解毒酶基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达

用RT－PCR克隆了酯酶B1 5′端B1（a）,并对其者了序列测定,将其与3′端B1（b）一起连接到pET-28a中,构了完整融合表达载体pET-ESTB1。转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下,经过12小时,酯酶B1在大肠杆菌内的融合表达达到27％。通过纯化获得1条带的重组蛋白,用粗酶对马拉硫磷的降解显示,该解毒酶在15分钟即降解22.1％,具有较高降解有机磷酸酯类农药的能力,为利用真核生物的自然资源进行农药污染的生物治理等提供了新途径。     

解毒酶基因在蓝藻中的克隆与表达

用抗性库蚊酯酶基因B1的cDNA片段插入质粒pRL-439中的强启动子之后,再与穿梭表达载体pDC-8相连构建成大肠杆菌蓝藻穿梭表达载体pDC-B1,然后通过三亲接合转移法将pDC-B1转入蓝藻Synechococcus sp. PCC7942中,经新霉素筛选获遗传稳定的转基因藻株;纯化单藻落在液体中扩大培养,提取蓝藻质粒,Southern杂交确证B1cDNA已转入受体细胞;用酯酶的特异性底物β-乙酸萘酯(β-NA)检测B1的表达,转基因藻对β-NA的降解明显高于野生藻,证明酯酶B1基因在转基因藻中得到表达。     

抗性库蚊酯酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用抗性库蚊酯酶基因,引入原核表达载体pRL439,转化大肠杆菌HB101细胞,获得表达。通过酶切、Southern杂交鉴定重组质粒。研究了重组菌酯酶的活性,重组质粒pRLB1表达的酯酶具有高酶活并能高效降解酯酶的特异性底物α乙酸萘酯(αNA)和β乙酸萘酯(βNA);经对重组菌进行细胞固定化后降解农药三氯杀虫酯(7504),反应时间短,降解效率高     

人可溶性APRIL(sAPRIL)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从GenBank中查找出人APRIL蛋白 (编号:075888)序列 ,取其部分胞外 (sAPRIL)序列设计引物 ,用RT PCR从扁桃体总RNA中扩增出人sAPRIL基因 ,经克隆测序后进行同源比较 ,证实所克隆的基因即为sAPRIL。克隆载体经酶切后构建了表达载体 ,并在大肠杆菌中表达 ,纯化蛋白后进行细胞学实验表明sAPRIL有明显刺激肿瘤细胞增殖的作用 ,为深入研究sAPRIL的功能奠定了基础     

人神经生长因子基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

神经生长因子(Nerve　Growth Factor,NGF)是最早发现的生长因子之一。它对中枢和周围神经元具有存活分化效应^[1]。NGF有可能治疗Alzheimers老年痴呆病、某些周围神经病变和脊髓损伤^[2]。NGF在人体组织中含量极微,已有报道从胎盘中纯化hNGF,但其组织来源极其有限,成本高,产量低．不能满足对hNGF的需求,所以如果能利用基因工程方法获得大量有生物学活性的hNGF制品,对其基础理论研究和临床应用具有深远的意义。我们根据已知序列设计合成一对引物,以人基因组DNA为模板,用PCR获得hNGF基因,并构建重组表达质粒．使rehNGF在大肠杆菌中获得表达,表达产物具有免疫学和生物学活性。     

合成血清胸腺因子基因在大肠杆菌中的克隆和表达

将合成血清胸腺因子（ＳＴＦ）基因插入表达型大肠杆菌质粒ｐＷＲ５９０对大肠杆菌Ｃ６００进行转化,用同位素探针杂交捡出阳性克隆,以合成ＳＴＦ多肽的抗体用ＥＬＩＳＡ方法及放射免疫分析证明克隆株能表达出ＳＴＦ多肽。     

TNF受体（P55）胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用,在原核表达系统中表达了TNFR（P55）的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR（P55）胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体pET-32a,在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达了TrxA-TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在,经过变性和复性,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L929细胞体外实验均表明：该蛋白具有TNFR（P55）特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的TNF生物学活性。     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

