日本沼虾表皮蛋白-5基因全长cDNA克隆及表达分析

为探究甲壳动物表皮蛋白多样性及其功能,根据表皮转录组资料,利用RACE技术扩增得到日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长序列,分析其生物信息学、不同蜕皮时期的表达特征以及KK-42对其表达特征的影响。日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长796bp,开放阅读框477bp,编码158个氨基酸,含RR基序,预测蛋白等电点为4.22,分子量为16.46ku;氨基酸序列比对发现日本沼虾表皮蛋白-5与克氏原螯虾Casp-2相似性最高,为76%,与其他甲壳动物表皮蛋白相似性为41%~53%。实时荧光定量PCR结果显示,日本沼虾表皮蛋白-5基因在3个时期——蜕皮间期、蜕皮前早期和蜕皮前晚期均有表达,其中在脱皮前晚期的相对表达量最高,为蜕皮间期的1400倍,与之有极显著差异(P0.01)。KK-42处理显著上调日本沼虾表皮蛋白-5基因在蜕皮前早期的表达,在处理后3、6h和48h表达量分别是对照组的6.3、4.8和11.4倍。KK-42诱导日本沼虾表皮蛋白-5基因的表达,使峰值前移,这可能是KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制之一。     

日本沼虾蜕皮激素受体(EcR)的cDNA克隆及其在胚胎发育过程中的表达分析

从日本沼虾中克隆了cDNAs编码的蜕皮激素受体基因(MnEcR)核苷酸序列。将编码区中的配体结合域(LBD)氨基酸序列与甲壳纲和昆虫纲中已知EcR s的该区域进行比对,结果显示了高度的相似性,构建的系统进化树表明MnEcR与甲壳类物种的同源性要高于昆虫类物种。采用RT-PCR技术对MnEcR转录本在组织中的表达进行检测,结果显示在所有检测的组织中均有表达,并且在眼、头胸甲下的表膜和卵巢中表达尤为突出。接着采用实时RT-PCR技术对MnEcR转录本在胚胎发育各期的表达情况进行分析,结果显示从卵裂期到原肠期的表达水平逐渐上升,从前无节幼体期开始至后无节幼体期表达水平呈显著的增加,并在后无节幼体期时达到最大,随后在前溞状幼体期和溞状幼体期表达水平又显著下降。由此说明MnEcR可能作为与胚胎发生相关的某些蜕皮甾类信号分子的媒介物,并间接说明在胚胎发生中某些蜕皮甾类参与了重要的生理反应。     

日本沼虾表皮几丁质合成酶基因克隆及表达分析

为了解日本沼虾几丁质合成酶（Chs）基因在蜕皮过程中的作用,本实验采用RACE技术首次从表皮中克隆了几丁质合成酶基因（MnChs）cDNA全长,并用生物软件对其序列进行生物信息学分析,RT - PCR技术检测该基因的时空表达模式。结果表明,其cDNA全长5133 bp,5′UTR为 283 bp,3′UTR为 159 bp,开放阅读框（ORF）长度为4701 bp,编码1566个氨基酸,分子量为179.57 KDa,理论等电点为6.09,包含两个几丁质合成酶的标签序列EDR和QRRRW及Chitin-synth-C结构域。经BLAST比对,与日本仿长额虾、淡水枝角水蚤Chs相似性分别为89 %和63 %。RT - PCR结果显示,在蜕皮周期各阶段,不同组织MnChs的表达量差异显著：头胸甲在A期达到最高,胃肠在D0和D4期均较高,尾扇和肌肉在D4最高,肝胰腺则普遍较低。结果表明,MnChs基因转录物不仅存在于表皮,在其它组织也有分布,且mRNA水平的变化与蜕皮周期有关,作为几丁质生物合成的关键酶,推测该基因的表达在新外表皮和内表皮的形成中发挥重要作用。     

