HSPs/肽复合物疫苗免疫治疗小鼠肉瘤的初步实验观察

目的:观察热休克蛋白(heat shock pro-teins HSPs)/肽复合物对Balb/C小鼠S180移植性肉瘤模型免疫治疗的不同效果。方法:两种不同剂量的HSPs/肽复合物疫苗分别对Balb/C小鼠S180肉瘤模型进行预防性的免疫治疗实验观察。结果:混合HSPs/肽复合物蛋白组(含有HSP60、70和GP94)和纯化HSP70/肽蛋白组均可以明显降低成瘤率及抑制肿瘤生长速度、延长小鼠生存时间;部分小鼠甚至可以观察到对生长瘤体的免疫排斥过程,达到完全无瘤健康长期生存。结论:1)HSP70/肽、混合HSPs/肽在小鼠移植性S180肉瘤模型中有良好的免疫预防效果,以混合HSPs/肽效果最好。2)只经过简单纯化后的混合HSPs/肽复合物蛋白具有能提高蛋白产量、缩短纯化时间、减少对蛋白以及携带抗原多肽的破坏等优点,而且其免疫治疗效果优于纯化的HSP70/肽疫苗,可望在临床有广泛的应用前景。     

基础理论

人乳头状瘤病毒18型阳性肿瘤疫苗的构建及体外活性鉴定,淫羊霍苷体内抑瘤作用及其机制,基因佐剂的肿瘤疫苗对肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞功能的影响,三联菌苗对小鼠肉瘤180的抑制作用,IL-12基因重组腺病毒对不同肿瘤抗瘤作用的研究,冻融人树突状细胞基因疫苗体外抗肿瘤免疫效应,     

注射用核糖核酸Ⅱ联合环磷酰胺对肉瘤细胞S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用及对生存影响的研究

目的:探讨注射用核糖核酸Ⅱ（简称：核糖核酸Ⅱ）与化疗药物环磷酰胺（CTX）联合对肉瘤细胞S180荷瘤小鼠肿瘤抑制作用及对小鼠生存的影响。方法:分别建立肉瘤细胞S180实体移植瘤小鼠模型和腹腔积液瘤小鼠模型。将CTX（25 mg/kg,1次/2 d）单独或联合低剂量（25 mg/kg,1次/d）、中剂量（50 mg/kg...     

NH小鼠S180肉瘤热休克蛋白70的纯化

目的建立热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)/肽复合物分离、纯化和鉴定的技术平台.方法NH小鼠接种S180肉瘤细胞,将肉瘤组织热休克处理后经Sephacryl S-200HR分子筛、ConA和ADP柱序列层析进行分离,所得蛋白经电泳及Western blot进行相对分子质量及性质鉴定,用Lowry标准曲线法对各阶段洗脱液进行蛋白定量分析,并计算蛋白得率.结果纯化蛋白经鉴定确系相对分子质量为70×103的HSP70蛋白;每克湿重瘤组织可纯化约50 mg HSP70.结论用上述蛋白层析法可分离获得较纯的HSP70蛋白,为临床实际应用提供基础.     

"乳癌术后方"抗高转移小鼠乳腺癌作用机制的研究

目的:初步探讨治疗乳腺癌的作用机制是否与调节机体免疫功能有关。方法:采用4T1乳腺癌小鼠为实验模型,口服中药"乳癌术后方",观察其抑瘤及抗肺转移作用,并对荷瘤小鼠T细胞增殖功能、T细胞表型及细胞因子IL-10、IL-12、IFNγ-等免疫指标进行检测。结果:实验显示"乳癌术后方"对荷瘤小鼠瘤体积抑制率及肺转移抑制率分别为42.70%、13.14%,与模型组相比能显著抑制肿瘤生长(P<0.01);中药与CTX同时使用还能将CTX的抑瘤率再提高13%(P<0.01),肺转移抑制率再提高近10%。与模型组相比,"乳腺癌术后方"能明显上调荷瘤小鼠T细胞和B细胞活性,下调巨噬细胞百分比,明显增强T淋巴细胞增殖能力(P<0.01),并能抑制荷瘤小鼠淋巴细胞IL-10的生成,增强IFNγ-及IL-12的产生,使之更接近正常小鼠水平。结论:"乳癌术后方"的抗肿瘤作用可能是通过减轻荷瘤宿主的免疫抑制、增强机体抗肿瘤免疫反应来实现的。     

