副溶血弧菌菌株1211U的活的非可培养状态

将副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）菌株１２１１培养于低温贫养条件下,以平板菌落计数法（ＰＣ）和最大近似数法（ＭＰＮ）检测可培养细菌数,５０￣６０ｄ后表明可培养数下降为零。吖啶橙荧光显微镜直接计数法（ＡＯＤＣ）检测细菌总数,表明细菌总数始终变化不大,而活菌直接计数法（ＤＶＣ）检测到的活菌数保持在１０＾５个／ｍｌ。本实验证明了副溶血弧菌１２１１Ｕ株在一定的条件下或进入活的非     

活的非可培养状态霍乱弧菌的复苏

将活的非可培养状态的霍乱弧菌（ＥＩＴｏｒ生物型）注入兔肠结扎段中，通过兔肠可以使休眠的霍乱弧菌复苏，恢复成为可培养状态．复苏的霍乱弧菌具有很强的毒力，使兔肠结扎段肿胀、积水、内壁紫红色并出现溃疡。结扎段积液中含有约１０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌ细菌。     

细菌活的非可培养状态研究进展

细菌活的非可培养状态(Viable but nonculturable state,VBNC)是指某些细菌在不良环境中所形成的休眠状态,常规条件培养下不能繁殖,却仍然保持代谢活性。VBNC细菌的形态、生理生化、遗传特征等都会发生变化,且能在适宜条件下复苏为可培养状态。这一概念是1982年中国海洋大学徐怀恕在美国马里兰大学访问期间,与Rita R. Colwell等首次提出的,在国内外引起了极大反响和关注。迄今为止,国际上已发表VBNC相关论文10 800余篇。本文在这些文献的基础上,针对VBNC细菌近40年的研究成果进行系统阐述,包括VBNC细菌的发现、主要类群和诱导因素、形成机制、生物学特征、检测和复苏方法以及环境VBNC细菌的分离培养等。目前绝大多数海洋微生物尚未获得纯培养,对VBNC细菌进行复苏或将成为分离培养海洋环境中未培养微生物的重要手段。     

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的细胞形态研究——活的非可培养状态细胞

使用透射电镜和萤光抗体染色，对处于可培养和活的非可培养状态的霍乱弧菌进行了细胞形态结构比较研究。结果表明：处于非可培养状态的霍乱菌细胞，体积明显地缩小，形态由弧形变成了球形，我们共观察了３８２个非可培养状态的细胞，发现它们的细胞壁都是完整的，即不是细菌－Ｌ型，在这些细胞中也都没发现芽孢结构     

不同条件下哈维氏弧菌(Vibrio harvey)对墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)致病性研究

为研究墨吉明对虾弧菌病的防控方法, 本文通过人工注射感染的方式, 研究不同数量哈维 氏弧菌及在不同温度、盐度、pH、不同硝酸氮、亚硝酸氮和氨氮浓度条件下哈维氏弧菌对墨吉明对 虾的致病性的影响。结果表明: 当人工感染哈维氏弧菌数量为3.16×10⁸ CFU 时, 24 h 内对虾累计死 亡率为96.67%; 哈维氏弧菌数量为3.16×10⁶ CFU 以上, 实验结束时, 对虾累计死亡率都超过了 50.00%.在20-32℃ 范围内, 随着温度升高哈维氏弧菌致病力增强, 并且低温组(20℃ 实验组与 26℃ 实验组)对虾累计死亡率显著低于高温组(32℃ 实验组)(P<0.05).在温度为(24±1)℃ 时, 盐度为 20 时对虾累计死亡率处于较低水平; 在温度为(24±1)℃, 盐度为(22±1)时, 96 h, pH 为8.0 时对虾 累计死亡率最低, 并且与另外两个实验组差异显著(P<0.05); 温度为(24±1)℃, 盐度为(22±1), 硝 酸氮对感染哈维氏弧菌的墨吉明对虾有胁迫作用; 在亚硝酸氮浓度(1.0-10.0 mg/L)、氨氮浓度 (0.5-1.5 mg/L)范围内, 哈维氏弧菌对墨吉明对虾的致病性, 随着浓度升高而增强。本实验为墨吉明 对虾弧菌病的防控提供了理论基础。     

大肠杆菌O157:H7的活的非可培养状态

将大肠杆菌 O157:H7培养于低温贫养条件下 ,以涂布平板法 (PC)和最大近似值法(MPN)检测可培养细菌数 ,95～ 115d后表明可培养菌数下降为零。吖啶橙荧光显微镜直接计数法(AODC)检测细菌总数 ,表明细菌总数始终变化不大 ,而活菌直接镜检计数 (DVC)检测到的活菌数保持在 10 6个 / m L。实验证明了大肠杆菌 O157:H7在一定的条件下可进入活的非可培养状态(VBNC)。     

