用核酸杂交法首次证实国内土拨鼠中携带有土拨鼠肝炎病毒

土拨鼠肝炎病毒(WHV)是嗜肝病毒科中一个重要的组成,其基因图谱与人类乙型肝炎病毒(HBV)十分相似。土拨鼠自然感染WHV后,可由肝炎继发为肝癌,因此对研究人类乙型肝炎与肝癌的因果关系大有帮助。并认为它是动物肝炎病毒的一种最好的模型,已引起病毒和临床专家们的极大兴趣。美国土拨鼠有6个种,但只有6个种土拨鼠携带有WHV,且呈十分明显的地     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)核酸的荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原(WHcAg)和表面抗原(WHsAg)的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5’端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

西伯利亚土拨鼠自然感染病毒性肝炎肝脏病理观察

近年来,国内外相继在土拨鼠身上发现与人类乙型肝炎病毒(HBV)相似的病毒—土拨鼠肝炎病毒(WHV)此病毒属于一种内源性DNA多聚酶和含有大单股缺口的环状基因组的小DNA病毒,并与HBV抗原间呈交叉反应。因WHV不同于地松鼠和鸭乙型肝炎病毒,可持续感染土拨鼠发生慢性活动性肝炎和肝癌。我们结合血清学从病理组织学方面对土拨鼠肝炎进行研究。     

黄鼠携带HV的研究初报

近年来在对乙肝的防治研究中,国外相继发现了一些与HBV相似的动物病毒,有土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck he-patitis Virus),地松鼠肝炎病毒(Grou-nd hepatitis Virus),鸭肝炎病毒(Du-ck hepatitis Virus)。并把这一类病毒以HBV为代表组成一个新的病毒科。称之为嗜肝DNA病毒科(HepadnaViridae)。国内亦已证实青海的喜马拉雅亚种土拨鼠(Marmota himaliyana)和内蒙古的西伯利亚种土拨鼠(Marmota Cibirca)携带有WHV。     

抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的制备、性质鉴定及初步应用

为研制出能与土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHc）结合的特异单克隆抗体，使之能特异性地对土拨鼠肝炎病毒（WHV）进行检测。并应用于相关肝炎病毒的筛查。以原核表达的土拨鼠肝炎病毒重组核心蛋白（WHc1～149氨基酸）免疫BALB／c小鼠，常规杂交瘤技术进行细胞融合，有限稀释法克隆化，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫组织化学（IHC）筛选、鉴定。     

新生与成年土拨鼠肝组织中部分差异表达的基因比较分析

目的 新生土拨鼠感染土拨鼠肝炎病毒后,大部分发展为慢性肝炎,而成年土拨鼠感染后则多发生急性自限性肝炎[1]。本实验目的就是寻找其肝组织中可能导致这种预后差异的关键基因。 方法 采用全基因组表达谱芯片技术,对比新生与成年小鼠肝组织基因表达差异,选取目的基因,再通过多个物种序列比对,设计简并引物,在土拨鼠肝组织cDNA中扩增对应基因,测序,再次设计引物,进行实时荧光定量PCR。 结果 与新生土拨鼠相比,成年土拨鼠肝细胞中与钙离子重吸收相关基因DNM1（Dynamin 1）、DNM3（Dynamin 3）及Prkcc（Protein kinase C,gamma）表达率明显升高,分别上升2.65?.25倍,1.90?.34倍,2.94?.54倍。 结论 在钙离子重吸收通路中,以上三个在两组动物肝脏中表达差异最明显的基因,在新生组与成年组土拨鼠之间也有明显差异。此类基因造成肝细胞内钙离子浓度的差别,间接影响其中肝炎病毒的复制。这种表达差异很可能是导致两个年龄段动物感染土拨鼠肝炎病毒后转归不同的原因之一。     

