小分子干扰RNA特异性抑制胃癌SGC7901细胞人端粒酶催化亚单位基因表达的研究

目的构建针对人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pU6-hTERT-siRNAs,观察其对胃癌SGC7901细胞hTERT基因的特异性抑制作用。方法采用报告基因质粒pCX-GFP(5510bp)和含有鼠U6启动子pU6(3300bp)质粒,设计合成针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹RNA(shRNA)序列,构建SHi-pU6-GFP质粒。应用Lipofeetamine^TM 2000将pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒转染K562细胞、SGC7901细胞,并用荧光显微镜观察转染效果。设计合成针对hTERT的siRNAs,构建重组pU6-hTERT-siRNAs质粒。Lipofectamine^TM 2000介导pU6-hTERT-siRNAs质粒转染SGC7901细胞。分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)定性和定量检测hTERT基因表达情况。结果质粒pU6和SHi-pU6-GFP经EcoRV和XbaⅠ酶切电泳后,前者出现3300bp和约300bp条带,而后者出现3300bp和约350bp条带,与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符。说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi-pU6-GFP质粒。K562细胞和SGC7901细胞中分别观察到转染pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少。定性、定量检测SGC7901细胞转染pU6-hTERT-siRNAs组hTERT基因表达抑制。结论针对hTERT基因设计的siRNAs表达质粒可以特异性抑制SGC7901细胞hTERT基因表达。     

shRNA抑制SGC7901胃癌细胞绿色荧光蛋白基因的表达

目的：观察针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹结构RNA(small hairpin RNA，shRNA)表达载体(SHi—pU6-GFP)对SGC7901胃癌细胞中GFP的抑制作用。方法：设计针对GFP基因的shRNA序列．构建SHi—pU6-GFP质粒。采用质粒pCX—GFP(5510bp)和含有鼠U6启动子pU6（3．3kb)质粒，应用Lipofectamine^TM2000将pCX-GFP质粒和SHi—pU6-GFP质粒转染SGC7901细胞。荧光显微镜观察转染效果和不同时间的转染效率。结果：质粒SHi-pU6-GFP经酶切电泳后，出现3．3kh和约350bp条带，与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符。说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi—pU6-GFP质粒。SGC7901细胞中观察到转染pCX—EGFP质粒和SHi—pU6-GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少：结论：shRNA可以有效地抑制SGC7901细胞中GFP基因的表达。     

肾癌ACHN细胞HIF-1α基因siRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的采用RNA干扰方法,构建及筛选对肾透明细胞癌ACHN细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因有干扰沉默作用的真核表达质粒。方法 CoCl2缺氧诱导培养ACHN细胞高表达HIF-1α,设计并化学合成4条针对HIF-1α基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建相应真核表达质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2/3/4,经测序分析,质粒构建成功后,分别转染ACHN细胞后培养24h,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,采用荧光实时定量PCR（real time-PCR）和免疫印记杂交法（Western blot）分别检测HIF-1α的mRNA与蛋白表达水平。结果质粒构建后经测序显示与设计完全一致;荧光显微镜下观察到ACHN细胞表达绿色荧光蛋白,证实重组质粒已转入细胞,转染效率约为78%;实时定量PCR与Western blot结果显示,siRNA-1/2组HIF-1α的mRNA与蛋白表达较对照组均明显下降（P〈0.05）,质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2明显干扰抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达,其中以质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1效果最佳。结论本实验成功构建靶向HIF-1α基因的真核表达质粒,并筛选出能有效抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达的质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2,这为肾癌的基因治疗提供了新的方法和手段。     

