香蕉3种病毒的多重PCR检测体系

根据GenBank中已发表的香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus,BBTV）﹑黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和香蕉线条病毒（Banana streak virus,BSV）的基因序列,找出保守序列分别设计出特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,建立了能同时检测3种病毒的多重PCR检测体系。该体系可同时扩增BBTV的615 bp、CMV的480 bp和BSV的945 bp的特异片段。这些片段克隆测序结果表明,多重PCR扩增的不同病毒片段是特异和专化的,其核苷酸序列与相应的病毒基因片段的相似性都达91%以上。该体系的灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg感病植物组织中均能检测到这3种病毒。     

番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法

针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）、溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,Cmm）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum,Rs）以及疮痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv）,建立了四重PCR检测技术,为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据gap1基因设计Pst特异性引物BW-F/BW-R,经PCR条件优化,扩增出了375 bp的特异性片段。将设计的引物与已报道的3种细菌特异性引物组合,通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响四重PCR扩增的因素,优化了其反应体系。四重PCR反应体系中的引物对BW-F/BW-R、Fan1/Fan2、RS-1-F/RS-3-R和XCVF/XCVR可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为375、146、716和517 bp的特异性目的片段,反应体系退火温度为57.1 ℃,4对引物的终浓度分别为0.24、0.16、0.16和0.08 μmol ? L-1,延伸时间45 s,35个循环。该四重PCR反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌,灵敏度达到10-1 ng ? μL-1。     

番茄黄化曲叶病毒石家庄分离物的分子鉴定及序列分析

根据番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）基因组序列的复制酶保守区设计1对引物JC1,对石家庄具有典型番茄黄化曲叶病毒症状的番茄样品进行检测,经PCR扩增得到626 bp的片段,序列分析比对表明其为TYLCV的一部分。根据上述序列设计1对特异引物QC,通过PCR分离石家庄的TYLCV全长序列并进行测序。同时利用已报道的DNA-B的通用引物CR01/CR02进行PCR扩增。结果表明石家庄分离物只含有DNA-A组分,全长为2 781 bp（GenBank登录号：KF612971）,命名为TYLCV-Shijiazhuang。基因组序列比较发现,该分离物与TYLCV-Israel株系相似性为99.0%。基因组序列系统进化分析表明,石家庄病毒分离物与北京分离物TYLCV-Beijing3（GenBank登录号：GU983859）、山东分离物TYLCV-SDSG-XC（GenBank登录号：KC999851）序列相似性很高,均属于TYLCV-Israel分支。     

利用正交设计优化甘蔗SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16（45）对甘蔗SRAP-PCR反应体系的五大因素（Mg2＋、dNTPs、引物、模板DNA、Taq酶）在4个水平上进行优化,得到如下结论：各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次是：Mg^2＋、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA;通过对各因素进行筛选,建立甘蔗SRAP-PCR反应的最佳体系（20μL）为：dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.1μmol/L、Mg^2＋2.5 mmol/L、Taq酶0.25U和模板DNA 60 ng。     

侵染节瓜的3种病毒多重PCR检测体系的建立

 根据侵染节瓜3种病毒——小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,初步建立了能同步、快速、灵敏地检测这3种病毒的多重PCR检测体系,为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。     

大白菜KASP反应体系的优化与建立

以大白菜基因组DNA为模板,对影响竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive allele specific PCR,KASP）的反应体积、引物浓度和DNA模板用量等3个参数进行优化,建立了适用于大白菜的KASP反应体系。96孔模块最佳反应体系中,总反应体积为8 μL,其中模板DNA（60 ~ 80 ng · μL-1）1 μL,KASP Master mix（2×）4 μL,引物混合物（50 μmol · L-1）0.14 μL,ddH2O 3 μL。384孔模块最佳反应体系中,总反应体积为4 μL,其中模板DNA（60 ~ 80 ng · μL-1）1 μL,KASP Master mix（2×）2 μL,引物混合物（50 μmol · L-1）0.07 μL,ddH2O 1 μL。利用不同引物和不同的大白菜材料对优化的反应体系进行验证,均获得了较好的KASP-SNP分型,验证了该优化体系的稳定性。该反应体系可以用于大白菜遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱构建等遗传学研究。     

我国6个省份番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染率及序列系统发育分析

于2017～2019年在我国6个省份的番茄主产区，采集疑似番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）和（或）番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染的番茄样本，利用特异性引物进行RT-PCR 或PCR 扩增，将符合预期条带大小的PCR 产物测序后进行系统发育分析。结果表明，我国6 个省份番茄ToCV 和TYLCV 的复合侵染率为25.29%，其中山东省两种病毒复合侵染率最高，为46.43%。序列分析结果表明，测定的ToCV CP 基因序列与已报道的对应序列同源性在98.30% 以上，ToCV CP 基因序列没有发生明显的遗传分化；TYLCV 基因组部分序列与已报道的对应序列同源性在96.00% 以上，没有发生明显的遗传分化。     

基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术的樱桃病毒A（CVA）的检测方法

根据樱桃病毒 A（cherry virus A，CVA）外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针，建立了樱桃中 CVA 的重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）检测方法。该方法可在恒温 38 ℃条件下进行，40 min 即可完成检测。灵敏度试验表明，采用 RPA 方法检测 CVA 的灵敏性是 PCR 方法的 10 倍，且与侵染樱桃的另外 6 种病毒和 1 种类病毒无交叉反应。此外，具有标记的扩增子可通过侧向流试纸条直接观察结果。采用该方法检测田间样品效果良好。     