土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的构建土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒并进行原核表达、抗体制备。方法应用基因工程技术将编码截短型土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHcAg1～149aa）的基因片段装入原核表达载体pQE60上,在JM109菌内进行诱导表达,使用切胶回收及Ni-NTA柱两种方法纯化目的蛋白。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及Western blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了含截短型土拨鼠肝炎病毒核心区基因的质粒并获得表达,经纯化得到了分子量约为16.5kD的重组核心蛋白,免疫家兔获得了高效价的特异性多克隆抗体,而且与HBcAg有交叉反应。结论获得的重组截短型土拨鼠肝炎病毒核心抗原（1～149aa）纯度高,免疫原性强。获得的兔抗-WHc效价高,特异性好,与HBcAg有交叉反应。     

嗜肝DNA病毒分子生物学与肝细胞癌研究进展

嗜肝DNA病毒主要由人乙型肝炎病毒(HBV)、土拨鼠肝炎病毒(WHV)、地松鼠肝炎病毒(GSHV)以及鸭乙型肝炎病毒(DHBV)组成,可引起急性、慢性肝炎和肝细胞癌(HCC)。本文将对近二年来国外学者就嗜肝DNA病毒分子生物学与HCC关系的研究进展进行讨论。     

美国乙型肝炎实验动物土拨鼠在中国繁殖成功(简报)

土拨鼠作为乙型肝炎动物模型具的突出的价值。除人乙型肝炎病毒外,土拨鼠肝炎病毒(WHV)是唯一可整合入其宿主细胞DNA的趋肝病毒,并可形成慢性感染、肝细胞癌和Delta联合感染。这些特性为黑猩猩等所不及。目前迫切需要阐明的乙型肝炎慢性化和免疫耐受机理,整合病毒基因组在肝细胞癌发生过程中的作用,Delta联合感染和超感染的     

一种类似于乙型肝炎病毒的鸭病毒

在鸭血清中,发现一种类似于乙型肝炎病毒的鸭病毒(DHBV)。此病毒有两种形态:一种是直径为40～45毫微米球形颗粒,外貌与 Dane 颗粒相似,结构清晰;另一种是直径在35～50毫微米较丰满而表面较粗糙的圆形颗粒。DHBV 含有内源 DNA 聚合酶和双链 DNA,DNA大小在0.5微米左右.病毒的表面与 HBsAg 有部分交叉反应。DHBV 见于江苏、上海、广西等地区和各品种的鸭血清中,可能和土拨鼠肝炎病毒、金花鼠肝炎病毒、人的乙型肝炎病毒属于同一类病毒。有可能成为研究 HBV 的繁殖复制和发病机理的有效的模型。     

一月龄土拨鼠肝炎病毒感染模型的建立

目的建立土拨鼠慢性病毒性肝炎的动物模型。方法对一月龄的土拨鼠进行颈外静脉注射感染土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）,使用两个剂量（高剂量：2.5×107 WID50;低剂量：5×106 WID50）感染,感染后在不同时间采用荧光定量PCR法测定血清中病毒DNA拷贝数,ELISA测定血清中WHsAg和WHcAb,并监测AST和ALT,肝脏活检HE染色观察病理变化,免疫组化检测WHsAg观察肝脏内病毒分布。结果感染后16周内,土拨鼠肝脏酶学AST和ALT水平均明显升高,土拨鼠血清内病毒载量在感染后第2周开始升高,16周达到高峰期,随后,低剂量组的病毒载量开始下降,而高剂量组的病毒载量仍接近106拷贝/ml。感染动物血清内可检测到WHsAg和WHcAb,肝脏病理切片显示小灶性肝细胞坏死伴炎细胞浸润及散在出血的急性肝炎症状,胞浆内可见WHsAg阳性分布。24周时,低剂量组土拨鼠血清内WHsAg和病毒DNA无法检出,提示其为急性自限性肝炎;高剂量组土拨鼠血清内依然可检测出WHsAg和病毒DNA,提示转为慢性感染。结论建立了急性病毒性肝炎转为慢性感染的土拨鼠模型,提示急性肝炎的病程发展除与土拨鼠感染年龄相关外,也与病毒感染剂量相关。     