重组端粒酶pEGFP-hTRT质粒的构建

目的 构建具有绿色荧光蛋白报道(GFP)基因的端粒酶真核质粒载体，为转染细胞、延长细胞寿命提供基础。方法 酶切含人端粒酶逆转录酶(hTRT)基因的pGRNl45质粒获取hTRT片段，插入经酶切及磷酸化处理的GFP载体pEGFP—C1，形成8．1kb质粒，经HindⅢ、NotI酶切电泳筛选、鉴定并测序。结果 经酶切电泳分析得到3．4kb及4．7kb大小的两片段；测序结果显示接头两端序列正确。结论 重组竭粒酶pEGFP—hTRT质粒的成功构建，可用于细胞转染，对进一步研究组织工程种子细胞的衰老问题具有重要意义。     

短发卡状RNA特异性抑制表皮生长因子受体对大肠癌细胞凋亡的影响

目的体外构建编码人类表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞EGFR的特异性抑制作用以及对细胞凋亡的影响。方法体外合成EGFR的DNA模板引物和Pgenesil-1质粒构建编码shRNA的表达载体。应用脂质体Lipofectamine2000转染人结肠癌LoVo细胞,转染成功后以G418筛选4周,实时荧光定量RT-PCR(realtime RT-PCR)和Western-blot检测EGFR的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果成功的构建了针对EGFR的质粒表达载体。质粒载体成功转染后,EGFR mRNA表达下降了(81.3±2.8)%,蛋白表达下降了(73.4±2.3)%,细胞凋亡增加了(10.1±0.4)%,和对照质粒载体比较差异有统计学意义。结论我们构建的针对EGFR的质粒表达载体可以显著抑制其在人结肠癌LoVo细胞的表达,诱导细胞凋亡,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。     

转铁蛋白受体介导的Survivin对U251细胞生长的抑制作用

目的 构建Survivin短发夹状RNA(shBNA)序列的表达载体并观察其对神经胶质瘤细胞U251生长的抑制作用.方法 针对Survivin基因编码shRNA的序列,克隆到携带绿色荧光蛋白基因的载体,经酶切电泳和DNA测序鉴定.采用转铁蛋白.多聚乙烯亚胺(Tf-PEI)介导的转染方法 将重组的shRNA质粒转入U251细胞后,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测Survivin inRNA和蛋白表达;采用MTF法测定细胞增殖.结果 编码短发夹状的RNA序列被成功地插入到预期位点.转染Survivin shRNA1、shRNA2载体分别入U251细胞后,其bcl-2蛋白表达水平均显著降低,P＜0.05.U251细胞在48、72和96 h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的Survivin shRNA可特异性地抑制U251细胞生长.     

神经生长因子β腺相关病毒穿梭质粒的构建和鉴定

目的构建能够表达神经生长因子β(nerve growth factorβ,NGF-β)的重组腺相关病毒(adenoassociatedvirus,AAV)穿梭质粒,为进一步包装AAV奠定基础。方法利用高保真酶分别扩增pAAV-多克隆位点(multiple cloning site,MCS)的结构元件和pGenesil-1.1的功能元件,连入T-easy载体,限制性核酸内切酶酶切并回收目的片段,DNA连接酶连接,得到含U6和CMV双启动子的重组AAV穿梭质粒pAAV-U6/CMV-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP),用该质粒转染293细胞,观察有无绿色荧光表达;培养人Miapaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到NGF-β基因,插入T-easy载体,得到T-easy-NGF-β;将NGF-β插入pAAV-U6/CMV-EGFP,构建NGF-β重组AAV穿梭质粒pAAV-U6/CMV-NGF-β,将该质粒送基因测序。结果双酶切pAAV-U6/CMV-EGFP可见4 250、800 bp条带,质粒转染293细胞后可见绿色荧光表达;质粒T-easy-NGF-β双酶切可见3 015、736 bp条带,测序显示基因序列正确;双酶切pAAV-U6/CMV-NGF-β可见4 250、736 bp条带;质粒pAAV-U6/CMV-NGF-β测序显示载体中的基因序列正确。结论成功构建NGF-β重组AAV穿梭质粒,为进一步深入研究脊髓损伤的基因治疗提供了实验基础。     

