喉癌中STK15基因扩增及表达的研究

目的研究喉癌中5TK15基因扩增、mRNA和蛋白表达增高在喉癌发生、发展中的作用。方法应用差异PCR方法检测40例喉鳞状细胞癌及癌旁正常对照组织5TK15基因扩增的情况；应用逆转录-PCR方法检测同批标本STK15mRNA表达情况；用免疫组织化学方法分析STK15蛋白表达。结果肿瘤组织中5TK15基因扩增率为35％（14／40）；STK15 mRNA表达增高占67．5％（27／40）；STK15蛋白表达的阳性率为72．5％（29／40）；将扩增与表达的结果与喉癌患者的临床各项指标进行统计学分析，5TK15基因扩增、STK15mRNA表达增高与肿瘤的分化程度显著相关（P〈0．05）；STK15蛋白表达与肿瘤的分化程度和病理分级显著相关（P〈0．05）。结论喉癌中5TK15基因扩增、mRNA和蛋白表达水平增高，导致中心体复制异常、染色体不稳定。可能在喉癌的发生及恶性进展中起一定作用。     

p53基因第8外显子在喉癌中的缺失和点突变

目的 探讨抑癌基因p53第8外显子突变在喉鳞癌分子发病机理中所起的作用。方法 应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）银染技术和DNA直接测序法,检测喉鳞癌新鲜组织中抑癌基因p53基因第8外显子的突变情况。结果 60例喉鳞癌组织中,15例发生迁移率异常的SSCP区带。在SSCP阳性样本中随机抽出4例进行测序分析,发现两个标本在288位密码子缺失一个A,两个标本在292位密码子上缺失一个A。285、287密码子上共发生3次G→T的颠换,286密码子第3位碱基发生A→T的颠换。结论 喉鳞癌p53基因点突变与碱基缺失常常同时并存。p53基因第8外显子突变在喉癌的发生中可能起着重要作用。     

PCR／SSCP技术在检测HLA基因点突变中的应用

聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ／ＳＳＣＰ）是根据核苷酸序列不同的单链ＤＮＡ，可形成不同构象，从而在不含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中泳动速度不同的原理，分离鉴定等长ＤＮＡ单链的方法，本文应用ＰＣＲ／ＳＳＣＰ方法检测了６０例无亲属关系个体白细胞抗原Ⅱ类基因（ＨＬＡ－ＤＱＡ１）５－上游调控区的等位基因多态性，并以ＰＣＲ直接测序证明每种ＳＳＣＰ带型都与不同位置单个碱基取代相关联。     

JWA基因启动子-76G→C多态性和膀胱癌易感性关系的配对研究

目的检测JWA启动子单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），探讨其对基因转录活性的影响和与膀胱癌遗传易感性的相关性。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性和DNA测序的方法，检测了155例膀胱癌病例和155例非肿瘤对照人群的JWA基因启动子多态性位点；构建启动子多态性片段氯霉素乙酰转移酶报告基因重组质粒，瞬时转染NIH．3T3细胞，检测启动子多态性片段对基因转录活性的影响。结果检测到一个新SNP-76G→C；C等位基因和GC基因型频率在膀胱癌病例组为10．00％、20．00％，比正常对照组（5．16％、10．32％）高，差异有统计学意义（P〈0．05）；与GG基因型相比，GC基因型启动子的转录活性显著降低（P〈0．01）。Logistic多元回归分析结果（P〈0．05，OR=2．05）显示这一多态性可能是形成膀胱癌新的独立危险因素。结论JWA基因启动子-76G→C多态性可能影响JWA基因转录和表达，从而增加膀胱癌易感性。     

p53基因突变与喉癌生物学行为的关系

目的　探讨 p5 3基因突变与喉癌生物学行为的关系。方法　应用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR- single strand conformation polymorphism,PCR- SSCP)银染技术结合 DNA直接测序 ,检测喉鳞癌新鲜或冰冻组织中 p5 3外显子 5～ 8的基因突变。结果　 - 、 - 喉鳞癌 p5 3基因突变率分别为6 9. 2 % (18/2 6 )和 85 .3% (2 9/34 ) ,P>0 .0 5 ;高、中、低分化程度的突变率依次为 5 2 .9% (9/17)、83.3%(2 0 /2 4)和 94.7% (18/19) ,P<0 .0 5 ;有、无颈淋巴结转移者突变率分别为 96 .4% (2 7/2 8)和 6 2 .5 % (2 0 /32 ) ,P<0 .0 1。从 47例 SSCP阳性标本中随机抽取 2 0例进行测序 ,19例测序为阳性 ,二者符合率为 95 %。结论　p5 3基因突变与病理分化程度及颈淋巴结转移有明显相关性。     

