明,AtPUB18是一个有功能的泛素连接酶,定位在细胞膜和细胞质中,可能参与拟南芥对非生物胁迫的响应。     

过量表达星星草PtSOS_1提高拟南芥的耐盐性

将星星草中分离的质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因PtSOS1(GenBank登录号EF440291)构建到pGWB2植物表达载体上,转化拟南芥,获得抗卡那霉素的抗性植株.PCR和Northern检测表明,PtSOS1已整合到拟南芥基因组中并过量表达.耐盐性实验表明,PtSOS1过量表达提高了拟南芥植株的耐盐性.盐分测定表明,盐胁迫下PtSOS1转基因植株中Na+积累低于野生型的,K+含量则高于野生型的,转基因植株中K+/Na+比值高于野生型.     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.     

DELLA蛋白缺失对拟南芥干旱胁迫耐受性的影响

为探索DELLA蛋白缺失对拟南芥耐旱能力的影响,对拟南芥野生型Ler和DELLA蛋白缺失突变体della进行干旱处理,测定存活率、萌发率、离体叶片的失水率、脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量,并对发挥植物细胞脱水保护功能的胚胎晚期丰富蛋白编码基因LEA和ABA应答基因LOX3、COR15b、COR413的表达量进行了检测。结果表明:(1)干旱21d后复水,della突变体的存活率明显高于野生型Ler;(2)della突变体在含甘露醇的固体培养基上的萌发率显著高于Ler;(3)della突变体离体叶片的失水速率明显低于Ler;(4)干旱胁迫后,della突变体脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量的积累低于Ler;(5)干旱胁迫后,della突变体的LEA基因上调表达程度高于Ler,而ABA应答基因上调表达程度低于Ler。研究表明,DELLA蛋白的缺失有助于提高植物抗旱能力。     

拟南芥SPL1基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应

根际酸化是植物适应低磷胁迫的重要策略, 但植物是如何感知和转导低磷信号, 进而促进根际酸化的分子机制至今还不十分清楚。利用pH指示剂(溴甲酚紫)显色法从拟南芥(Arabidopsis thaliana) T-DNA插入突变体库中分离得到了1株低磷诱导根际酸化缺失突变体spl1。在含溴甲酚紫的低磷培养基上培养8小时, 野生型拟南芥根际培养基的颜色变为黄色, 而突变体spl1根际培养基的颜色没有明显变化, 表明spl1的低磷根际酸化反应能力降低。当低磷胁迫处理延长20天, spl1叶片的花青素积累明显高于野生型。同时也出现, 即使在磷营养正常条件下, spl1突变体也表现出根毛数量与长度增加的特征。进一步的研究表明, 在低磷条件下, spl1突变体根部的磷含量略高于野生型, 与磷转运相关基因的表达量明显高于野生型。分子遗传学分析结果表明, SPL1基因受低磷胁迫诱导, 主要在拟南芥的叶片和花等组织中表达, 其编码的蛋白广泛分布在细胞的各个部位。以上结果表明, SPL1参与介导低磷诱导的拟南芥根际酸化反应, 调节多种低磷胁迫反应及低磷条件下磷饥饿诱导基因的表达。     

GRAS转录因子AtSCL4负调控拟南芥应答渗透胁迫

探讨拟南芥GRAS转录因子AtSCL4(Arabidopsis thaliana SCL4)在渗透胁迫中发挥的生物学功能,为GRAS蛋白在非生物胁迫中的功能研究奠定基础。以野生型和AtSCL4突变体拟南芥为试验材料,通过生理指标测定和qRT-PCR方法研究渗透胁迫下AtSCL4调控植物抗逆的生物学机制。研究发现AtSCL4受渗透胁迫诱导后显著上调表达,且AtSCL4突变体的抗渗能力强于野生型。在渗透胁迫下,AtSCL4可以负调节ATMYB6的表达,减小气孔开放度,降低叶片水分流失;AtSCL4通过负调控P5SC1和BADH的转录来提高植物体内脯氨酸和甜菜碱的含量;AtSCL4通过负调节AtSOD1和PER4的表达来增加抗氧化酶活性而降低活性氧含量。AtSCL4可负向调控抗逆基因表达和生理变化应答渗透胁迫。     

