缺氧条件下RhoA/Rho激酶及eNOS在血管内皮细胞表达的研究

目的：建立稳定的体外细胞缺氧模型,探讨人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）在缺氧条件下RhoA蛋白和Rho激酶对其内皮细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达的影响。方法：利用jetPEI-HUVEC、siRNA分别转染SH-SY5Y细胞、HEK293细胞和HUVEC后制备体外细胞缺氧模型,通过细胞裂解对相关蛋白进行免疫印迹分析。结果：常氧条件下RhoA蛋白在HUVEC中表达水平较低,但在缺氧条件下培育5 h后表达增加,同时缺氧3 h后Rho激酶表达增加,5 h后达高峰,而eNOS的表达恰恰相反。缺氧条件下,活化型RhoA蛋白下调eNOS的表达,而siRNA使RhoA蛋白表达减少从而上调eNOS的表达;Rho结合域抑制Rho激酶活性而上调eNOS的表达。结论：RhoA蛋白和Rho激酶的表达及活化抑制内皮细胞中eNOS的表达,因此可以通过某些药物如他汀类或Rho激酶抑制剂,抑制RhoA蛋白和Rho激酶的活性,从而增加eNOS的表达水平,对心脑血管疾病产生保护作用。     

糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞eNOS活性和表达的影响

目的　研究糖基化终产物 (AGEs)对内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)的活性及蛋白表达的影响。方法　用糖孵育法制备糖基化修饰的牛血清白蛋白 (AGE BSA) ,用胶原酶法分离培养人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)。将内皮细胞与不同浓度的AGE BSA在体外分别培养 3 ,6,12 ,2 4,48h ,用同位素二步色谱法检测基础状态下与组胺刺激后的eNOS活性 ,用蛋白免疫印迹法 (Western blotting)检测eNOS蛋白表达水平。结果　基础状态下 ,HUVECs的eNOS有部分激活 ,组胺刺激后eNOS活性明显增加 (P <0 .0 0 1)。AGE BSA明显抑制基础状态下的eNOS活性和组胺刺激后的eNOS活性增高(P <0 .0 0 1) ,这种抑制作用呈时间、浓度依赖性。AGE BSA与HUVECs共同孵育 2 4h后的eNOS表达水平明显降低 (P <0 .0 0 1) ,且随着孵育时间的延长 ,eNOS表达水平进一步降低 (P <0 .0 5 ,48hvs 2 4h) ,这种抑制作用与AGE BSA的浓度有关。结论　AGE BSA明显抑制eNOS基础状态和组胺刺激后的活性增高 ,AGE BSA明显抑制HUVECs的eNOS表达 ,AGE BSA对eNOS活性的抑制作用可能与降低eNOS表达有关。     

猪后肢动脉生成过程中血管内皮细胞eNOS的表达

目的:研究猪后肢动脉生成过程中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达及其活性.方法:猪股动脉行单侧结扎术,另一侧行假手术,两周后处死动物.应用免疫荧光组织化学技术检测侧支血管中eNOS表达,用抗磷酸化的eNOS抗体(P-eNOS)检测eNOS的活性.用Leica激光共聚焦显微镜观察并拍照,图片用Silicon Graphics Octane进行处理.结果:在正常小动脉血管中eNOS的表达非常低,呈弱阳性;在生长的侧支血管中eNOS的表达显著上调,呈强阳性.在正常血管和生长的侧支血管中eNOS的表达都定位于内皮细胞.在生长的侧支血管中,P-eNOS表达水平非常高,免疫双重染色证实eNOS和P-eNOS的表达共同定位于内皮细胞.结论:侧支血管发育过程中,eNOS的表达被上调,并具有生物活性,高水平和具有活性的eNOS可能通过调节内皮细胞的增殖、移动及对炎症的控制,从而对侧支血管的生长发挥重要作用.     

