豹纹鳃棘鲈病原鳗利斯顿氏菌的分离鉴定及生物学特性研究

从患病的豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)的肾脏中分离到1株优势菌33002,人工感染试验证实其对豹纹鳃棘鲈有较强的致病性;采用形态学观察、生理生化特性分析及16SrRNA和gyrB基因序列系统发育树分析对菌株33002进行鉴定。结果显示,菌株33002为革兰氏阴性弧菌,生化特性与利斯顿氏菌属的鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)相近,基于gyrB基因序列的系统发育分析,菌株33002与鳗利斯顿氏菌聚为一支。对48种抗生素的药敏结果显示,菌株33002对红霉素、阿奇霉素等25种药物敏感,对恩诺沙星、杆菌肽等22种药物不敏感。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)病原鳗利斯顿氏菌的鉴定

采用表观分类学及分子生物学方法,对从大菱鲆细菌性败血感染症的病(死)鱼中分离到的相应病原菌,进行了形态特征、理化特性等较系统的鉴定及代表菌株DNA中G Cmol%的测定;同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明,所检30株菌均为利斯顿氏菌属(ListonellaMacDonellandColwell1986)的鳗利斯顿氏菌[L·anguillarum(Bergeman1909)MacDonellandColwell1986],择S010610-1株、S010610-3株及S010623-1株作为代表菌株进行的16SrRNA基因序列测定,不包括引物结合区,所扩增的16SrRNA基因序列长度,S010610-1株为1466bp(GenBank登录号:AY963630)、S010610-3株为1416bp(GenBank登录号:AY963631)、S010623-1株为1424bp(GenBank登录号:AY963632),与GenBank数据库中弧菌属细菌的同源性在97%—99%。     

从患病黑鲪分离病原菌HV0811的鉴定及其系统发育分析

从症状为溃疡瞎眼的养殖黑鲪(Sebastodes fuscescens)病灶处分离到3株优势菌HV0811、PT0811和JH0811,以肌肉注射人工感染实验证实菌株HV0811为致病菌,其对黑鲪的半致死浓度为7.15×10~5 CFU/尾。通过对致病菌的形态学观察、生理生化分析表明:菌株HV0811为革兰氏阴性菌,极生单鞭毛,短杆状,直径1～3mm,需Na+生长,低于4℃、高于42℃不生长。基于16SrRNA和HSP60基因序列构建的系统发育树表明:HV0811分别与哈维氏弧菌(AY750578和AY332571)相类聚,其中16SrRNA基因序列与哈维氏弧菌(AY750578)聚合置信度较低,仅有10%,不能有效地确定该种;HSP60基因序列与哈维氏弧菌(AY332571)聚合为一个分支的置信度达100%。综合该菌的形态、生理生化及HSP60基因序列比对结果,表明分离到的病原菌HV0811为哈维氏弧菌。药敏试验结果显示病原哈维氏弧菌(HV0811)对庆大霉素、新霉素、氟哌酸等较为敏感。     

半滑舌鳎体表溃疡病病原的分离鉴定

为研究引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)体表溃疡病的病原,从发生体表溃疡的半滑舌鳎体表病灶、肝脏和肾脏上进行细菌分离,得到2株优势菌株051001和051002,采用腹腔注射进行回感实验,证实菌株051001和051002能够引起养殖半滑舌鳎发病死亡,该菌株为本次半滑舌鳎体表溃疡病的致病菌。经形态学观察和生理生化特性分析,初步判定菌株051001为鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)、菌株051002为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi);基于16SrRNA基因构建的系统发育树显示,菌株051002与哈维氏弧菌聚为一支,菌株051001与鱼肠道弧菌聚为一个分支;基于hsp60的基因序列分析表明051002与哈维氏弧菌(AY332570、AF230931)聚为一个分支,置信度为92%。对16种药物的敏感实验证实,菌株051001对利福平、庆大霉素、氟苯尼考等敏感,菌株051002对诺氟沙星、头孢曲松钠、庆大霉素敏感。     

海水工厂化养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定

从患腹水病大菱鲆和褐牙鲆成鱼体内分离到两株致病作用强的病原菌FS1和FS2,经人工感染实验表明菌株FS1和菌株FS2为腹水症的致病菌。采用常规的生理生化鉴定方法及梅里埃全自动微生物分析系统(VITEK32),结合分子生物学方法进行病原菌的鉴定。结果表明,菌株FS1和菌株FS2分别为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS116SrRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性达99%;菌株FS2的16SrRNA基因序列与溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均达99%。为最终确定菌株FS2的分类地位,测定了其HSP60基因序列,进行网上同源性比对。分析结果表明,菌株FS2与溶藻弧菌的同源性达99%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91%。这两种致病菌混合感染或分别感染均可造成养殖鲆鱼腹水病。     