油橄榄SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

设计正交试验,以油橄榄叶片DNA（CTAB法提取）为模板,对影响油橄榄SSR—PCR反应的主要影响因素进行优化,建立适合油橄榄的PcR反应和DNA多态性检测体系。试验结果表明油橄榄最佳SSR-PCR反应体系为：20μl体系中含有DNA模板20ng、dNTP0．15mmol／L、引物0．15μmmol／L、Taq酶1．0U。同时对100对引物进行扩增试验,筛选出多态性好、条带清晰的引物24对,用于油橄榄遗传多样性分析。     

香蕉束顶病毒实时荧光PCR检测方法的建立

根据香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus,BBTV）复制酶基因保守序列设计特异性探针及引物,建立了BBTV实时荧光PCR（TaqMan real-time PCR）检测方法。结果显示,所建立的检测方法在检测质粒DNA标准品和发病香蕉植株总DNA时,其灵敏度均比普通PCR高,且与黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和香蕉线条病毒（Banana streak virus,BSV）无交叉反应。同浓度样品进行7次重复性试验,各重复扩增结果所得Ct值的变异系数为0.93%,表明建立的荧光定量PCR检测方法重复性好,Ct值保持稳定。利用所建立的方法检测带毒香蕉吸芽繁殖的组培苗中的BBTV,发现BBTV含量随着继代数的增加而增加,并且组培苗顶部叶片中的含量高于其他部位的叶片。     

河南番茄褪绿病毒的分子鉴定

2014年在河南省郑州、济源、新郑、中牟、扶沟等地发现大量保护地番茄植株的叶脉间出现褪绿症状,疑似由番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)侵染引起。以这5个地区的番茄病叶为样本提取总RNA,利用ToCV HSP70h(Heat shock protein 70 homolog,热激蛋白70家族)基因的特异引物对样本进行RT-PCR检测,均扩增出约460bp大小的目的条带。PCR产物测序和序列分析结果表明,该序列与国际上报道的ToCV HSP70h的序列相似性达到99%以上,表明ToCV是为害河南省番茄产区造成褪绿症状的主要病原之一。     

马铃薯5种病毒多重PCR检测技术的建立及应用

采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯A病毒（PVA）和马铃薯S病毒（PVS）的方法。根据 GenBank中PVX、PVM、PVY、PVA及PVS（CP）基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、循环次数、延伸温度、引物组合浓度进行优化,建立了能同时检测5种马铃薯病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出PVX、PVM、PVY、PVA及PVS特异片段,其大小分别是138、213、369、468和657 bp。测序结果表明,5种病毒的序列与相应参考序列相似性达到97%以上。灵敏度分析结果表明,多重RT-PCR方法能够检测植物组织量为10-3 mg。应用建立的多重RT-PCR检测方法对田间样品和组培苗进行检测,结果显示,该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的5种马铃薯病毒。     

芋病毒病田间调查及毒氟磷对芋病毒病的防治效果

对芋病毒病及类似病害症状进行调查,其症状表现主要分为羽状花叶、叶片向上卷曲并伴有黄化或花叶、脉间黄化、明亮褪绿黄斑、褪绿斑点(斑驳)及叶片皱缩和叶缘黄化。采用RT-PCR和PCR技术对随机采集的32份表现症状的鄂芋一号样品进行了芋花叶病毒(DsMV)和芋杆状病毒(TaBV)2种病毒的检测,检出率均为68.8%。同时,利用30%毒氟磷可湿性粉剂500倍液和1 000倍液对芋病毒病进行田间药效试验,第一次施药后10 d调查,毒氟磷可湿性粉剂500倍液和1 000倍液的防治效果分别为30.9%和24.9%;第二次施药后15 d调查,500倍液和1 000倍液防治效果分别为72.8%和59.4%。田间药剂试验结果表明,毒氟磷可湿性粉剂500倍液比1 000倍的防治效果好,从田间芋头长势可看出,毒氟磷对芋头生长有明显的促进作用。     

主要果树病毒实时荧光定量PCR检测技术研究进展

综述了苹果、梨、柑橘、葡萄和香蕉病毒的实时荧光定量PCR检测技术研究进展,并对今后主要研究方向进行了讨论和展望。     

柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

柑橘病毒类病害诊断技术研究进展

柑橘病毒类病害对世界柑橘产业造成了严重的损失。诊断技术是防控柑橘病毒类病害的重要保障。对指示植物鉴定、电镜技术、血清学方法、核酸杂交、（RT-）PCR以及新近出现的环介导恒温扩增、基因芯片和高通量测序等技术在柑橘病毒类病害诊断中所取得的进展进行综述,并对今后的发展方向进行了展望,旨在为更好地防治柑橘病毒类病害提供借鉴。     

猕猴桃病毒A和B的RT-PCR检测及分子变异初步研究

为明确猕猴桃病毒A（Actinidia virus A,AcVA）和猕猴桃病毒B（Actinidia virus B,AcVB）在中国猕猴桃（Actinidia sp.）上的侵染状况和分子特性,采用RT-PCR技术对151份猕猴桃样品的AcVA和AcVB进行检测,检出率分别为15.2%和17.9%,所收集的6种猕猴桃样品中均检测到一种或两种病毒。发现AcVA的ORF1、ORF4和ORF5扩增片段序列存在较大分子变异,不同分离物的269 bp片段（ORF1）核苷酸序列相似性为77.3% ~ 99.3%。在基于各扩增片段核苷酸序列的系统进化树中,AcVA分离物聚为2 ~ 3组。采用引物AcVB5F/5R扩增获得20个AcVB分离物的342 bp或338 bp的ORF5片段,核苷酸序列相似性为81% ~ 100%,与新西兰AcVB分离物TP7-93B相应片段的核苷酸序列相似性为83.9% ~ 99.7%,在系统进化树中聚为3组。