环磷酰胺联合照射后半相合淋巴细胞对小鼠肝癌移植瘤的抑制作用

目的:观察不同剂量环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)预处理联合5 Gy60Co照射的半相合淋巴细胞输注(hap-loidentical lymphocyte infusion,HLI)对小鼠肝癌移植瘤的抑制作用。方法:以皮下接种Hepa1-6肝癌细胞的BABL/c×C57BL杂交F1代雌性小鼠(表型为H-2b/d)为受鼠,以BALB/c×C3H杂交F1代雌性小鼠(表型为H-2d/k)为MHC半相合的供者,分PBS组、CTX 80 mg/kg+5 Gy照射HLI组、CTX 200 mg/kg+5 Gy照射HLI组、CTX 300 mg/kg+5 Gy照射HLI组、5 Gy照射HLI组,每组5只小鼠;观察各组小鼠瘤块生长和大小,检测受鼠体内的嵌合状态及移植物抗宿主病(graft-versus host disease,GVHD)的发病情况。结果:80、200 mg CTX联合HLI组小鼠瘤体积小于PBS组[(1.25±0.24)、(1.38±0.31)vs(2.03±0.24)cm3,P<0.01],小鼠生存时间显著长于PBS组[48 d(39 d,55 d)、40 d(35 d,48 d)vs 35 d(18 d,39 d),P<0.05];80mg CTX联合HLI组的抑瘤作用强于单纯HLI组[(1.25±0.24)vs(1.76±0.40)cm3,P<0.05];300 mg CTX联合HLI组和单纯HLI组无明显抑瘤作用。各治疗组小鼠均未出现GVHD。80、200 mg CTX联合HLI组小鼠嵌合度低于300 mg CTX联合HLI组,且消失时间明显早于后者。结论:低剂量CTX联合输注经照射的半相合供者淋巴细胞可获得较好的抗小鼠肝癌移植瘤的作用,CTX剂量增加后抗肿瘤作用并未增强。     

热休克蛋白72-甲胎蛋白抗原表位肽复合物抗小鼠肝癌Hepal-6细胞免疫的实验研究

目的:以热休克蛋白72(HSP72)-甲胎蛋白(AFP)抗原表位肽复合物免疫小鼠,研究该复合物针对AFP肿瘤是否具有特异性抗肿瘤免疫.方法:以HSP72-AFP多肽复合物皮下注射免疫昆明小鼠,并分别以AFP多肽和HSP72单独免疫小鼠为对照组.ELISA法检测免疫后小鼠血清IFN-γ水平、MTT法检测各免疫组小鼠淋巴细胞对肝癌Hepal-6细胞的杀伤作用、以小鼠体内瘤负荷实验评价蛋白复合物的免疫效应.结果:HSP72-AFP多肽复合物组小鼠血清IFN-γ水平、淋巴细胞对Hepal-6细胞的杀伤作用均显著高于AFP多肽和HSP72组(P＜0.01).HSP72-AFP多肽复合物组瘤体积也明显小于AFP多肽和HSP72免疫组(P＜0.01).结论:HSP72-AFP多肽复合物疫苗可诱导荷瘤小鼠产生针对AFP肿瘤的特异性细胞免疫,其对瘤细胞的杀伤效应明显优于两者单一的多肽纯化疫苗.表明HSP72-AFP多肽复合物可诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫.     