双位点小干扰RNA靶向抑制表皮生长因子受体促大肠癌细胞凋亡和5-氟尿嘧啶化疗增效的实验研究

目的观察针对单位点与双位点的RNA干扰技术抑制大肠癌LoVo细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达,诱导细胞凋亡以及对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的差异。方法构建质粒表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2,脂质体转染人大肠癌LoVo细胞,G418筛选4周,分5组:1组为LoVo细胞,2组为对照质粒载体HK,3组为pU6-EGFR-shRNA-1,4组为pU6-EGFR-shRNA-2,5组为pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2各半量。实时荧光定量PCR和Westernblot检测mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,细胞増殖分析试剂CCK-8(CellCountingKit-8)测定5-FU不同浓度和时间对LoVo细胞的抑制率和半数抑制浓度(IC50)。结果正确构建了短发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体,成功转染;3、4、5组mRNA表达分别下降了(80·2±3·4)%、(81·3±2·8)%和(90·6±2·8)%,蛋白表达分别下降了(74·1±4·0)%、(73·4±2·3)%和(90·4±3·3)%,凋亡率增加了(10·4±0·5)%、(10·1±0·4)%和(14·2±0·5)%,同时对5-FU的IC50和细胞抑制率作统计学分析,5组,3、4组和1、2组三者之间比较差异有统计学意义,而1组2组间、3组4组间各项比较差异无统计学意义。结论两条shRNA均可有效抑制LoVo细胞EGFR表达,促进细胞凋亡,提高5-FU对癌细胞的杀伤作用,靶向联合位点的RNA干扰技术较单一位点的干扰效果更显著,为大肠癌的基因治疗联合化疗提供了新的思路。     

沉默RhoA基因对结肠癌LoVo细胞体内生长的抑制作用

目的：RNA干扰使RhoA基因沉默后对结肠癌LoVo细胞在裸鼠体内生长的影响。 方法：构建靶向RhoA基因的shRNA真核表达载体,转染LoVo细胞,筛选RhoA基因沉默的稳定克隆。采用Western blot法检测RhoA蛋白的表达水平。将稳定转染RhoA shRNA表达载体、转染空载体和未转染的LoVo细胞分别接种于裸鼠皮下,4周后测量瘤体的体积和重量;免疫组化检测肿瘤组织RhoA,VEGF和MMP-2蛋白的表达。 结果：RhoA shRNA转染组瘤体的体积与瘤重明显低于其他两对照组（P<0.01）。免疫组化结果显示,RhoA shRNA染组瘤体组织RhoA,VEGF和MMP-2蛋白表达均较两对照组显著降低（P<0.01）。 结论：沉默RhoA可以抑制结肠癌LoVo细胞移植瘤的生长。     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

NKX3.1短发卡RNA表达载体对NKX3.1基因表达的抑制作用

目的 研究同源框基因NKX3．1短发卡RNA（shRNA）表达载体在前列腺癌LNCaP细胞中对目的基因的沉默作用，为研究NKX3．1基因功能建立平台。方法 构建针对NKX3．1的shRNA质粒载体（pU6／NKX3．1-1和pU6／NKX3．1-2），并观察其介导LNCaP细胞中NKX3．1表达沉默的效果以及NKX3．1表达沉默对LNCaP细胞生长的影响。结果 构建的质粒pu6／NKX3．1—1和pU6／NKX3．1-2能够有效地抑制NKX3．1的表达，使NKX3．1mRNA和蛋白表达量显著下降，其中pU6／NKX3．1-2的效应高于pU6／NKX3．1—1，分别达到83．7％和72．1％。NKX3．1表达沉默能够使LNCaP细胞生长加快，细胞形态无明显改变。结论 成功构建NKX3．1特异性shRNA真核表达载体，使LNCaP中的NKX3．1表达下调，初步证明NKX3．1在LNCaP细胞生长中起非常重要的作用，为进一步深入研究NKX3．1基因的功能提供实验基础。     