EXPRESSION OF THE DETOXIFYING GENE B1 IN ES‐CHERICHIA COLI AND SYNECHOCOCCUS1

Abstract We inserted the mosquito esterase B1 gene into the expression vector pRL‐439, which possesses the strong promoter PpsbA. The recombinant plasmid pRL‐Bl was used to transform E. coli HBlOl, and the positive clones were screened on LB medium plate containing 100 mg/mL ampicillin. The results of dot blotting and Southern hybridization demonstrated that these positive clones were transformed bacteria. Western blotting indicated that esterase B1 gene had been successfully expressed under the control of the PpsbA promoter in E. coli. A shuttle verruction‐B1 (pDGBl) was constructed by inserting B1‐cDNA from pRL‐Bl into polycloning site of plasmid pDc8. PDGBl was transferred into Synechoccus sp. PCC7942 through triparental conjugal transfer. Transformed single Synechococcus sp. PCC 7942 clone was obtained by neomycin screening, and large‐scale culture in liquid medium was carried out. Results of Southern blotting proved that pWB1 was transferred into Synechococcus sp. PCC 7942.     

里氏木霉纤维二糖酶bgl II基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL.     

里氏木霉纤维二糖酶bglII基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达*

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL。     

弱氧化醋杆菌阿拉伯糖醇脱氢酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

The partial genomic library of Acetobacter suboxydans was constructed using Yeast\| E.coli shuttle plasmid YEp352 as vector.Two positive transformants,designated as DH5α(pAD91) and DH5α(pAD98),were obtained by screening the growth of transformants on the agar plate in which D\|arabitol was used as the sole carbon source.The results of Southern blot and restriction endonuclease analysis showed that the two recombinants are identical.The insert is about 2.3kb.Arabitol dehydrogenase activity assay indic…     

三个与agropine合成相关的基因在大肠杆菌微细胞中的表达

pTiAch 5 TR区与在植物中积累agropine相关的三个基因片段已导入pINIIA或pACYC184,在大肠杆菌微细胞中表达出杂合蛋白。三个基因片段的pINIIA重组质粒的表达得到稳定蛋白、不稳定蛋白和在两个相表达出相似蛋白的三种结果。基因2'HindⅢ片段上的UGAA序列是在两个相表达相似蛋白的原因。从产生的杂合蛋白分子量和读码方式看,pTiAch 5中基因2'和基因1'的结构与pTi 15955近似,但由基因0'片段产生的杂合蛋白分子量比根据pTi15955 DNA序列数据推测的稍大。从表达强度和微细胞操作看,这个系统还不适应从大肠杆菌中方便地纯化杂合蛋白的需要。     

中国家蚕抗菌肽ABP-CM4在E.coli中的融合表达及活性分析

参照天然抗菌肽CM4(ABP-CM4)氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子,采用rPCR法获得CM4基因后重组到表达载体pET32a上,在E.coli中融合表达。表达产物以可溶性存在,经Ni2 -NTA琼脂糖亲和层析获得融合蛋白,再经甲酸切割、亲和层析和阳离子交换层析,得到纯化的重组抗菌肽。琼脂糖扩散法和液相测定法证明了纯化的抗菌肽具有抗菌活性。     

猪肥胖基因在大肠杆菌中的高效融合表达

采用PCR方法扩增猪肥胖基因编码原成熟蛋白cDNA序列,并在5′端加上BamHⅠ位点,3′端加上EoRⅠ位点,将5′端密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG,扩增得到459bp的片段,克隆于融合表达载体p GEX-2TBamHⅠ和EcoRⅠ位点,酶切、测序正确,经0．1mmol/LIPTG诱导表达出一条约42kD的融合蛋白,其中26kD为pGEX-2T中带有的谷胱苷肽转移酶,16kD是猪肥胖基因表达产物瘦蛋白。利用非融合表达产品制备抗血清,检测融合表达的重组蛋白,Western-blot为阳性。     

芝田硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶,即麦芽寡糖基海藻糖合酶（ ＭＴＳａｓｅ） 的基因,扩增的２－２ｋｂ ＤＮＡ 插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０ 中,构建成重组质粒ｐＳＢＧＴ１ 。ｐＳＢＧＴ１ 中ＭＴＳａｓｅ 基因在大肠杆菌中得到表达。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物ＭＴＳａｓｅ蛋白的分子量约为７４ｋＤａ ,同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约４－４ ％ 。ｐＳＢＧＴ１ 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物,使ＤＥ 值降低,得到非还原糖或低还原糖。     

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2的表达与lac启动子的关系

研究了不同碳源(葡萄糖、乳酸和乙酸)以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响,ctb基因位于lac启动子的下游。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。