日本沼虾DEAD-box家族基因vasa和PL10的克隆及其在卵巢发育过程中的表达

vasa和PL10同属于DEAD-box基因家族,具有依赖ATP的RNA解螺旋酶活性。本研究中,克隆了日本沼虾DEAD-box家族的两个成员,分别为vasa(Mnv-asa)和PL10(MnP-L10)。其中Mn-vasa全长2 408bp,包含1 803 bp的开放阅读框,编码601个氨基酸;Mn-PL10全长2 607 bp,包含2 127 bp的开放阅读框,编码709个氨基酸。成体组织的组织检测表明,Mnv-asa仅在性腺中表达,而Mn-PL10在性腺和其他器官中均有表达。Mn-vasa和MnP-L10在卵巢的原位杂交结果显示:Mn-PL10和Mnv-asa都在卵黄发生前期,卵黄发生期的早期和中期表达,而在卵黄积累末期不表达,但Mn-PL10在卵黄发生中期定位于卵母细胞的两端,而Mn-vasa则是均匀的分布在卵母细胞细胞质中。     

日本沼虾过氧化物还原酶基因的克隆及其表达分析

利用cDNA末端快速克隆方法获得了青虾(Macrobrachium nipponense)的过氧化物还原酶基因(Prx)全长cDNA序列。该基因cDNA全长878 bp, 包括72 bp的5′末端非翻译区, 594 bp的开放阅读框(ORF), 212 bp的3′末端非翻译区, 开放阅读框编码198个氨基酸。氨基酸相似度比对显示, 所分离的青虾过氧化物还原酶基因包括两个半胱氨酸残基的区域“FYPLDFTFVCPTEI”和“GEVCPA”。系统进化树分析表明, 青虾过氧化物还原酶基因与南美白对虾(Litopenaeus vannamei)过氧化物还原酶聚在一起, 具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示, 过氧化物还原酶基因在青虾不同组织中均有表达, 其表达量由低到高依次为肠道、心脏、卵巢、肌肉、鳃、肝胰腺。使用荧光定量PCR检测青虾在低氧胁迫和复氧条件下肝胰腺中的过氧化物还原酶基因mRNA的时空表达情况, 结果显示, 与对照组相比, 实验组青虾过氧化物还原酶在肝胰腺和鳃组织中的表达量分别在低氧胁迫12~24 h 和复氧6 h出现了3次明显上调, 由此推测过氧化物还原酶基因参与低氧应激分子过程。本研究结果可为进一步了解青虾低氧应激分子机制提供参考。

     

日本沼虾不同亚型维甲酸类X受体(RXR)cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE末端扩增技术,从日本沼虾(Macrobrachium nipponense)卵巢组织中获得了5种不同构型的RXR基因cDNA序列。结果显示:RXR基因中MnRXRL2含有最长的开放阅读框(open reading frame,ORF),其全长1698 bp,编码337个氨基酸。对比5个不同构型的核苷酸序列,有四个不同的剪接位点,一个发生在5′端A/B区域,产生了3种不同形式的5′端序列;一个在RXR受体结构的D区即铰链区域,使T-盒区长度也有3种形式(VQEERQR/VQVGGIEEERQR/VQVGGIE);两个发生在LBD区,其中一个是在H2-H3螺旋区域,产生了2种不同形式(MnRXRL/MnRXRS),另外一个是在D区产生了中断,缺失了E/F区域(MnRXRM)。将各个序列编码的氨基酸序列与其他物种相比,与甲壳类的同源性较高,表明RXR在进化中较为保守。     