一株副溶血弧菌qdfsVp001的分离与鉴定

用弧菌选择从牙鲆饲育水中分离出1株细菌qdfsVp001,对该菌在培养基上的菌落形态、生理生化特性及其16SrDNA基因序列进行研究,结果表明该菌在TCBS平板上呈现大的蓝绿色菌落,在弧菌显色培养基上呈现紫色菌落,其生理生化特性具有副溶血弧菌的典型特征。16SrD-NA基因序列及系统发育树分析表明,该菌与弧菌的亲缘关系最近,其中尤与副溶血弧菌最为相似。结合qdfsVp001的形态、生理生化及16SrDNA基因序列分析结果,确定该菌株是1株副溶血弧菌。     

4株长牡蛎(Crassostrea gigas)致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)鉴定及其毒力基因检测

为明确江苏连云港养殖长牡蛎大规模死亡病因,对分离自长牡蛎的4株病原菌开展了致病性、表型特征、分子特征等研究,结果表明4株病原菌均具致病性,4株病原菌ML1、ML2、ML3、ML4对长牡蛎的半数致死量LD50分别为2.8×105、1.1×105、1.8×105和1.6×105 CFU/mL;4株病原菌均为呈短杆状革兰氏阴性细菌,氧化酶阳性,还原硝酸盐,能利用甘露醇、纤维二糖,形态及理化特性结果表明4株分离菌与弧菌属的哈维氏弧菌亲缘关系最近;16SrRNA、gyrB、rpoA基因同源性检索及系统发育学分析结果表明4株分离菌与GenBank数据库中哈维氏弧菌的基因序列相似性最高且在系统发育树中聚为1个分支;根据4株分离菌的致病性、表型与分子特征,表明引起长牡蛎大规模死亡的病原为哈维氏弧菌。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,检测了分离鉴定的4株病原菌的9种毒力基因,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA和vhhB 4种毒力基因,扩增片段大小分别为679bp、390bp、1324bp和216bp,其他5种毒力基因未检测到,且分离鉴定的4株病原哈维氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈维氏弧菌的分子标记。     

半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为：头部、鳃盖及鳍基出血, 尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的 细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16 S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属（Listonella MacDonell and Colwell 1986）的鳗利斯顿氏菌\[Listonella anguillarum ( Bergeman 1909)MacDonell and Colwell 1986\]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248 bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

养殖大菱鲆烂鳍病病原菌的鉴定及系统发育学研究

从山东半岛3个养殖场各分离到一株大菱鲆烂鳍病的病原菌,均为革兰氏阴性,短杆状,极生鞭毛,有运动能力,菌落半透明。经常规生理生化特征测试和16SrRNA基因序列对比,表明它们都是同一种细菌。理化特征的结果显示这3株菌均与V．anguillarum的表性特征非常相似。对其16SrRNA基因序列进行分析,并构建了系统发育树,结果表明这些菌株与V．anguillarum亲缘关系最近。综合上述研究结果,将该菌鉴定为V．anguillarum.     

半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为:头部、鳃盖及鳍基出血,尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell 1986)的鳗利斯顿氏菌[Listonella anguillarum (Bergeman 1909) MacDonell and Colwell 1986]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

香鱼工厂化养殖及其耗氧率和窒息点试验

2 0 0 0年 2～ 3月放养 1 63 3 5尾香鱼 (Plecoglossusaltivelis)种苗 ,在水泥池内进行工厂化养殖研究 .结果表明 ,养殖存活率 85%,总产量 2 4t,平均单产 1 0kg/m2 ,饵料系数 1 .7.养殖主要病害为肠炎和烂鳃病 .体重 2 4.5～ 3 2 .5g ,个体平均耗氧率为(0 .2 98～ 0 .3 86)× 1 0 -3(m/m)h-1.窒息点 1 .95mg/dm3左右 .     