丁型肝炎抗体诊断试剂的研制

取乙型肝炎患者Delta抗体(抗—HD)阳性血清,经硫酸铵盐析和DE—52柱层析,得到纯化的抗—HD抗体,用辣根过氧化物酶标记。用丁型肝炎病毒(HDV)感染慢性携带土拨鼠肝炎病毒的东方土拨鼠(Woodchuck)后,取其肝组织制成匀浆,离心后经Sepharose 4B柱,免疫亲和层析柱,获得高丰度的HDAg。双抗体夹心法测定其滴度高达1∶10~6。制备成ELISA竞争抑制法检测抗HD试剂盒,其特异性、敏感性、重复性与爱尔兰同种试剂比较结果一致。     

鸭乙型肝炎病毒的组织培养及其在抗病毒药物研究中的应用(简报)

嗜肝病毒属包括四种病毒:人乙型肝炎病毒(HBV)、土拨鼠肝炎病毒(WHV)、地松鼠肝炎病毒(GSHV)和鸭乙型肝炎病毒(DHBV)。长期以来,这属病毒无法在体外培养,限制了对该病毒的深入研究。1986年.美国学者成功地用DHBV感染了原代的鸭肝细胞培养,并观察到DHBV在肝细胞中复制。根据本实验室的条件,本研究用胰蛋白酶加链霉蛋白酶或EDTA消化肝组织的方法。用RPMI-1640     

丁型肝炎病毒抗原抗体系统的检测及其临床意义

丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus,HDV)是一种嗜肝RNA缺损病毒,其复制和表达需要乙型肝炎病毒(HBV)或其它嗜肝病毒(如鸭乙型肝炎病毒,旱獭乙型肝炎病毒,土拨鼠乙型肝炎病毒)的辅助,它能引起自亚临床型至暴发型肝炎的各种临床类型的急、慢性肝病,并对乙型肝炎病毒所致的肝脏病的临床表现及预后产生重要影     

抗乙型肝炎病毒药物筛选模型及其应用

乙型肝炎是一种严重危害人类的传染性疾病,全世界约有3.5亿乙型肝炎病毒（HBV）携带者,中国就有1.2亿人之多。HBV感染是慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的主要诱因。研制抗HBV的药物是药学工作者的重要任务。研究HBV的实验模型近年来有了很大进展,从猩猩、树鼩、鸭、转基因小鼠等动物模型到原代细胞、转染细胞等细胞模型。鸭、土拨鼠、转基因小鼠等动物模型已用于药物评价。     

旱獭肝组织中嗜肝病毒表面抗原表达的免疫组化研究

目的 从组织学和免疫学角度寻找旱獭嗜肝病毒感染的证据。方法 应用免疫组织化学技术以土拨鼠肝炎病毒表面抗原抗体检测101份旱獭肝组织中嗜肝病毒表面抗原的表达，同时观察旱獭肝组织常规病理改变，并对抗原检出与病理组织改变的关系进行相关分析。结果 旱獭肝组织中嗜肝病毒表面抗原检出率为82．2％(83／101)。阳性抗原颗粒定位于肝细胞胞浆和／或胞膜，阳性细胞呈散在、簇状和片状分布。101份肝组织标本中14份出现肝炎的病理改变，且与抗原检出之间存在明显的相关性(r=0．92)。结论 首次应用免疫组织化学技术证实旱獭存在类似土拨鼠肝炎病毒的嗜肝病毒感染，此种动物有可能用于建立嗜肝病毒感染动物模型。     

丁型肝炎病毒重组抗原的制备及应用

目的：获得能够应用于丁型肝炎病毒(HDV)酶免试剂的重组丁型肝炎病毒抗原。方法：采用RT-PCR自HDV感染急性期的土拨鼠肝脏扩增编码丁型肝炎病毒抗原的HDV cDNA,插入质粒pET-3α,转化大肠杆菌BL21,制备丁型肝炎病毒抗原表达菌株;对其表达蛋白的特异性、灵敏度、稳定性及活性进行鉴定;并将以该重组蛋白为主要原料制备的抗-HD酶免试剂与爱尔兰Noctech抗-HD试剂盒进行比较。结果：重组质粒PED-SHDAg和PED-LHDAg经异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达的2种蛋白经SDS-PAGE电泳后,Western Blot检测显示均与抗-HD发生强烈反应。该表达蛋白对抗-HD阳性血清抑制率为86％,37℃保存7d稳定性良好,比活性为1：8000,检测抗-HD灵敏度与国外同类试剂盒结果一致。结论：该重组丁型肝炎病毒抗原可用于抗-HD酶免试剂的制备。     