中国南方汉族和苗族人群hPARP1基因遗传多态性

目的检测人类聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1]基因的基因型和基因频率在中国南方汉族和苗族人群中的分布。方法收集187名中国南方汉族和210名苗族人的血液DNA，用PCR法扩增hPARP1基因4个外显子，并进行单链构象多态性分析。结果用PCR成功扩增出第12、13、16、17外显子，片段长度分别为253bp、313bp、175bp、362bp，在187名中国南方汉族和210名苗族人群中，分别有3人和9人检测出hPARP1基因第12、13、16和17外显子上各有1种基因突变，分别为Phe548Ser、Ala683Ser、Asp798Tyr、His808Arg。结论中国南方汉族和苗族人群中hPARP1基因第12、13、16和17外显子上存在突变型等位基因。     

血管紧张素原基因核心启动子区域突变与藏族原发性高血压的关联分析

目的 寻找血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)基因核心启动子区域存在的突变,分析该突变在中国西藏人群中的分布以及与原发性高血压的关联.方法 以藏族103例原发性高血压患者和82名健康受试者为研究对象进行病例-对照研究.用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction/single strand conformation polymorphism, PCR/SSCP)分析和自动荧光测序方法,对AGT基因核心启动子区域DNA序列进行突变分析;用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)方法分析AGT基因(-6)位点多态性.结果 PCR/SSCP分析发现,AGT基因转录起始位点上游(-20)位存在A→C突变,统计分析显示,藏族正常人群与高血压人群中该位点A等位基因均有较高的发生频率(0.9175,0.9124),突变位点多态性分布无统计学差异(P＞0.8).AGT基因转录起始位点上游(-6)位点存在A→G突变,在藏族正常人群中等位基因A和G分布频率分别为0.780和0.220,原发性高血压群体中它们的分布频率分别为0.626和0.374,两者之间存在差异(P＜0.025).结论 (1)藏族群体中AGT基因(-20)A等位基因有较高的分布频率;(2)AGT基因(-6)G等位基因在藏族高血压患者群体中发生频率较高,可能是藏族原发性高血压的遗传易感因子.     

粘多糖贮积症Ⅱ型患者IDS基因的一个新突变

目的　研究粘多糖贮积症 型 ( mucopolysaccharidosis type ,MPS )患者的艾杜糖 - 2 -硫酸酯酶 ( iduronate- 2 - sulfatase,IDS)基因的基因突变。方法　应用聚合酶链反应 -单链构象多态性( polymerase chain reaction- single strand conformation polymorphism,PCR- SSCP)对患者的 IDS基因可能的常见突变第 2、3、5、7～ 9外显子进行检测 ,并对 PCR- SSCP检出的突变进行直接测序 ,测序发现的突变进行 PCR-限制性酶切分析验证。结果　经 PCR- SSCP和 DNA序列分析发现该患者的第 7外显子发生新的点突变 ( G12 5 3T) ;聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 ( PCR- RFL P)电泳检测示患者和母亲出现突变导致的酶切位点 ,进一步验证了序列分析结果。结论　筛查所得的点突变 G12 5 3T可能是该 MPS 患者的致病原因     

X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良SEDL基因新突变

目的　研究X 连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 (X linkedspondyloepiphysealdysplasiatarda ,SEDL)的发病机理。方法　应用聚合酶链反应 单链构象多态及变性聚丙烯酰胺测序凝胶电泳技术 ,并结合DNA序列分析方法 ,对 5例SEDL患者及 3 0名正常对照SEDL基因的全部编码外显子及其邻近序列进行突变分析。结果　在 1例SEDL患者中发现了致病突变 ,并经DNA序列分析证实 ,SEDL基因第 5内含子剪接受体处IVS5 2— 1delAG紧接第 6外显子 3 2 2— 3 3 2delTTTTCAATGAA共 13个碱基缺失。结论该突变系国内外尚未见报道的新突变 ,这一突变可引起SEDL。     

长QT综合征KCNH2基因S4区新移码突变L539fs/47的研究

目的 对1个先天性长QT综合征家系进行分子遗传学分析.方法 应用短串联重复序列(short tandem repeat,STR)连锁分析确定突变基因的位点,聚合酶链反应-单链构象多态性结合测序的方法 筛选KCNH2基因的突变.结果 先证者KCNH2基因在第7外显子存在19 bp的缺失,位于KCNH2基因编码序列1619～1637之间,同时突变基因的下游存在1个A1692G(CTA→CTG,L564L)多态位点,引起L539fs/47移码突变.突变基因来源于父亲,其兄弟为致病基因的携带者但未出现临床症状.结论 KCNH2基因的L539fs/47移码突变是新突变点,是引起本家系临床症状的原因.     