日本沼虾半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆及其组织表达特征

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CST)是一种能够可逆结合并抑制半胱氨酸蛋白酶类的活性的蛋白,为了明确日本沼虾(Macrobrachium nipponense)CST基因(Mn CST)序列及其在日本沼虾卵巢中的作用,本研究利用RACE方法克隆获得日本沼虾Mn CST全长cDNA序列,利用qRT-PCR分析了其在不同组织和不同发育阶段的卵巢中的表达情况,并利用RNA干扰(RNAi)技术初步分析了Mn CST在日本沼虾卵巢发育中的作用。结果显示,Mn CST cDNA序列全长6199 bp,包含1183 bp 5′非编码区、2304 bp 3′非编码区和2709 bp开放阅读框,编码903个氨基酸残基,其氨基酸序列上有6个cystatin-like(半胱氨酸蛋白酶抑制因子样)结构域和42个磷酸化位点;Mn CST基因在各个组织中均有表达,肠中表达量最高;日本沼虾不同发育阶段的卵巢中均有Mn CST基因表达,Ⅳ期卵巢中表达量最高,Ⅱ期卵巢中表达量最低;Mn CST基因在日本沼虾卵巢中的表达变化与组织蛋白酶B(Cts B)和组织蛋白酶L(Cts L)基因的表达变化基本是一致的,但对卵黄蛋白原(Vg)基因的表达没有直接影响。Mn CST在日本沼虾卵巢中的作用可能主要是抑制Cts B和Cts L的活性,在日本沼虾卵巢发育过程中对Vg的水解起间接的调控作用。     

罗氏沼虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆与表达

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一种广泛分布在动植物体内的酶,并参与细胞多种代谢调控。在甲壳动物中,GS在能量代谢和渗透压调节过程中起着重要作用。实验克隆了罗氏沼虾GS基因。GS基因cDNA全长1 965 bp,开放读码框(ORF)为1 086 bp,编码361个氨基酸(aa),分子量大小为40.75 ku,等电点为5.81。进化树分析发现,罗氏沼虾GS基因与凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾GS聚为一支,氨基酸相似性达到95%。氨基酸多序列比对分析结果显示,罗氏沼虾GS属于无脊椎动物分支的GSⅡ群,有5个保守区域。实验对罗氏沼虾GS蛋白进行表达并制备了多克隆抗体。采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)对罗氏沼虾蜕壳前后的不同组织GS表达进行检测。qRT-PCR结果显示,GS基因在所检测的8个组织中均有表达;蜕壳前,其相对表达量顺序为:肝胰脏肌肉胃肠鳃心脏脑血淋巴。蜕壳后和蜕壳前GS基因在组织中的差异表达比较结果显示,除了在肝胰脏表达下调外,其他7个组织都表达升高,其相对表达量的差异顺序为:脑鳃胃肠肌肉心脏血淋巴。Westernblot结果显示,蜕壳后GS蛋白在鳃和肌肉组织表达量上调,与其mRNA表达一致。此外,罗氏沼虾蜕壳后肝胰脏GS酶的活性和谷氨酰胺的含量下调,而其在鳃、肌肉和血淋巴中上调,结果与其基因表达一致。研究表明,GS基因在不同组织中表达的差异可能和罗氏沼虾的能量代谢、渗透压调节有关。     

日本沼虾常见疾病与防治

日本沼虾 (Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍｎｉｐｐｏｎｎｅｎｓｉｃ) ,又称青虾、河虾 ,隶属于节肢动物门 (Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ)、甲壳纲 (Ｃｒｕｓｔａｃｅａ)、十足目 (Ｄｅｃａｐｏｄａ)、长臂虾科(Ｐａｌａｅｍｏｎｉｄａｅ)、沼虾属 (Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ) ,是我国重要的淡水养殖虾类。六十年代中期开始发展青虾养殖业 ,至八十年代末才开始步入发展盛期。随着高密度集约化养殖模式的发展 ,加上饲养管理方法尚欠科学 ,水质环境较差 ,导致近年来青虾病害蔓延扩大 ,常引发大面积死亡 ,造成极大的经济损失。1　黑鳃病由弧状杆菌 (Ｖ…     