携带TPH-2基因小分子干扰RNA表达载体的构建与鉴定

目的 构建携带色氨酸羟化酶(TPH)-2基因的小分子干扰RNA表达载体.方法 设计并合成shRNA TPH-2对应的两条互补的寡核苷酸链,pU6-CMV-GFP质粒经Age Ⅰ和EcoRⅠ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,目的 质粒转化感受态细胞,对长出的克隆应用菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析.结果 经PCR、酶切及测序证实,pU6-CMV-GFP-TPH-2 shRNA表达载体片段大小为332 bp,其中插入的片段序列和位点与预期完全一致.结论 实验成功构建pU6-CMV-GFP-TPH2 shRNA表达载体.     

Combining siRNAs at two different sites in the EGFR to suppress its expression, induce apoptosis, and enhance 5-fluorouracil sensitivity of colon cancer cells

BACKGROUND: The epidermal growth factor receptor (EGFR) has played an important role in the growth and apoptosis of colon cancer. The RNA interference (RNAi) technique can suppress gene expression, but the effects of double combining sites RNAi targeting EGFR have not been well understood. METHODS: pU6-EGFR-shRNA-1 and pU6-EGFR-shRNA-2 expressive vectors were transfected to the LoVo cells. Five groups were selected for the study: Group 1, the control cells; group 2, the negative control plasmid vector HK; group 3, pU6-EGFR-shRNA-1; group 4, pU6-EGFR-shRNA-2; group 5, pU6-EGFR-shRNA-1 and pU6-EGFR-shRNA-2, half for each. The mRNA and protein expression were assessed by Real Time quantitative PCR and Western blot. Apoptosis was determined via flow cytometry. IC(50) and the inhibition ratio of 5-fluorouracil (5-FU) were carried out by CCK-8. RESULTS: In groups 3, 4, and 5, the mRNA expression was decreased by (80.22 +/- 3.42)%, (81.30 +/- 2.83)%, and (90.58 +/- 2.76)%, respectively, and the protein expression was decreased by (74.11 +/- 4.02)%, (73.39 +/- 2.30)%, and (90.39 +/- 3.34)%, respectively. Meanwhile, the cell apoptosis increased by (10.43 +/- 0.49)%, (10.13 +/- 0.39)%, and (14.17 +/- 0.53)%, respectively. The IC(50) of 5-FU and cell inhibition ratio analysis demonstrated that there were significant differences between the following three: group 5, groups 3 and 4, and groups 1 and 2. CONCLUSIONS: Both pU6-EGFR-shRNA-1 and pU6-EGFR-shRNA-2 are capable of suppressing EGFR expression of the LoVo cell and can promote apoptosis and increase the cell toxicity of 5-FU. The double combining sites RNAi technique is significantly better than a single site.     

腺病毒介导的RNA干扰对大肠癌HCT116细胞株β-连环蛋白表达的抑制作用

目的 构建针对人β-连环蛋白(catenin)的腺病毒载体pAdHl-shβ-catenin-GFP,应用RNA干扰(RNAi)的方法,观察其在体内和体外对人大肠癌细胞株HCT116生长的抑制作用.方法 设计合成针对β-catenin的shRNA,并克隆至腺病毒表达载体AdH1-GFP上,制备针对β-catenin的腺病毒载体AdH1-GFP-shβ-catenin-GFP,与腺病毒骨架载体共转染293A细胞包装病毒,采用空斑法测定病毒滴度为5×109pfu/ml,感染HCT116细胞.应用Western bolt和报告基因检测HCT116细胞β-cmemn表达水平和转录活性,噻唑蓝(MTT)比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线,建立软琼脂克隆形成实验观察肿瘤体外成瘤能力,同时建立裸鼠HCT116细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果 成功构建针对β-catenin基因的RNAi腺病毒表达载体,与AdH1-GFP组比较AdH1-shβ-catenin-GFP组在感染24 h和48 h HCT116细胞β-catenin表达水平和转录活性显著降低,细胞的增殖和克隆形成能力则下降50%(P<0.01).体内实验表明重组腺病毒载体介导的β-catenin shRNA明显抑制肿瘤生长(P<0.01).结论 腺病毒介导的RNAi技术可有效降低β-catenin在大肠癌细胞中的表达水平,抑制肿瘤细胞在体内外的增殖活性.     