哈维氏弧菌浸泡感染下泥蚶(Tegillarca granosa)不同组织弧菌载量的变化规律分析

为明确哈维氏弧菌感染下,泥蚶（Tegillarca granosa）不同组织弧菌载量的变化规律,通过哈维氏弧菌浸泡感染泥蚶的方法,建立弧菌浓度计数标准曲线,记录攻毒水体和泥蚶组织中的哈维氏弧菌含量的动态变化及相关关系。结果显示,弧菌感染浓度为1×10⁷CFU/mL,泥蚶血液中弧菌载量显著高于鳃、闭壳肌、外套膜和肝胰腺,各组织中的弧菌载量呈现先上升,后下降,最后维持较低水平的变化规律。持续感染6 d,泥蚶血液中弧菌载量降至10²-10⁴ CFU/mL,其他组织中弧菌载量降至10⁰-10² CFU/mg。检测不同浓度弧菌（1×10⁵,1×10⁶,1×10⁷,5×10⁷ CFU/mL）浸泡感染后泥蚶肝胰腺的弧菌载量变化,结果显示,1 d时各感染组肝胰腺弧菌载量均较对照组显著增加（81.0-667.8倍）,且与浸泡水体中弧菌浓度呈显著正相关（Spearman''s ρ=0.762,P<0.001）,5 d时各侵染组肝胰腺弧菌载量均较1 d明显降低,但仍然高于对照组。研究结果为泥蚶感染弧菌发病过程中,免疫识别及免疫响应机制的研究提供了参考。     

间接酶联免疫吸附技术检测活的非 可培养状态的大肠杆菌O157：H7

大肠杆菌O157H7在低温贫营养的条件下可进 入活的非可培养状态（Viable but nonculturable state,VBNC），用常规的培养法无法将其检出。作者利用间接酶联免疫吸附技术（Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assa y, ELISA）检测VBNC的大肠杆菌O157H7，发现此方法可以快速有效地将其检出，最小检测 浓度为10     

霍乱弧菌的越冬方式—活的非可培养状态及其检测方法

霍乱弧菌是河口与海洋环境中自然微生物区系的成员。霍乱弧菌在诸如低温、低盐和低营养物浓度的不良环境条件下,可以变成非可培养状态。利用活菌直接镜检技术和免疫萤光抗体染色技术证明,霍乱弧菌是活的非可培养状态。实验还证明霍乱弧菌的越冬是通过活的非可培养状态实现的。     

活的非可培养状态溶藻胶弧菌复苏后的致病性及基因表达

溶藻胶弧菌广泛分布于海洋环境,是海洋生物及人类的条件性致病菌。溶藻胶弧菌在不良环境进入活的非可培养状态,当条件适宜时复苏为可培养形式。本文研究了溶藻胶弧菌由活的非可培养状态复苏为可培养状态时的生理特征及对斑马鱼的致病性,结果发现复苏为可培养状态的溶藻胶弧菌对紫外辐射、热激、冷激的抵抗力没有明显改变。用RT-PCR未检测到VBNC状态溶藻胶弧菌tox S和tox R基因的表达,而复苏后的细胞检测到这些基因的表达。复苏后的溶藻胶弧菌对斑马鱼的LD50为6.25×106CFU/尾,与野生菌株(LD50为4.80×106CFU/尾)没有显著差别。     

青蛤(Cyclina sinensis)溶菌酶基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达

利用构建的SMART cDNA文库和高通量测序方法,得到了青蛤溶菌酶相关基因的全长,采用荧光定量RT-PCR方法分析了c型溶菌酶基因在鳗弧菌刺激下的表达变化。结果表明,青蛤有c型溶菌酶和i型溶菌酶基因,分别编码155和182个氨基酸,c型溶菌酶信号肽为21个氨基酸并具有典型的LYZ1结构域,i型溶菌酶信号肽为19个氨基酸,其结构域为Destabilase domain结构,用于识别和切断谷氨酰胺-甲酰胺与赖氨酸ε-氨基之间的肽键。荧光定量PCR结果显示,在鳗弧菌刺激后6—24h,青蛤血细胞中c型溶菌酶的表达量出现明显上调的趋势,与对照组有显著性差异(P0.05),说明c型溶菌酶基因在青蛤的免疫应答中起重要的作用。     

副溶血弧菌trh基因的克隆、表达及基因缺失株的构建

利用PCR方法从VP基因组DNA中扩增出trh溶血素基因,构建了大肠杆菌原核表达载体,对trh进行了表达和纯化,经溶血活性检测,复性蛋白具有溶血活性.同时还构建了trh基因缺失株,对trh基因进行了基因敲除研究.结果表明,单独敲除trh基因并不能够影响菌株的溶血活性,说明副溶血弧菌还存在其它溶血素基因.     