静脉曲张过程中血管内皮细胞NO合成酶表达变化

目的 探讨下肢静脉曲张过程中管壁血管内皮的变化及一氧化氮（NO）合成酶的改变与静脉曲张发生的关系。方法 选用17例曲张大隐静脉的内皮细胞作为观察组,选择3例正常静脉的内皮细胞作为对照组,应用苏木精-伊红染色观察内皮的一般形态学变化,采用免疫组织化学染色观察内皮细胞NO合成酶的表达情况。结果 正常静脉管壁厚度均匀一致,内弹力膜完整紧密,无断裂,内皮细胞分布均匀;而曲张静脉的管壁厚度不一,内膜不完整,内皮细胞大部分脱落。与正常静脉相比,代偿期曲张静脉内皮细胞NO合成酶表达增高（F=260.83,q=4.96,P〈0.05）,而失代偿期曲张静脉内皮细胞NO合成酶的表达则明显降低（q=11.83,P〈0.05）。结论 曲张静脉内皮组织损伤随病变进程逐渐加剧;曲张静脉内皮细胞NO合成酶的表达从最初的增高到逐渐减低,可作为曲张静脉由代偿到失代偿的标志。     

高游离脂肪酸致内皮细胞eNOS活性降低与PKC通路的关系

目的 研究游离脂肪酸(FFA)水平升高导致的内皮一氧化氮合酶(eNOS)活性降低是否与蛋白激酶C(PKC)通路激活有关.方法 传代培养的人脐静脉内皮细胞分为4组:对照组,油酸组(10、50、100、150、200 μmol/L),PKC抑制剂(GFX)组,油酸+GFX组.分别检测各组eNOS活性,检测对照组和油酸组PKC的表达和活性,以及各组eNOS磷酸化(p-eNOS)的表达.结果 与对照组相比,油酸组eNOS活性呈剂量依赖性降低,p-eNOS(1177)的表达降低(0.0854±0.017 vs. 0.0134±0.023, P<0.05);PKC的表达出现转位,由胞浆转向胞膜,胞浆表达活性降低,胞膜表达活性增高,总活性增加.加入GFX后对正常内皮细胞eNOS活性无明显影响,但能部分改善油酸所致的内皮细胞eNOS活性的降低.结论 油酸可损害内皮细胞eNOS的表达及磷酸化,其机理与PKC通路的激活有关.     

卡托普利对SHR大鼠eNOS、iNOS表达的影响

目的 探讨自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)在高血压发展进程中,卡托普利对SHR内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表达的改善作用。方法 以WKY(Wistar-Kyoto)大鼠为空白对照,SHR为模型进行分组实验,7～24周龄SHR灌服卡托普利(3.375 g/(kg·d)),后停药观察至32周龄。测量血压、左室质量指数(left ventricular mass index, LVMI)、主动脉舒张功能、血清亚硝酸根离子(NO₂^-)含量、iNOS、eNOS mRNA以及蛋白含量变化。结果 (1)不同周龄的SHR左室质量指数、血清NO₂^-浓度均高于WKY,主动脉的舒张度均显著低于WKY。(2)mRNA表达含量变化：与WKY相比,不同周龄的SHR的心肌和动脉eNOS和iNOS mRN...     

丙泊酚诱导血管内皮细胞中eNOS激活机制的最新研究进展

丙泊酚是目前临床上用于麻醉诱导和维持最常用的药物之一,但是常伴血压降低,这对心脏储备低下的患者极为有害。丙泊酚的血管效应复杂,在体实验显示,丙泊酚对动静脉循环都有影响。丙泊酚似乎影响血管系统的许多细胞分子过程,如钙信号、内皮功能和交感神经传递等。现探讨丙泊酚诱导血管内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶激活的机制,以期为实验研究提供参考。     

代谢综合征患者循环内皮细胞和血浆NOS/NO系统及内皮素改变

目的 对代谢综合征(membolic syndrome,MS)患者循环内皮细胞(circulation endothelial cells,CECs)、血浆一氧化氮合酶和一氧化氮(nitric oxide synthase/nitric oxide,NOS/NO)系统及血浆内皮素(en-dothelin,ET)进行测定,探讨MS对此三方面的影响.方法 根据MS诊断标准选取34例患者作为MS患者组和47例正常人群作为健康对照组,分别计数CECs、测定血浆NOS和NO水平及ET水平.结果 ①与对照组相比较,MS患者组CECs](3.11±0.69)vs(9.47±1.15),P=0.0011显著升高.②与对照组相比较,MS患者组NOS[(28.17±3.11)μmol/L vs(34.28±1.97)μmol/L,P=0.0361和No [(58.33±2.49)μmol/L vs(70.03±1.09)¨mol/L.P=0.0141均显著降低.③与对照组相比较,MS患者组ET[(56.35±10.15)vs(126.58±12.37),P=0.001]显著升高.④MS与CECs(P=0.001)和ET(P=0.001)呈正相关,而与NOS(P=0.011)和NO(P=0.006)呈负相关;CECs和ET(P=0.001)呈正相关而与NOS(P=0.035)和No(P=0.024)呈负相关.结论 MS患者血浆NOS和NO水平显著降低,同时致CECs增多和血浆ET水平升高.     