HINT1基因在喉鳞状细胞癌中的表达和意义

目的组氨酸三聚体核苷结合蛋白1(histidine triad nucleotide-binding protein1,HINT1)基因在喉鳞状细胞癌组织中的表达情况及其与患者临床病理特征的关系,探讨HINT1基因在喉鳞状细胞癌发病过程中的作用。方法通过实时定量PCR和免疫组织化学检测82例喉鳞状细胞癌组织和56例癌旁组织中HINT1mRNA和蛋白水平的表达,分析其蛋白表达与患者临床病理特征的关系。结果喉鳞状细胞癌组织HINT1mRNA水平显著低于癌旁组织(P<0.01),HINT1蛋白表达阳性率显著低于癌旁组织(P<0.05)。晚期喉鳞状细胞癌组织中HINT1蛋白表达显著低于早期喉鳞状细胞癌组织(P<0.05)。结论 HINT1在喉鳞状细胞癌中可能发挥抑癌基因的作用。     

p53 Protein expression in laryngeal squamous cell carcinomas bearing wild-type and mutated p53 gene

We performed an immunohistochemical analysis to investigate the expression of p53 protein in a panel of 18 laryngeal squamous cell carcinomas, 15 primary tumours and three in relapse, previously analysed by us for the presence of p53 gene mutations. Dysplastic and/or normal surrounding mucosa was evaluated in 15 different tumours. The results of our study are the following: (1) expression of p53 protein was observed in one out of five tumours positive for p53 gene mutations (20%) and in 10 out of 13 (80%) negative cases; (2), p53 protein over-expression was frequently observed in normal and/or dysplastic mucosa surrounding either wild-type (7/11) or mutated p53 tumours (2/4); (3), p53 immunoreactive cells showed a pattern of distribution in normal and mildly/moderately dysplastic mucosa (basal layers), different from that in severely dysplastic mucosa (whole thickness). These data further support the hypothesis that p53 protein over-expression may be a marker of the earliest phases of multistep tumorigenesis in laryngeal squamous cell carcinoma.     

喉鳞状细胞癌中MTA2的表达及预后分析

目的探讨转移相关蛋白2(metastasis-associated protein 2,MTA2)在喉鳞状细胞癌组织中的表达,分析其与临床病理特征和患者预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测120例喉石蜡包埋组织中MTA2蛋白的表达,采用Western blot法检测喉新鲜组织中MTA2蛋白的表达量,利用Kaplan-Meier法绘制总生存期曲线,Log-rank方法分析两组生存曲线差异,Cox比例风险回归模型筛选喉鳞状细胞癌患者的预后影响因素。结果MTA2在正常喉组织、高级别鳞状上皮内病变和喉鳞状细胞癌组织中的阳性率分别为6.67%、43.33%和73.33%,差异有统计学意义(χ^2=36.11,P<0.001),MTA2表达与喉鳞状细胞癌组织学分级、临床分期及淋巴结转移显著相关(P均<0.05);在正常喉组织、高级别鳞状上皮内病变及喉鳞状细胞癌组织中MTA2的相对表达量分别是0.98±0.07、1.30±0.07和1.46±0.11,差异有统计学意义(F=121.194,P<0.001);Kaplan-Meier生存分析提示MTA2表达与喉鳞状细胞癌患者的生存期显著相关(P<0.05);多因素回归分析表明MTA2蛋白表达、临床分期及淋巴结转移是喉鳞状细胞癌患者有效的独立预后指标(P均<0.05)。结论MTA2过表达在喉鳞状细胞癌发生、进展过程中发挥重要作用,可作为喉鳞状细胞癌独立的预后因素,MTA2有望成为指导喉鳞状细胞癌治疗和判断患者预后的新分子学标志物。     

Survivin expression is a negative prognostic marker in laryngeal squamous cell carcinoma and is associated with p53 accumulation

AIMS: To investigate survivin expression in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC), its prognostic significance and relation to p53 status. Survivin is an inhibitor of apoptosis protein that is overexpressed in cancer. It has been implicated in both prevention of apoptosis and cell cycle regulation. It has been suggested that wild-type p53 represses survivin expression. METHODS AND RESULTS: Expression of survivin and p53 was analysed in 68 archival biopsy specimens of LSCC by immunohistochemistry. Survivin was detected in 67 of 68 LSCC cases; the proportion of survivin-positive cells varied from 8.2% to 100%. It was localized in the nucleus and/or cytoplasm of tumour cells. Of LSCC cases, 31.8% were p53+. The number of survivin-positive cells was significantly higher in the p53+ group. A high level of survivin expression and a supraglottic site of the tumour were two independent adverse prognostic factors in LSCC. CONCLUSIONS: Survivin is expressed in a varying proportion of cells in virtually all cases of LSCC. A high level of its expression predicts poor survival. Loss of wild-type p53 is a possible mechanism of survivin up-regulation in LSCC.     