低剂量紫杉醇联合沙利度胺抑制小鼠S-180肉瘤血管生成的研究

目的:探讨低剂量紫杉醇联合沙利度胺对小鼠S-180肉瘤血管生成的作用。方法:建立S-180移植瘤小鼠模型,将40只荷瘤小鼠随机分为4组。A组:生理盐水组(对照组);B组:紫杉醇组,腹腔内注射20 mg/kg,每周3次,连续2周;C组:沙利度胺组,200 mg/kg灌胃,每周3次,连续2周;D组:紫杉醇+沙利度胺组,腹腔内注射紫杉醇(20 mg/kg)和沙利度胺(200 mg/kg)灌胃,每周3次,连续2周。观察瘤重、抑瘤率、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达和微血管密度(microvessel density,MVD)计数。结果:与对照组比较,B、C、D组均能降低瘤重、减少VEGF的表达、降低MVD计数(P<0.05);D组分别与B、C组比较,VEGF的表达及MVD计数均低于B、C组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:小剂量紫杉醇联合沙利度胺能一定程度上抑制S180肉瘤血管的生长,两者具有协同作用。     

热休克预处理对瘤苗免疫效果的影响

热休克蛋白(HPS)广泛存在于正常细胞和肿瘤细胞中参与多种细胞内蛋白质的折叠、装配及转运,近年来发现HSP与肿瘤免疫有关,肿瘤组织中HSP肽复合物具有肿瘤疫苗的作用,体外培养条件下热休克处理可诱导H22肝癌细胞表面HSP70的表达,本文探索在H22肝癌疫苗制备过程中热休克预处理是否能增强小鼠H22肝癌细胞瘤苗的免疫效果.实验分组:按瘤菌性质不同实验分为7组,每组小鼠10只,(1)对照组:用生理盐水代替瘤苗免疫小鼠.(2)单纯佐剂组:用脂质体包裹的rIL-2代替瘤苗.(3)无佐剂瘤苗组:用     

小鼠多亚型热休克蛋白/肽疫苗联合PD-L1免疫检查点抑制剂的抗肿瘤实验研究

  目的  应用小鼠肉瘤组织制备混合多亚型热休克蛋白/肽疫苗（mHSP/P），联合程序性死亡配体（PD-L1）抑制剂治疗小鼠肉瘤。  方法  免疫组织化学染色和Elisa蛋白定量鉴定肉瘤细胞MCA207中的热休克蛋白（HSP70、HSP90、Grp94）的表达。制备蛋白悬液，通过蛋白层析技术获取mHSP/P和Grp94/肽肉瘤疫苗（Grp94/P），以Western blot（WB）鉴定。流式细胞术测定细胞毒性作用。Elisa实验测定mHSP/P和Grp94/P刺激产生的干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）。小鼠实验探究肉瘤疫苗对肉瘤生长以及小鼠生存状况的影响。免疫荧光染色MCA207肉瘤细胞表面PD-L1的表达，WB测定IFN-γ对PD-L1表达的影响。动物实验探究PD-L1抑制剂联合mHSP/P对肿瘤的影响。  结果  肿瘤组织携带多种亚型的HSP（HSP70、HSP90、Grp94）；成功制备肉瘤组织来源的mHSP/P和Grp94/P，Western blot对肿瘤疫苗鉴定并且流式细胞学测定未发现细胞毒性；制备的mHSP/P较Grp94/P刺激产生更多的IFN-γ和TNF-α细胞因子（P < 0.05）。肉瘤细胞表面PD-L1的表达随着IFN-γ的介入而增高；动物实验显示PD-L1抑制剂联合mHSP/P提高了免疫反应的抗肿瘤作用（P < 0.05）。  结论  肿瘤来源的mHSP/P和Grp94/P可以作为肿瘤疫苗在动物实验中使用。mHSP/P比Grp94/P能诱发更强的抗肿瘤免疫反应。IFN-γ刺激肉瘤细胞PD-L1的表达而导致免疫逃逸。PD-L1抑制剂联合mHSP/P提高了抗肿瘤作用。      