拟南芥AMP1负调控植物对高盐胁迫的反应

高盐胁迫严重影响植物的生长发育及农作物产量,因此鉴定盐胁迫响应相关基因至关重要。拟南芥的AMP1编码一个推测的谷氨酸羧肽酶,参与植物的生长发育、光形态建成与种子休眠。研究证明了AMP1的一个新功能,它的缺失提高了缺失突变体amp1的抗高盐胁迫的能力,研究证明amp1突变体的强抗高盐胁迫表型一方面是由于在高盐胁迫下amp1突变体比野生型中积累了更多的甜菜碱和脯氨酸降低了突变体细胞的水势,另一方面高盐胁迫条件下amp1突变体中高盐胁迫响应的下游基因RD29A,以及AHA3的表达量也高于野生型,后者可促进Na+的外排;高盐条件能够对植物造成氧化胁迫,研究发现AMP1的缺失还上调了抗氧化相关基因ZAT10/12的表达量,进而降低了在高盐胁迫条件下amp1突变体内过氧化物的积累水平,减轻对细胞的损伤和生长的抑制,这些都提高了amp1突变体的抗高盐胁迫的能力。以上结果证明在拟南芥中AMP1负调控植物对高盐胁迫的反应过程。     

拟南芥漆酶基因AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应

植物漆酶基因家族在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中共有17个成员,目前各基因的具体功能尚不十分清楚.该研究利用过量表达的方法初步分析了拟南芥AtLAC4的功能.GUS染色显示AtLAC4在拟南芥的维管组织中有较强的表达,并在叶片排水器中特异表达.AtLAC4过量表达导致植株木质素含量增多、次生壁加厚、植株变小和莲座叶叶柄变短.ABA对AtLAC4的表达具有明显的诱导作用,AtLAC4过量表达植株对外源ABA敏感;干旱处理后,AtLAC4过量表达植株的耐旱能力比野生型明显增强.以上结果表明,AtLAC4基因在调控植物生长发育及非生物胁迫响应中具有重要作用.     

低温胁迫下拟南芥CBF1 超表达突变体胞质中Ca2+ 浓度的变化

低温严重影响植物的生长, 低温刺激可引起植物细胞中Ca²⁺浓度迅速升高。以拟南芥(Arabidopsis thaliana) CBF1 超表达突变体为材料, 研究了低温处理时CBF1基因的表达情况及胞质Ca²⁺的浓度变化。结果表明, CBF1本身可受低温诱导。同时将水母发光蛋白基因转入该拟南芥突变体中并检测Ca²⁺的浓度变化, 发现低温刺激时突变体细胞质中Ca²⁺的浓度变化幅度明显高于野生型, 但液泡的胞质面两侧Ca²⁺的浓度变化相似。用EGTA和LaCl₃处理拟南芥后, 胞质Ca²⁺的浓度升高被抑制, 并且CBF1突变体及对照胞质中的Ca²⁺浓度下降到同一水平。上述结果表明, Ca²⁺参与了CBF1应答低温信号的转导过程, 并且CBF1超表达突变体可能是通过提高胞质Ca²⁺浓度来提高植物的抗低温胁迫能力。     

海岛棉GbHyPRP1克隆及其转基因拟南芥抗黄萎病验证

在对黄萎病菌胁迫处理的海岛棉Pima 90-53根组织全长c DNA文库分析中,筛选到一个与黄萎病胁迫相关的杂合富含脯氨酸蛋白(hybrid proline-rich protein)基因,将其命名为Gb Hy PRP1。该基因c DNA序列全长1747 bp,开放阅读框945 bp,编码一个由314个氨基酸残基组成的蛋白,包含信号肽、N端富含脯氨酸域及C端Pollen Ole e I域。同源序列分析显示,Gb Hy PRP1与来自雷蒙德氏棉、陆地棉和亚洲棉的Hy PRP1蛋白序列相似性最高,分别为95.95%、93.87%和91.34%。q RT-PCR分析结果显示,受黄萎病菌胁迫后海岛棉根部Gb Hy PRP1表达显著下调。将Gb Hy PRP1基因克隆至植物超表达载体,农杆菌介导转化拟南芥获得转基因植株。病指统计分析表明Gb Hy PRP1过量表达显著降低了拟南芥对黄萎病的抗性。据此推测Gb Hy PRP1参与棉花抗黄萎病,可能是一个重要的负调控因子。