石斑鱼及暂养环境中副溶血弧菌分离鉴定与毒力评价

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)存在于海洋环境和海产品中,可引起人的食物中毒。本研究的目的是对某地石斑鱼暂养环境的副溶血弧菌的致病风险进行评价。结合弧菌选择性培养基TCBS、gyr B基因和16Sr RNA特定片段的序列分析方法对分离菌株进行鉴定;通过PCR检测毒力基因,血琼脂平板溶血实验、细胞感染实验、KM鼠灌胃实验分别检测各菌株的致病性、溶血性、细胞毒性与肠毒性。共鉴定出4株具有毒力的副溶血弧菌,分别为HS51-5、HS54-4、MJ01-1和MJ03-1。所有菌株都检测到溶血素基因(tdh和tlh)、三型分泌系统(T3SS)基因簇1(T3SS-1)的4个效应蛋白基因(vop Q、vop R、vop S和vpa0450)、和基因簇2(T3SS-2)的1个效应蛋白基因(Vop A)的分布,同时在HS51-5和HS54-4还检测到T3SS-2中的其他3个效应蛋白基因(vop C、vop T和vop L)。所有菌株都具有溶血现象、细胞毒性以及对小鼠的致死能力,而HS54-4、MJ01-1、MJ03-1对小鼠的毒力明显强于HS51-5。因此,从毒力基因检测、神奈川溶血、细胞毒性和对小鼠的毒力等4个方面的结果都表明副溶血弧菌具有致病性,说明石斑鱼暂养环境的副溶血弧菌具有致病风险,应加强对这些环境的监测。     

Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控分析

为探讨分子伴侣Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控作用,本文分析了溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq突变株及回补株各项与毒力相关的生理生化指标。研究结果显示:在半固体和固体LBS平板中,缺失株游动和涌动能力显著降低(P0.001);hfq缺失株生物膜合成速度及合成量降低,但解离速度增加;在限铁环境下,缺失株生长有所减弱;缺失株胞外蛋白酶分泌增强(P0.01);同野生株和突变株相比,缺失株对小鼠成肌细胞系C2C12细胞几乎不致死,且其对石斑鱼的半数致死量提高3个数量级。实验结果表明:Hfq对溶藻弧菌毒力具有重要调控作用,并通过调控其运动、生物膜形成、铁代谢、胞外蛋白酶分泌等生理生化过程从而调控其毒力。本研究可为溶藻弧菌病害暴发的防治提供重要理论依据。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。     

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(RubisCO)(EC4.1.139)是光合细菌通过卡尔文循环固定二氧化碳的关键酶。本文采用PCR方法,从沼泽红假单胞菌株No.9中克隆到RubisCO基因(cbbM)序列(该序列已提交GenBank,登录号:GU061327)。采用同源建模法,建立了该RubisCO蛋白的三维结构模型,预测其活性位点。将cbbM基因亚克隆到表达载体pTV118N上,构建表达质粒pTV-CBBM,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株BL21(DE3)/pTV-CBBM,该菌株经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE检测。采用气相色谱法测定破菌上清中的RubisCO酶活。结果表明:①cbbM基因编码461个氨基酸,与沼泽红假单胞菌株DCP3和DH1的RubisCO蛋白序列相似性分别为98%和99%;②推测沼泽红假单胞菌No.9中RubisCO蛋白的活性中心由Asn112、Lys192、Asp194、Glu195、His288、Arg289、His322、Gly424、Ser369、Gly370和Gly394等氨基酸残基组成;③重组蛋白分子量约为50kDa左右,与预测相符;④破菌上清中的RubisCO酶比活高于原始菌株中的酶活,说明目的基因在大肠杆菌中得到了有效表达。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原霍乱弧菌(Vibrio cholerae)PCR 与LAMP检测方法的比较研究

采用分子生物学方法,以霍乱弧菌lolB为靶基因设计特异性引物,进行了霍乱弧菌的PCR和环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术研究,并对它们的特异性、灵敏性和实际应用进行了比较.结果表明,所建立的PCR检测霍乱弧菌的方法最低检测限为4.0× 103 CFU/ml; LAMP检测方法在65℃下恒温扩增60min,检测限为4.0×101 CFU/ml,反应产物加入荧光染料SYBR Green Ⅰ后反应液呈现明显的绿色;以温和气单胞菌、副溶血弧菌、鳗弧菌及美人鱼弧菌为对照菌株,检测结果均为阴性;霍乱弧菌人工染菌的8种水产品进行PCR及LAMP检测,结果均为阳性,而未染菌组均为阴性;PCR及LAMP检测霍乱弧菌的方法均具有灵敏度较高、特异性强等优点,且LAMP检测霍乱弧菌的方法灵敏度是PCR方法的100倍,更适合于养殖现场检测的推广使用.     

鳜(Siniperca chuatsi)生长激素基因克隆和原核表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鳜脑垂体总RNA中扩增生长激素(GH)成熟肽基因,将成熟生长激素的cDNA定向克隆到表达载体pET-32a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,鳜生长激素(GH)基因含开放阅读框(ORF)615个核苷酸,编码204个氨基酸,蛋白分子量为23kDa,等电点为7.07,其中酸性氨基酸占10.78%,碱性氨基酸占12.74%,疏水氨基酸为占44.12%,极性氨基酸占32.35%。在IPTG终浓度1.0mmol/L、温度37℃和培养时间4h的最佳诱导表达条件下,鳜生长激素基因(GH)在大肠杆菌中获得高效表达,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为43kDa的鳜生长激素与硫氧还蛋白(Thioredoxni,Trx)融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白58%。Western印迹分析也证实含6×His标签的重组融合蛋白能够很好地与抗6×His单抗发生反应。本研究为下一步鳜生长激素基因(GH)的生物学功能及应用奠定了基础。