不同微生物佐剂S-180瘤苗的免疫效应和抑瘤作用

 目的　比较肿瘤主动特异性免疫治疗中具有佐剂作用的白色念珠菌、李斯特菌及卡介苗的免疫调节效应和抑瘤作用。方法　选择白色念珠菌、李斯特菌、卡介苗各自联合小鼠S-180肿瘤疫苗,皮下免疫接种荷瘤小鼠,检测小鼠脾细胞IL-2、IFN-产生水平,腹腔MTNF-α产生水平,观察荷瘤小鼠瘤体重量和存活期。结果　三种微生物佐剂均能协同瘤苗增强免疫小鼠IL-2、IFN-和TNF-α的产生能力(P<0.01,0.05),有效抑制足垫部移植瘤的生长,抑制率在62.8%～75.8%之间,显著高于单独注射瘤苗组(P<0.01),延长腹腔植瘤小鼠平均存活期7～14天,白色念珠菌、李斯特菌协同提高腹腔植瘤小鼠存活率20%。结论　白色念珠菌和李斯特菌与卡介苗具有同样的佐剂效应,能够协同瘤苗有效抑制肿瘤生长。     

Antitumor activity of mixed heat shock protein/peptide vaccine and cyclophosphamide plus interleukin-12 in mice sarcoma

Background

The immune factors heat shock protein (HSP)/peptides (HSP/Ps) can induce both adaptive and innate immune responses. Treatment with HSP/Ps in cancer cell-bearing mice and cancer patients revealed antitumor immune activity. We aimed to develop immunotherapy strategies by vaccination with a mixture of HSP/Ps (mHSP/Ps, HSP60, HSP70, Gp96 and HSP110) enhanced with cyclophosphamide (CY) and interleukin-12 (IL-12).

Methods

We extracted mHSP/Ps from the mouse sarcoma cell line S180 using chromatography. The identity of proteins in this mHSP/Ps was assayed using SDS-PAGE and Western blot analysis with antibodies specific to various HSPs. BALB/C mice bearing S180 cells were vaccinated with mHSP/Ps ×3, then were injected intraperitoneally with low-dose CY and subcutaneously with IL-12, 100 μg/day, ×5. After vaccination, T lymphocytes in the peripheral blood were analyzed using FACScan and Cytotoxicity (CTL) was analyzed using lactate dehydrogenase assay. ELISPOT assay was used to evaluate interferon γ (IFN-γ), and immune cell infiltration in tumors was examined in the sections of tumor specimen.

Results

In mice vaccinated with enhanced vaccine (mHSP/Ps and CY plus IL-12), 80% showed tumor regression and long-term survival, and tumor growth inhibition rate was 82.3% (30 days), all controls died within 40 days. After vaccination, lymphocytes and polymorphonuclear leukocytes infiltrated into the tumors of treated animals, but no leukocytes infiltrated into the tumors of control mice. The proportions of natural killer cells, CD8+, and interferon-γ-secreting cells were all increased in the immune group, and tumor-specific cytotoxic T lymphocyte activity was increased.

Conclusions

In this mice tumor model, vaccination with mHSP/Ps combined with low-dose CY plus IL-12 induced an immunologic response and a marked antitumor response to autologous tumors. The regimen may be a promising therapeutic agent against tumors.     

中肺合剂对S180肉瘤、Lewis肺癌荷瘤小鼠抑瘤作用实验研究

[目的]探讨中肺合剂对S180肉瘤、Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用,并初步探索其机制.[方法]采用S180肉瘤、Lewis肺癌移植瘤小鼠模型,分荷瘤阴性对照组、低、中、高剂量中肺合剂组和CTX阳性对照组,观察中肺合剂对两种荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用;运用EnVision免疫组化染色法观察中肺合剂对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织cvclinD1周期蛋白表达的影响。[结果]中肺合剂低、中、高剂量组和CTX组对移植性荷S180小鼠的抑瘤率分别为16．48％、29．73％、23．51％、41．87％;与阴性对照组相比,中肺合剂低、中、高剂量组和CTX组瘤重均有显著性差异（P〈0．05）。中肺合剂低、中、高剂量组和CTX组对移植性荷Lewis肺癌小鼠的抑制率分别为22．33％、39．02％、25．48％、64．16％;与阴性对照组相比,低剂量组和高剂量组瘤重均有显著性差异（P〈0．05）,中剂量组和CTX化疗组瘤重均有非常显著性差异（P〈0．01）。中肺合剂能下调Lewis肺癌小鼠肿瘤组织cyclinD1蛋白的表达水平,中、高剂量组阳性表达率与阴性对照组相比,有显著性差异（P〈0．051：[结论]中肺合剂对S180和Lewis荷瘤小鼠有明显的抑瘤作用,量-效关系呈抛物线型．其抑瘤作用可能与下调肿瘤组织cyclinD1蛋白表达水平有关。     