香鱼(Plecoglossus altivelis)致病性类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)的分离与生化药敏鉴定*

香鱼(Plecoglossus altivelis)是名贵洄游性鱼类,由于高密度养殖等因素导致病害频发。类志贺邻单胞菌广泛存在于养殖水环境中,给香鱼养殖业造成严重经济损失。对患体表溃疡病的香鱼进行病原分离和鉴定,从患病鱼体表和肠道组织中分离到一株优势菌(NH21),其菌落低突,边缘光滑,表面湿润。革兰氏染色结果显示NH21为革兰氏阴性菌,菌形态为短杆状,端圆。经生化特性和16S rDNA序列分析鉴定为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。回归感染后,香鱼呈现与发病鱼相似的症状,皮肤、肌肉溃烂并伴有周围皮肤充血,组织切片可观察到病鱼肌纤维断裂,周围红细胞、炎性细胞浸润;鳃丝和鳃小片中红细胞增多;肝细胞核呈空泡,部分细胞核染色质边集;脾脏内包细胞增多,红细胞呈梭形;肠黏膜上皮细胞脱落。经计算其半致死量LD50为1.99×10⁷ CFU/mL。25种抗生素的药敏试验显示NH21菌株对阿奇霉素、头孢氨苄、新生霉素、多粘菌素B、头孢西丁、呋喃唑酮6种抗生素敏感。检出NH21菌株毒力基因9个,耐药基因8个。综合分析表明,分离菌株NH21为类志贺邻单胞菌属,是本次香鱼体表溃烂病病原菌,研究结果为香鱼出现类似病症的预防和治疗提供了基础资料。     

养殖牙鲆鱼苗腹水症病原菌的鉴定及系统发育学分析

从患腹水症养殖牙鲆鱼苗分离到一株细菌B17，人工感染实验证实春具有致病性。用Biolog-GN细菌鉴定系统对B17进行测试，发现其与参考菌株的相似性较低，不能进行鉴定。常规生化测试表明，B17具有弧菌属的特征，其表型特征与Vibrio splendidus非常相似。为了进一步明确菌株B17的分类学地位，测定了其16SrRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发生树，结果表明菌株B17与V. splendidus的亲缘关系最近。综合上述结果，菌株B17可鉴定为V.splendidus。     

封闭循环养殖系统中驼背鲈和斜带石斑鱼生长的研究

研究闭合循环水养殖条件下驼背鲈(Cromileptes altivelis)和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的生长特性。经343d养殖，驼背鲈幼鱼平均体质量由24．16g增加到124．4g，平均日生长率为1．2％．体质量与养殖时间的关系式为M=32．674e^0.0048t，体质量与体长的关系式为M=0．0042L^3.6184；斜带石斑鱼幼鱼体质量由20．10g增加到490g，平均日生长率为6．8％，体质量与养殖时间的关系式为M=34．319e^0.0984t，体质量与体长的关系式为M=0．0656L^2.7102。     

香鱼(Plecoglossus altivelis) JNK1基因克隆及其在成熟卵过熟进程中的表达变化

c-Jun氨基端激酶(c-JunN-terminalkinases,JNKs)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)蛋白超家族成员之一,参与细胞骨架构建、细胞凋亡等多种细胞活动。本研究克隆了香鱼(Plecoglossusaltivelis)JNK1基因cDNA序列,并检测了其成熟卵在排入体腔保存不同时间(0—96h)的过熟过程中JNK1基因的表达变化。结果显示,香鱼JNK1基因cDNA序列全长1670bp,含一个长度1155bp的开放读码框,编码384个氨基酸,预测蛋白分子质量约44.2kDa、理论等电点6.61。氨基酸序列多重比对显示硬骨鱼类中JNK1氨基酸序列高度保守,香鱼与黄鳝的JNK1序列相似性最高(97.6%)。系统进化树分析显示各种脊椎动物的JNK1、JNK2、JNK3分别聚为一簇;本研究获得的香鱼JNK1位于JNK1大簇中并与黄鳝JNK1优先相聚,表明二者进化关系较近。RT-PCR检测结果显示健康香鱼JNK1基因在脑和性腺中高表达,肝和鳃中无表达。实时荧光定量PCR检测显示香鱼成熟卵JNK1基因的表达变化与卵的受精率、孵化率随保存时间延长而降低之间存在相关性:成熟卵随保存时间的延长JNK1表达量逐渐升高、在48h时达到峰值(24h、48h时的表达量分别为0h时的1.49倍和2.55倍),在此期间卵有较高的受精率和孵化率(48h时分别为88.99%和67.32%);保存时间继续延长时卵内JNK1基因都处于高表达水平,72h和96h时的表达量分别为0h时的2.32倍和1.53倍,而卵的质量也在保存超过48h后急剧下降(72h时受精率和孵化率分别为50.2%和25.54%)直至基本失去受精、孵化能力(96h时受精率和孵化率分别为10.83%和0.54%)。综上,香鱼JNK1基因表达上调与香鱼成熟卵的过熟凋亡过程密切相关,为深入研究香鱼JNK1基因的功能及卵过熟机制提供了基础资料。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)排卵后卵内油球、酶活、丙二醛及受精率、孵化率的变化