中华鳖StAR基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

为了研究类固醇激素合成急性调节蛋白 (steroidogenic acute regulatory protein, StAR)在日本沼虾应答低氧胁迫过程中所发挥的作用,实验应用cDNA末端快速扩增 (RACE) PCR技术克隆了日本沼虾StAR全长cDNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR方法分析StAR在日本沼虾不同组织的分布情况,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)与免疫印迹(Western blot)技术对其在不同低氧胁迫阶段中的表达规律进行检测,观察低氧胁迫下精巢组织中StAR蛋白免疫组化定位。结果显示,日本沼虾StAR其cDNA全长3 361 bp (NCBI登录号：MW263908),包括5′-UTR 323 bp,3′-UTR 2 129 bp,开放阅读框909 bp,编码302个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,日本沼虾StAR基因与三疣梭子蟹等甲壳动物StAR聚类一支,具有最近的亲缘关系。半定量RT-PCR检测结果显示,StAR在日本沼虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺和心脏组织中最低,在精巢组织中表达处于较高水平。使用qRT-PCR技术检测日本沼虾精巢中StAR在低氧胁迫下时空表达情况,结果表明,与对照组相比,低氧处理组精巢中StAR基因表达量在1~48 h均显著上调,而在低氧处理组96 h显著降低。此外,本实验对StAR进行了原核表达及抗血清制备,采用Western blot检测StAR蛋白表达丰度基本与基因表达模式相似,免疫组化结果显示,StAR 蛋白在精细胞与间质细胞中均有表达。综上所述,长期低氧胁迫显著降低了StAR基因的转录表达水平,并且该基因可能在类固醇合成路径及精子发生过程中均发挥重要作用。本研究结果为进一步解析日本沼虾类固醇激素合成分子机制奠定基础。

     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

青虾冷休克蛋白Y-box编码基因的cDNA全长克隆与表达分析

为研究冷休克蛋白Y-box基因在青虾应答环境胁迫过程中所起的调控作用,实验应用RACE PCR技术首次克隆了青虾的冷休克蛋白Y-box基因全长c DNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术对其在青虾不同组织及环境胁迫过程中的表达变化特征进行分析。青虾冷休克蛋白Y-box基因c DNA全长1501 bp,包括84 bp的5′末端非翻译区(UTR),876 bp的开放阅读框(ORF),541 bp的3′UTR,开放阅读框编码291个氨基酸。氨基酸相似度比对显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因富含高度保守的冷休克结构域。系统进化树分析显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因与水蚤等节肢动物冷休克Y-box聚类一支,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,冷休克蛋白Y-box基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺组织中最高,使用荧光定量PCR检测青虾冷休克蛋白Y-box基因在低温胁迫和恢复条件下在肝胰腺中的m RNA时空表达情况,结果显示,与对照组相比冷休克蛋白Y-box在肝胰腺中的表达量分别在低温和低氧胁迫3,6和12 h出现了显著上调,而在恢复刺激后其表达量与对照组差异不显著。此外,本实验对Y-box进行了原核表达,为进一步研究Y-box基因的功能奠定了基础。     

日本沼虾血清淀粉样蛋白A(SAA)基因的克隆及其免疫功能

为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,MnSAA基因cDNA全长649 bp (GenBank登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日...     

我国五大湖日本沼虾线粒体COI基因部分片段序列比较

对我国五大湖日本沼虾100个野生个体的线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）部分序列进行了测定和分析,经比对获得578bp核苷酸片段,发现49个变异位点,得到35个单倍型,包括7个共享单倍型,各群体都具有较好的单倍型多态性和核苷酸多态性,其中鄱阳湖群体遗传多样性相对最高。AMOVA分析表明,五群体间总遗传分化系数F_st＝0.31873 （P<0.05）, 群体间具有较高的遗传分化。MEGA3.1软件计算五群体的Kimura 2-paramter遗传距离,洞庭湖群体和巢湖群体之间的遗传距离最远为0.0191,巢湖群体和洪泽湖群体之间的遗传距离最近为0.0051。以同属胖掌沼虾（Macrobrachium inflatum）为外群分别构建了NJ和UPGMA系统树,结果显示洞庭湖和鄱阳湖为一族群,太湖、巢湖和洪泽湖为一族群。     

日本沼虾VASA蛋白的原核表达、抗体制备及其免疫鉴定

Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85 ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Westernblotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni²⁺-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160 000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识别融合蛋白,而且也能识别日本沼虾性腺粗提液中的内源性VASA蛋白,免疫组化进一步显示,VASA蛋白主要分布在卵母细胞核周围和精原细胞质中,成熟精子中无信号,暗示VASA在日本沼虾生殖细胞发育分化过程中扮演重要角色。     