芍药软肝方对22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠抑瘤作用研究

[目的]探讨芍药软肝方对H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠的抑瘤作用,并初步探索其作用机制。[方法]采用H22肝癌、S180肉瘤移植瘤小鼠模型,分荷瘤阴性对照组(生理盐水)、芍药软肝方低、中、高剂量组和阳性对照组(环磷酰胺,CTX),观察芍药软肝方对两种荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用以及芍药软肝方对H22肝癌荷瘤小鼠生存时间的影响;并运用荧光定量RT-PCR法评价芍药软肝方对H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织cyclinD1表达的作用。[结果]芍药软肝方低、中、高剂量组和CTX组对移植性荷H22肝癌小鼠的抑瘤率分别为17.72%、33.99%、23.73%、43.95%;与生理盐水组相比,芍药软肝方低、中、高剂量组和CTX组瘤重均有显著性差异(P<0.01)。芍药软肝方低、中、高剂量组和CTX组对移植性荷S180肉瘤小鼠的抑制率分别为29.59%、31.34%、11.17%、53.92%;与生理盐水组相比,低剂量组和中剂量组瘤重均有显著性差异(P<0.05)。芍药软肝方各给药组对H22肝癌腹水瘤小鼠均有一定的生命延长作用,中剂量组与生理盐水组生存天数相比(18.42±2.50vs15.75±2.42),具有显著差异(P=0.014)。芍药软肝方能下调H22肝癌小鼠肿瘤组织cyclinD1 mRNA的表达水平,低剂量组或中剂量组与生理盐水组相比有显著差异(P=0.031,P=0.012),高剂量组与生理盐水组相比差异非常显著(P=0.004)。[结论]芍药软肝方对H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠有明显的抑瘤作用,其抑瘤作用可能与下调肿瘤组织cyclinD1mRNA表达水平有关。     

光敏剂e4光动力学治疗小鼠S-180肉瘤的实验研究

目的：利用激光激活e4,研究对在体小鼠S180肉瘤的杀伤作用,证明e4是可以选用的新型光敏剂之一。方法：荷瘤小鼠腹腔注射e4（40mg/kg）1次,6小时后用强度为24W/cm2的激光照射肿瘤区域1次,时间为20分钟（PDT组）。以空白对照组（C）,光照组（Light）（激光强度为20W/cm^2）,光敏剂组（e4）为对照组,每两天测量肿瘤的大小,12天后剥离肉瘤并称重比较。结果：e4在小鼠体内经激光激活后可明显抑制肿瘤生长,PDT组肿瘤的平均重量较空白对照组肿瘤的平均重量要轻,两者比较有统计学意义,P=0.0000,光敏剂组肿瘤的平均重量较空白对照组肿瘤的平均重量要轻,两者比较有统计学意义,P=0.0068。结论：e4光动力治疗对小鼠S-180肉瘤有明显杀伤或抑制作用,e4自身对小鼠S-180肉瘤有一定杀伤或抑制作用。     

环磷酰胺治疗小鼠S180肉瘤的体内31P磁共振波谱研究

目的 观察环磷酰治疗小鼠Ｓ１８０肉瘤的＾３１ＰＭＲＳ参数变化,以及这些参数的变化是否早于常规观察的瘤体积变化。方法 利用表面线圈＾３１ＰＮＭＲ方法,并研究了小鼠皮下接种Ｓ１８０肉瘤的体积。结果：对照组的ＰＣｒ／Ｐｉ和＋β－ＮＴＰ／Ｐｉ比值降低,而环磷酰胺给药组升高,且给药后２４,４８,７２ｈ时显著高于对照组（Ｐ〈０．０５）,对照组的ＰＭＥ／β－ＮＴＰ比值继续升高,而给药组ＰＭＥ／β－ＮＴＰ比值在给     