Alterations of p53 gene and Ha-ras gene are independent events in solar keratosis and squamous cell carcinoma

In order to clarify the multiple-step progression from solar keratosis to squamous cell carcinoma, aberrations of the p53 gene (exons 2–11) and ras genes (exons 1 and 2) in solar keratosis and squamous cell carcinoma were investigated by polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism analysis. In a series of Japanese patients, eight of 27 (30%) samples of solar keratosis and three of six (50%) samples of squamous cell carcinoma showed structural abnormalities in the p53 gene. Only one solar keratosis (4%) showed a point mutation in the Ha-ras gene but not in the p53 gene. Among these cases, no mutation of ras genes could be detected in squamous cell carcinoma. Simultaneous mutation of ras genes and the p53 gene was not detected in any cases of either solar keratosis or squamous cell carcinoma. It is concluded that aberrations of the p53 gene and ras genes are induced through independent processes of ultraviolet irradiation In the course of carcinogenic change from solar keratosis to squamous cell carcinoma.     

喉癌p16、p15基因纯合性缺失的研究

目的 研究p16、p15基因缺失状态与喉癌发生、发展的关系。方法 提取喉癌新鲜组织中基因组DNA，采用聚合酶链反应技术，分别对80例喉癌进行p16基因第2外显子（p16E2）和67例喉癌进行p15基因第2外显子(p15E2）纯合性缺失研究。结果 检测p16E2弛合性缺失率为12.5%(10/80)，p15E2纯合性缺失率为11.94%（8／67），p16E2、p15E2共同缺失率为5.97%（4／67）。结论 p16E2和p15E2纯合缺失以及二者共同缺失与喉癌发生有相关性，可能在喉癌发生及恶性进展中起一定作用。     

喉鳞状细胞癌中OPN、MMP-9的表达及意义

目的研究骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和MMP-9在喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)组织中的表达及与临床病理特征之间的相关性,分析两者在LSCC发生、发展过程中的机制。方法采用免疫组化SP法检测47例LSCC及10例正常喉咽黏膜中OPN和MMP-9的表达。结果 (1)47例LSCC组织中OPN、MMP-9蛋白的阳性率分别为63.8%、68.1%,在癌旁正常组织中阳性率为10%和0,两者比较差异有显著性(P<0.05);(2)OPN表达与LSCC临床分期、病理分级、淋巴结转移有关(P<0.05),MMP-9与LSCC临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05),OPN和MMP-9的表达与患者年龄、性别、肿瘤位置无关(P>0.05);(3)LSCC组织中OPN和MMP-9的表达呈正相关(r=0.340,P=0.020)。结论 LSCC的发生、发展与OPN和MMP-9的高表达有关,OPN可能通过上调MMP-9的表达,降解细胞外基质,从而促进肿瘤的转移。     

Molecular analysis of p53 gene in laryngeal premalignant and malignant lesions. p53 protein immunohistochemical expression is positively related to proliferating cell nuclear antigen labelling index

This study was undertaken in order to investigate the molecular nature of the p53 gene in 19 laryngeal squamous cell carcinomas and dysplasias. Moreover, we have examined the possible relationship between proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression and p53 protein detection status in 42 laryngeal premalignant and malignant lesions in which 14 of the 19 samples used in the molecular study were included. p53 gene analysis was performed with the single-strand conformation polymorphism technique. PCNA was stained with the peroxidase/antiperoxidase immunohistochemical method using the monoclonal antibody PC-10. Data from previous work concerning p53 expression was used. We found that 9 of 12 of the immunohistochemically p53 positive (+) cases had mutations in exons 5 or 6. In the remaining immunohistochemically p53(+) and p53 negative (–) specimens there was no indication of sequence alterations. Furthermore, we did not observe any deletions in the chromosomal region 17p31.1 which encodes exons 4–8 of the p53 gene. The PCNA labelling index (LI) increased progressively with p53 protein detection status (percentage of cells immunohistochemically positive for p53). The difference between the group with the higher percentage of p53(+) cells and the others was statistically significant. These data show that although there is a discrepancy between immunohistochemical demonstration of p53 and molecular analysis, a large proportion of the former harbours the mutant form of the protein. In addition, p53 overexpression is positively correlated with PCNA LI, a finding which accompanies tumour progression.