Long-term effects of PERV-specific RNA interference in transgenic pigs

Semaan M, Kaulitz D, Petersen B, Niemann H, Denner J. Long‐term effects of PERV‐specific RNA interference in transgenic pigs. Xenotransplantation 2012; 19: 112–121. © 2012 John Wiley & Sons A/S. Abstract: Background: Porcine endogenous retroviruses (PERVs) represent a risk of xenotransplantation using porcine cells, tissues, or organs, as they are integrated in the porcine genome and have been shown to be able to infect human cells in vitro. To increase viral safety by RNA interference, transgenic pigs expressing a PERV‐specific small hairpin (sh)RNA targeted to a highly conserved sequence in the pol gene (pol2) were generated in which expression of PERVs was reduced (Xenotransplantation, 15, 2008, 38). However, it remains to be shown how long expression of the shRNA and the RNA interference is effective in reducing PERV expression. Methods: To analyze the long‐term duration of RNA interference, expression of the PERV‐specific pol2 shRNA and inhibition of PERV expression was studied repeatedly in fibroblasts and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of transgenic pigs over a period of 3 yr, when animals were sacrificed and expression was studied in different organs. Expression of the PERV‐specific shRNA was measured using a newly developed real‐time PCR, and expression of PERV was measured using a PERV‐specific real‐time PCR. Results: Over a period of 3 yr, PERV‐specific shRNA and green fluorescent protein (GFP) as reporter of the vector system were consistently expressed in transgenic animals. PERV expression was significantly reduced during the entire period. Levels of PERV and shRNA expression were different in the various organs. PERV expression was highest in the spleen and the lungs and lowest in liver and heart. However, in all organs of the transgenic pigs, PERV expression was inhibited compared with the vector control animals. Conclusions: Transgenic pigs expressing PERV‐specific shRNA maintained their specific RNA interference long term, suggesting that PERV expression in the xenotransplants will be suppressed over extended periods of time.     

短发夹状RNA对PC-3M细胞端粒酶逆转录酶基因表达和端粒酶活性的影响

目的:研究短发夹状RNA(shRNA)对PC 3M细胞中端粒酶逆转录酶(hTRT)基因表达及端粒酶活 性的影响。方法:构建针对hTRT基因的shRNA表达质粒psilencer TRT,在质脂体介导下转染人前列腺癌PC 3M细胞,应用RT PCR及免疫组织化学检测hTRTmRNA及蛋白表达水平,应用SYBR Green染色法检测端粒 酶活性的变化。结果:重组体psilencer TRT转染细胞24h和48h后显著下调hTRTmRNA及蛋白水平,作用 48h后,其抑制率分别为85.39%和79.17%,较空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。同时,随着时间的延 长,端粒酶活性亦有明显下降(P<0.01)。结论:利用短发夹状RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为前 列腺癌的基因治疗提供新思路。     

靶向人乳腺癌HPSE基因的shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法：体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果：HPSE shRNA转染MDA-MB-231细胞72 h后,RT-PCR结果表明：所设计的siRNA1组、siRNA4组针对不同靶点的shRNA与对照组相比均可有效抑制HPSE的表达,且成功筛选出最有效抑制HPSE表达的shRNA4序列（P〈0.05）。结论：成功构建了HPSE shRNA重组慢病毒载体,其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后显著抑制了HPSE的表达,为进一步探讨乳腺癌的侵袭转移机制及肿瘤的基因治疗提供了实验基础。