山仙颗粒对小鼠S180肉瘤组织中Bax基因表达的影响

目的:通过山仙颗粒(SXG)对小鼠移植性S180肉瘤组织中凋亡相关基因Bax表达的影响,探讨山仙颗粒抗肿瘤发生和发展的机理。方法:选取昆明小鼠40只,随机取10只作为空白对照组,其余30只小鼠于左后肢皮下接种S180肉瘤细胞,24小时后随机分为三组:荷瘤对照组(B组),金龙胶囊(JLC)组(C组),山仙颗粒组(D组)。观察出瘤时间,检测移植瘤重,分别计算抑瘤率,并应用免疫组织化学方法(二步法)检测瘤组织中Bax基因的表达情况。结果:与荷瘤对照组比较,山仙颗粒组出瘤时间显著延长(P<0.05),小鼠瘤重减轻(P<0.05),Bax水平升高(P<0.05);两用药组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:山仙颗粒能抑制荷瘤小鼠体内S180肉瘤的生长,其机理可能与上调Bax的表达水平、诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

共表达基因疫苗MAGE-1/IL-18的抗肿瘤免疫治疗作用

目的观察已构建的共表达基因疫苗pcIL-18-MAGE诱导特异性免疫应答的能力和抗肿瘤免疫治疗作用。方法共表达疫苗肌注小鼠,间隔十天加强免疫一次,共免疫三次,以pcMAGE-1、 pcIL-18、pcDNA3和PBS为对照,检测小鼠脾细胞上清液IL-12和IFN-γ的浓度、脾细胞CTL杀伤活性及小鼠T细胞亚群情况;观察基因疫苗免疫MAGE (+)小鼠的成瘤时间和生存时间。结果pcIL-18-MAGE质粒免疫的小鼠,其脾细胞对SMMC-7721的杀伤率最高,与各对照组相比,差异有统计学意义;脾细胞CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T细胞和上清液中细胞因子IL-12和IFN-γ均明显升高。共表达疫苗免疫MAGE (+)小鼠后,小鼠成瘤时间明显延迟,生存时间明显延长。结论共表达基因疫苗pcIL-18-MAGE在实验动物体内有显著的诱导特异性抗肿瘤免疫作用,且对肿瘤的生成有一定的抑制作用。     

CPP-Id-DC疫苗对淋巴瘤荷瘤鼠的免疫治疗作用和对淋巴瘤细胞攻击的免疫保护效应

目的了解树突状细胞(DC)疫苗对淋巴瘤荷瘤鼠的免疫治疗作用及疫苗免疫对淋巴瘤细胞攻击的免疫保护效应。方法将小鼠淋巴瘤A20细胞接种BAL B/c小鼠,建立荷瘤鼠模型,分别接种Id-DC和CPP-Id-DC疫苗,观察荷瘤鼠肿瘤大小变化及生存时间。小鼠预先分别接种Id-DC和PP-Id-DC疫苗,然后以A20细胞攻击,观察其成瘤率及生存时间。均注射PBS作为对照。结果接种PBS的荷瘤鼠肿瘤生长快,中位生存时间为33.4 d;接种Id-DC的荷瘤鼠,个别小鼠肿瘤生长减慢,中位生存时间为40.4 d,与PBS对照组相比,差异无统计学意义;而接种CPP-Id-DC的荷瘤鼠肿瘤生长明显减慢,5只小鼠中,1只肿瘤停止生长,1只肿瘤逐渐缩小、消退,90 d内的中位生存时间为70.8 d,明显长于PBS对照组和Id-DC接种组(P<0.01)。以Id-DC预防接种的小鼠予A20细胞攻击后大部分成瘤(4/5),成瘤时间为7～12 d,较PBS对照组略延长,中位生存时间为44.8 d;CPP-Id-DC接种组小鼠60 d内均无肿瘤生长。结论CPP-Id负载的DC疫苗治疗B细胞淋巴瘤优于单纯Id负载的DC疫苗,可以提高抑瘤率和延长荷瘤鼠的生存时间,可在小鼠体内产生对A20淋巴瘤细胞攻击的免疫保护。