TNF-α对人脐静脉内皮细胞中NO和eNOS的影响

目的 讨论肿瘤坏死因子-α（TNF—α）对内皮细胞一氧化氮（NO）产生及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性的影响。方法 以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为实验材料，检测与不同浓度TNF—α作用不同时间后．细胞培养上清液和细胞中NO水平的变化，以及细胞eNOS活性的改变。结果 （1）随着TNF—α浓度的升高，eNOS的活性减弱，而细胞和上清液中NO的含量增加；（2）随着干预时间的延长，eNOS的活性减弱；而细胞和上清液中NO的含量在作用24h后升高，且明显高于对照组；（3）L一单甲基精氨酸（L—NMMA）和地塞米松（DXM）均能阻断TNF-α引起的细胞和细胞上清中NO的表达增加。结论 TNF-α降低eNOS活性，却在高浓度和长时间作用后增加NO的合成，可能与激活诱导型一氧化氮合酶有关，因为NO的变化可以被L—NMMA和DXM阻断。     

AMPK在内皮细胞中对血管形成的影响

在真核细胞中,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是细胞及全身能量稳态的一个重要调节器,受体内AMP/ATP比率调节,通常被称为代谢敏感性激酶。新近的研究发现,AMPK的激活参与了许多细胞(如骨骼肌细胞、内皮细胞)的分化、迁移和管腔形成。该文就AMPK在血管生成这一生物效应中的显像和作用机制予以综述。     

长链非编码RNA Beta2.7通过上调eNOS/NO通路影响内皮细胞功能

 目的 探索在内皮细胞中调控内皮型-氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表达及其磷酸化的长链非编码RNA （long non-coding RNA，LncRNA）分子及其对内皮细胞功能的影响。方法 培养原代小鼠主动脉内皮细胞，构建LncRNA-Beta2.7过表达质粒、LincRNA-p21干扰质粒、LncRNA-ANRIL干扰质粒、LncRNA-H19过表达质粒，通过慢病毒载体实现稳定转染。稳定转染后，收集内皮细胞及其培养基上清，PCR检测eNOS mRNA表达水平，Western blot检测eNOS、p-eNOS表达水平，还原比色法检测细胞内及培养基上清的NO含量；稳定转染的内皮细胞通过划痕实验和小管形成实验验证LncRNA对内皮细胞功能的影响。结果 过表达LncRNA-Beta2.7上调内皮细胞eNOS mRNA与蛋白的表达水平，且p-eNOS/eNOS比值保持不变；过表达LncRNA-Beta2.7后，内皮细胞NO分泌增多，其划痕愈合速率以及在形成血管过程中的分支数和小管总长度均显著升高。而其余3种LncRNA的作用并不显著。结论 LncRNA-Beta2.7在内皮细胞中通过上调eNOS的表达激活eNOS/NO信号通路，增强血管内皮功能。     

线粒体定位eNOS对肺动脉内皮细胞ROS和NO的调控研究

目的探讨肺动脉内皮细胞线粒体定位的eNOS减少与新生儿持续性肺动脉高压(persistent pulmonaryhypertension of the new born,PPHN)的相关性。方法 PPHN的胎羊模型并分离肺动脉内皮细胞,运用免疫荧光、Western Blot和特异性靶向eNOS(endothelial nitric oxide synthase)等方法,比较正常胎羊和持续性肺动脉高压的胎羊来源肺动脉内皮细胞的eNOS线粒体定位与胞内活性氧ROS(reactive oxygen species)和一氧化氮NO(nitric oxide)的关系。结果在持续性肺动脉高压来源的肺动脉内皮细胞中,Western Blot结果显示线粒体定位的eNOS减少;用Mito-HE荧光探针标记肺动脉内皮细胞中ROS,显示在PPHN的肺动脉内皮细胞中ROS增加;在293HEK细胞过表达不同靶向的eNOS,在线粒体过表达eNOS可减少胞内ROS含量。结论线粒体定位的eNOS可能通过ROS调控胞内NO的量,从而影响血管的舒张。我们的研究揭示了PPHN发病新的机制并为PPHN治疗提供了潜在的靶向位点。     