人乙型肝炎病毒实验感染成年树鼩的研究

许多证据表明,原发性肝细胞癌(PHC)与乙型肝炎病毒(HBV)的持续慢性感染密切相关。但迄今尚缺乏确定其因果关系的实验病理学资料。近几年来,发现土拨鼠、地松鼠、鸭和树松鼠等动物的血清和肝脏中存在与HBV相似并属同一类的嗜肝病毒,     

siRNA联合恩替卡韦在原代肝细胞中抑制土拨鼠肝炎病毒基因表达和复制

目的:在原代土拨鼠肝细胞中研究siRNA联合恩替卡韦(ETV)对土拨鼠肝炎病毒(WHV)基因表达和复制的抑制作用。方法:分别设计合成针对WHV PreS1、S、C、X基因的4种siRNA,转染原代土拨鼠肝细胞,同时给予ETV处理,Southern和Northern印迹检测WHV病毒复制中间体和mRNA水平,realtime PCR检测细胞上清中WHV DNA。结果:4种siRNA对WHV基因表达和复制的作用显示出不同的动力学特征,siWHs和siWHx的抑制作用最强,而siWHpreS1和siWHc的活性相对较弱。在原代肝细胞中,首先出现的是WHV mRNA水平的降低,然后是WHV复制中间体水平的降低,siWHs和siWHx最高抑制60%～70%的mRNA和病毒复制中间体,同时抑制细胞上清中90%的WHV DNA。另外siWHx与ETV联合应用不仅可以增强抗病毒作用,而且可以防止ETV停药反跳。结论:siRNA在WHV自然感染的原代肝细胞中可以有效抑制病毒的基因表达和复制,因而siRNA有可能开发成为新的抗HBV药物,尤其适用于核苷(酸)类似物的联合应用。     

CpG联合恩替卡韦在体内诱导早期病毒学应答抑制土拨鼠肝炎病毒的复制

目的:研究CpG寡脱氧核苷酸对嗜肝病毒复制和基因表达的抑制作用及其作用机制,探索抗病毒治疗的新方法。方法:利用土拨鼠肝炎模型研究P类CpG的免疫刺激和抗病毒活性。土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)慢性感染的土拨鼠12只分为4组,分别接受CpG皮下注射(4 mg/kg,每周1次,共16周)、恩替卡韦(entecavir,ETV)饲养(0.5 mg·kg-1·d-1,共12周)、CpG联合ETV治疗,或不处理作为对照。在处理后的第1、2、3天,1、2、3、4、8、12、16、20、24和28周,采用定量PCR检测血清WHV载量和PBMC内ISGs mRNA的水平,ELISA检测WHs Ag(WHV surface antigen)水平,生物活性分析血清IFN水平。结果:相比对照组和CpG或ETV单独治疗组,CpG联合ETV治疗显著抑制WHV的复制和表达,出现早期病毒学应答并强烈抑制血清WHs Ag抗原水平。CpG联合ETV治疗组的4只动物中有3只在治疗的13~17周后血清WHs Ag低于检测下限。另外,接受CpG治疗的大部分动物血清中检测到IFN、PBMC中Mx A mRNA显著上调(10~100倍)。结论:P类CpG在慢性WHV感染的土拨鼠体内诱导天然免疫,从而产生强烈的病毒抑制作用。通过优化方法达到长期持续的病毒抑制效果,将促进在HBV感染的个体开展类似的研究,从而开发成为乙型肝炎治疗的新方法。