以香鱼卵母细胞为研究对象,采用观察卵内油球、有关酶的活力、以及卵的受精率和孵化率等变化的方法,研究了香鱼卵母细胞长时效演化的相关机理,结果表明,随着香鱼卵在腹腔内保存时间的延长,卵内油球从0h的油球直径≤10μm,且均匀分布,逐渐融合增大,至108h增大到120μm,油球数仅有5—6个。同时,SOD、POD的活力及MDA含量均呈先升后降的变化趋势,最大峰值分别出现在60h、36h和24h。随着油球和酶活的变化,卵子质量逐渐下降,表现为受精率和孵化率的降低:排卵后24h、48h、72h、96h的受精率分别为94.37%、88.19%、50.20%、10.83%,孵化率分别为85.78%、68.14%、25.54%、0.53%。     

一株水产益生菌的鉴定

鉴定1株分离自中国对虾养殖水体的益生菌XE-7。进行了常规生理生化和细菌鉴定系统测试,结果表明,菌株XE-7与烟草节杆菌属(Arthrobacter)细菌的表型特征非常相似。为了进一步确定XE-7的分类学地位,测定了其16SrRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树。结果表明,菌株XE-7与烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)的亲缘关系最近。综合上述结果,菌株XE-7可鉴定为烟草节杆菌(A.nicotianae)。     

Phylogenetic analysis of aerobic anoxygenic phototrophic bacteria and their relatives based on farnesyl pyrophosphate synthase gene

The study aims to reveal phylogenetic and evolutionary relationship between aerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AAnPB) and their relatives, anaerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AnAnPB) and nonphototrophic bacteria (NPB, which had high homology of 16S rDNA gene with AAnPB and fell into the same genus), and validate reliability and usefulness of farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) gene for the phylogenetic determination. FPPS genes with our modified primers and 16S rDNA genes with general primers, were amplified and sequenced or retrieved from GenBank database. In contrast to 16S rDNA gene phylogenetic tree, AAnPB were grouped into two clusters and one branch alone with no intermingling with NPB and AnAnPB in the tree constructed on FPPS. One branch of AAnPB, in both trees, was located closer to outgroup species than AnAnPB, which implicated that some AAnPB would be diverged earlier in FPPS evolutionary history than AnAnPB and NPB. Some AAnPB and NPB were closer located in both trees and this suggested that they were the closer relatives than AnAnPB. Combination codon usage in FPPS with phylogenetic analysis, the results indicates that FPPS gene and 16S rRNA gene have similar evolutionary pattern but the former seems to be more reliable and useful in determining the phylogenic and evolutionary relationship between AAnPB and their relatives. This is the first attempt to use a molecular marker beside 16S rRNA gene for studying the phylogeny of AAnPB, and the study may also be helpful in understanding the evolutionary relationship among phototrophic microbes and the trends of photosynthetic genes transfer.     

S7核糖体蛋白基因片段序列变异与花鲈属鱼类系统发育研究

对中国和日本海域花鲈属的3个种:花鲈(Lateolabrax maculatus)、鲈鱼(L. japoni-cus)和高体鲈(L. latus)的S7核糖体蛋白基因片段序列进行了扩增和序列测定,分析比较了3个种23个个体间的序列差异。在456bp的S7核糖体蛋白基因片段中,3个高体鲈个体中出现了3种单倍型,种内个体间有2个碱基差异;7个花鲈个体中出现了7种单倍型,种内个体间有21个碱基差异;13个鲈鱼个体中出现了12种单倍型,种内个体间有22个碱基差异。结果表明,花鲈属S7核糖体蛋白基因片段序列具有丰富的遗传信息,在亲缘关系较近的物种间也存在显著的序列差异,基于S7核糖体蛋白基因片段序列的NJ和ME系统树经1000次重复抽样检验后得到相似结果,表明S7基因内含子2是适合于研究分子系统发育的分子标记。利用Modeltest选取最佳核苷酸替代模型构建的NJ树表明:花鲈属鱼类由高体鲈分化,花鲈与鲈鱼的亲缘关系很近,而与高体鲈的亲缘关系较远。