日本沼虾五群体形态性状对体质量的通径分析

为筛选出影响日本沼虾体质量的主要形态性状,以便确定人工选育的理想测定指标,以太湖、鄱阳湖、白洋淀、微山湖及淀山湖的野生日本沼虾为研究对象,随机选取各群体90尾虾测定19个形态指标,采用简单相关分析和通径分析等多元回归分析方法分析各群体对体质量作用较为突出的形态性状,并进行聚类分析。通径分析结果显示,太湖群体体长、头胸甲宽、第二步足长、头胸甲高、尾扇长对体质量的通径系数达到极显著,逐步回归建立其对体质量的回归方程、回归截距及相应的回归系数分别为–9.878、0.075、0.314、0.011、0.320、0.222;鄱阳湖群体头胸甲长、尾扇长、尾节宽、头胸甲宽、头胸甲高、尾节高、体长性状对体质量的通径系数达到极显著,回归截距和相应的回归系数分别为–1.618、0.392、–0.280、0.703、0.524、–0.359、0.688、–0.061;白洋淀群体体长、头胸甲宽、第二步足长和尾扇长对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数分别为–4.796、0.082、0.222、0.007、0.136;微山湖群体头胸甲长、腹节高、第二步足长、腹节宽对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数分别为–7.644、0.248、0.329、0.025、0.301;淀山湖群体体长、第二步足长、头胸甲宽、尾节宽、腹节宽对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数为–6.257、0.019、0.018、0.164、0.264、0.162。体长与头胸甲性状在不同群体中都对体质量的作用十分明显。聚类结果显示,地理位置越接近,形态上越相似。研究表明,各个地区被保留的性状与体质量的复相关系数为0.965、0.904、0.902、0.971、0.955,为影响各自群体体质量的主要自变量。     

在体条件下miR-305-5p对日本沼虾MnCHT3A的靶向调控作用

为了探索miRNA对日本沼虾几丁质酶3A(Macrobrachium nipponense chitinase 3A,MnCHT3A)基因的调控作用,实验采用生物信息学方法预测并筛选与MnCHT3A靶向结合的miRNA—miR-305-5p;利用qRT-PCR、生物化学以及组织学方法,研究了在体条件下,miR-305-5p对靶基因的调控作用。结果显示,一个蜕皮周期中miR-305-5p与MnCHT3A的表达量呈负相关,前者C期最高、A期最低;而MnCHT3A的表达趋势则相反。注射miR-305-5p mimics和miR-305-5p inhibitor后,与对照组相比,MnCHT3A转录水平分别降低60%和升高166%;MnCHT酶活性分别降低39.53%和升高133%。组织学观察发现,C期的头胸甲表皮为3层结构,由外向内依次为上表皮、外表皮和内表皮(H.E染色);几丁质荧光染色结果显示,几丁质分布在内、外表皮;扫描电镜结果清晰显示了内、外表皮的板层结构。与对照组相比,miR-305-5p mimics组内表皮的板层厚度增加,呈蓝色荧光的几丁质条带有增厚趋势;而miR-305-5p inhibitor组表皮结构紊乱,几丁质荧光分布不均且部分区域明显减弱。研究表明,miR-305-5p的靶基因为MnCHT3A,在体条件下,miR-305-5p能够靶向抑制MnCHT3A的转录。     

KK-42对蜕皮后期日本沼虾头胸甲超微结构的影响

为了深入探究KK-42对表皮结构的影响,本实验以外表皮形成趋于结束而内表皮开始出现的蜕皮后期幼虾为材料,通过扫描电镜观察石蜡切片法,分析了KK-42处理前后头胸甲外表皮,尤其是内表皮结构的变化。将处于蜕皮间期的健康幼虾[体长(3.5±0.1)cm]随机分为2组,分别用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液处理,取蜕皮后1.5、3.0、6.0及12.0 h幼虾头胸甲,观察其超微结构。另取蜕皮后6.0 h头胸甲,用解剖刀轻轻刮去内面组织,通过扫描电镜观察内表皮的表面结构。结果显示,蜕皮后1.5和3.0 h,头胸甲只包含上表皮和外表皮,KK-42处理组外表皮的板层数量显著增加,外表皮厚度分别比相应对照组提高了72.07%和38.67%;蜕皮后6.0～12.0 h,外表皮中疏松的板层趋于致密,其厚度在二组间无统计学差异。蜕皮后6.0 h,只有1层板层的内表皮出现,到蜕皮后12.0 h,板层数增至2层(对照组)和3层(处理组),且板层结构均疏松。此外,内表皮表面分布着大小不等、头尾走向的梭形孔道(pore canals);KK-42处理组内表皮结构未见明显变化。实验...     