糖尿病周围血管病患者内皮祖细胞一氧化氮、内皮型一氧化氮合酶含量的变化

目的 观察糖尿病周围血管病患者内皮祖细胞(endothelial progentior cells,EPC)一氧化氮(NO)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的变化.方法 采用硝酸还原酶法测定NO的浓度,免疫印迹杂交法(Western blot)半定量测定eNOS的含量.结果 糖尿病合并周围血管病组EPCs数量最少,增殖、迁移和黏附能力降低,No和eNOS表达最弱,糖尿病无血管痛组表达增强,对照组表达最多,差异具有统计学意义(P＜0.05).No和eNOS的表达与EPC的数量呈正相关(r=0.651,P＜0.05).结论 糖尿病合并周围血管病患者EPC数量减少,功能降低,可能与eNOS、NO表达减弱有关.     

不同浓度Hcy对培养的人脐静脉内皮细胞NO及eNOS转录水平的影响

目的 :通过培养的人脐静脉内皮细胞 (humanum blilicalveinendothelialcell,HUVEC) ,研究不同浓度的同型半胱氨酸 (homocysteine ,Hcy)对内皮细胞分泌一氧化氮 (NO)以及对内皮源性一氧化氮合酶 (eNOS)转录水平的影响 .方法 :收集HUVEC ,然后进行细胞培养 ,传至第 3代后 ,将其与不同浓度的Hcy(生理浓度 0 .0 1mmol·L -1、病理生理浓度 0 .5mmol·L -1、非毒性药理浓度 2 .0mmol·L -1、毒性药理浓度5 .0mmol·L-1)共同培养 2 4h ,分别在 4 ,6 ,8和 2 4h检测培养液中NO的含量 .2 4h后 ,收集HUVEC ,提取总的RNA ,利用eNOS特异性引物进行逆转录 ,从而探讨Hcy对eNOSmR NA水平的影响 .结果 :HUVEC与不同浓度的Hcy培养 2 4h后 ,其NO呈现剂量依赖性的下降 (2 4h时 ,各浓度Hcy的培养液中的NO的含量分别为 19.71± 3.88μmmol·L -1,14 .0 8± 4 .4 6 μmmol·L -1,8.71± 6 .6 3μmmol·L -1,7.0 1±3.6 3μmmol·L -1,2 .37± 0 .77μmmol·L -1,P <0 .0 1) ,但2 4h后 ,eNOS的RT PCR结果显示各组间的产物电泳带无明显的差异 .结论 :Hcy可以导致内皮细胞释放NO减少 ,但对eNOS的转录却没有明显的影响     

猪松弛素对人肺微血管内皮细胞产生一氧化氮的影响

目的 观察猪松弛素(pRLX)对人肺微血管内皮细胞(HMVECs)产生一氧化氮(NO)的影响,探讨这种效应的可能.机制.方法 Westemb lotting检测不同浓度pRLX作用下HMVEC s诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)和原生型一氧化氮合成酶(cNOS)蛋白表达;Griess法检测不同浓度pRLX分别在不同的作用时间下对HMVECsNO产量的影响;Griess法检测选择性iNOS抑制剂氨基胍、非选择性NOS抑制剂L-单甲基精氨酸和NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸对pRLX刺激HMVECs产生NO效应的影响.结果 pRLX促进HMVECs iNOS蛋白表达,但对cNOS表达影响不显著;DRLX呈浓度依赖性促进HMVECs NO产量,但24 h至96 h范围内各pRLX作用时间组之间NO产量无显著差异;氨基胍、L-单甲基精氨酸和吡咯烷二硫氨基甲酸均能阻断pRLX促进HMVECs产生NO的效应.结论 pRLX促进HMVECs iNOS表达和NO生成.