罗氏沼虾几丁质酶3B基因的克隆及其在蜕皮周期中的表达

罗氏沼虾的生长发育及繁殖都与蜕皮紧密相关。几丁质酶是甲壳动物在蜕皮过程中最重要的酶之一。本研究对罗氏沼虾蜕皮周期外观特征和腹肢刚毛进行了观察描述,克隆并分析了罗氏沼虾的几丁质酶Ⅲ基因(MrChi3B),制备了几丁质酶Ⅲ蛋白的多克隆抗体,研究了其在蜕皮周期中的表达。罗氏沼虾几丁质酶基因cDNA的开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,大小为41.91 ku。通过氨基酸序列比对发现,MrChi3B与日本沼虾几丁质酶基因(Chi3B)的同源性最高,为94%。MrChi3B含有一个糖苷键水解酶家族18的催化域。实时定量PCR (qRT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测结果显示,MrChi3B在罗氏沼虾多个组织中均有表达,但是不同组织中的表达有差异。在蜕皮期之后,其在胃、表皮和肌肉中的表达量显著上升。在胃中其表达量在蜕皮间期达到最高;在表皮和肌肉中其表达量在蜕皮后期达到最高;肠中的表达量在蜕皮前期和蜕皮期有所上升;眼柄期的表达量在所有蜕皮期都偏低。本研究结果为进一步研究几丁质酶的功能提供参考依据。     

不同水温与饲料磷水平对日本沼虾生产性能、组织及水体磷含量的影响

为探讨不同水温与饲料磷水平对日本沼虾生产性能、组织及水体磷含量的影响,实验采用3×3因子设计,设定3个水温梯度(20、25和30°C)和3个饲料磷水平(1.1%、1.5%和1.9%),共9组(分别命名为20/1.1、 20/1.5、 20/1.9、 25/1.1、 25/1.5、 25/1.9、30/1.1、30/1.5和30/1.9),每组4个重复。虾饲养于室内循环系统中,养殖期为8周。结果显示,从水温来看,30°C组的终末体质量、特定生长率和增重率均显著高于20°C组,但与25°C组间差异不显著,而摄食量和饵料系数的变化趋势与此相反。此外,30°C组的磷保留率显著高于其他2组,且该组血淋巴磷含量显著高于25°C组,而与20°C组无显著差异。从饲料磷水平来看,1.9%磷水平组的终末体质量、增重率和磷保留率显著低于其他2组,而磷摄入量与饵料系数的变化趋势与之相反。1.9%磷水平组的特定生长率显著低于1.5%磷水平组,但与1.1%磷水平组差异不显著。此外,1.1%磷水平组全虾磷含量显著低于其他2组,且该组的血淋巴钙含量显著高于1.9%磷水平组,而与1.5%磷水平组无显著差异;1.5%磷水平组血清碱性磷酸酶活性显著高于1.1%磷水平组,但与1.9%磷水平组间无显著差异。水温和饲料磷水平之间的交互作用显著影响摄食量、磷摄入量、磷保留率、血淋巴磷含量及碱性磷酸酶活性,峰值分别发现于20/1.1、25/1.9和30/1.9、30/1.1、30/1.9及25/1.5组。另外,水体磷含量随时间延长显著升高,而20/1.5组水体磷含量极显著高于25/1.1组和30/1.1组。研究表明,当水温为30°C而饲料磷水平为1.1%时,日本沼虾的生长性能及饲料效率最优,同时其对水体中磷的排放量也较低。