水泡口炎病毒M蛋白对小鼠Lewis肺癌LL/2c细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的:水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)具有明显的抗肿瘤作用,在人的A549肿瘤模型和小鼠的LL/2c模型中已取得了明显的治疗效果.但复制完全型病毒在临床应用中存在着一定的安全隐患,且研究报道VSV抗肿瘤作用与其基质蛋白(matrix protein,M蛋白)有关.本研究旨在探讨VSV-M蛋白对小鼠的LL/2c肿瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法:采用分子克隆技术构建VSV-M蛋白重组真核表达质粒pcDNA3.1-M,经酶切、PCR、测序鉴定得到阳性重组子,体外转染LL/2c细胞,RT-PCR、Western blot检测M蛋白的表达.采用噻唑蓝(MTT)法检测了M蛋白质粒对LL/2c肿瘤细胞增殖的影响.DNALadder、Hoechst33528染色检测LL/2c肿瘤细胞凋亡.结果:构建了VSV-M蛋白真核表达质粒pcDNA3.1-M.重组质粒体外转染LL/2c细胞后,检测到M蛋白的表达;倒置显微镜下观察到细胞形态学的改变,且48 h后细胞生长抑制明显,抑制率达41.3%(P＜0.05),而空载体转染组只有6.5%的抑制率(P＞0.05).琼脂糖凝胶电泳可见DNA ladder形成,Hoechst 33528染色检测到LL/2c细胞凋亡,细胞核改变.结论:VSV-M蛋白可抑制小鼠LL/2c细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

脂质体介导入钠/碘同向转运体基因转染肺癌A549细胞及其蛋白表达

目的:研究人钠/碘同向转运体(NIS)基因转染肺癌细胞及其蛋白表达。方法:将体外培养的肺癌A549细胞分为实验组和对照两组:以脂质体Lipofectamihe2000为载体,分别介导转染重组质粒pcDNA3-hNIS和空质粒pcDNA3。NIS基因重组质粒pcDNA3-hNIS进行扩增、纯化,并经酶切鉴定和DNA测序。采用Western Blot法和免疫组化法分别检测转染肺癌细胞中NIS蛋白表达。结果:酶切鉴定和DNA测序结果表明重组质粒pcDNA3-hNIS中插入的hNIS基因片段大小、方向正确。WesternBlot法和免疫组化染色结果显示实验组有NIS蛋白表达,其阳性率达70.6%且主要分布于细胞膜而对照组无表达。两组比较有显著性差异(P=0.000)。结论:脂质体Lipofectamine 2000介导转染人钠/碘同向转运体基因pcDAN3-hNIS肺癌细胞能够成功地表达NIS蛋白。     

线粒体融合素基因-2对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的研究外源性线粒体融合素基因-2(mfn2)对乳腺癌细胞(MCF-7)凋亡的影响。方法在阳离子聚合物的介导下将含有mfn2 cDNA的质粒在体外转染MCF-7,蛋白印记法(Western blot)检测绿色荧光蛋白(GFP),MTT法检测mfn2对MCi-7细胞增殖的影响。采用Annexin-V/PI双标记法检测转染前后细胞凋亡的变化,JC-1标记细胞线粒体,在流式细胞仪上检测线粒体跨膜电位(△ψm)的变化,电镜观察超微结构的变化。结果转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP蛋白。MTT实验提示,转染mfn2 cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,转染mfn2 cDNA后48 h,△ψm下降。与转染pEGFlP组和空白对照组相比,转染pEGFP mfn2组明显促进凋亡,其凋亡率分别为:转染组16.0%,转染空质粒组3.6%,空白对照组4.8%(P<0.05)。电镜观察显示,mfn2使线粒体嵴断裂、消失、基质疏松,肿胀的线粒体围绕在核周呈密集排列。结论mfn2基因在体外转染MCF-7细胞,细胞线粒体膜电位降低,线粒体嵴断裂、消失,细胞凋亡明显增加。     

微小RNA-373靶向调控LATS2的表达及其对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-373（miR-373）靶向调控大肿瘤抑制因子2（LATS2）的表达及其对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测HepG2细胞及正常肝细胞LO2中miR-373的表达水平,采用Lipofectamine脂质体法将miR-373抑制剂及阴性对照转染至HepG2细胞并分为抑制剂组和对照组,采用QPCR法检测两组的miR-373水平以评价转染效果,MTT法和流式细胞术分别检测各组细胞的增殖及凋亡情况,Western blotting检测各组凋亡相关基因（Bax和caspase-3）及LATS2的表达情况,采用双荧光素酶报告实验验证miR-373与LATS2间的靶标关系。结果 与LO2细胞相比,HepG2细胞中miR-373的表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;转染后抑制剂组的miR-373水平低于对照组（P＜0.05）,提示抑制HepG2细胞miR 373表达成功;与对照组比较,抑制组的细胞增殖率降低,凋亡率及Bax、caspase-3和LATS2蛋白水平均升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;双荧光素酶报告基因实验表明miR-373可显著抑制野生型LATS2-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性,而对突变型LATS2-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论 miR-373可靶向调控LATS2的表达,且抑制miR-373表达可抑制HepG2细胞增殖并诱导凋亡,为肝癌的靶向治疗提供一定参考。     

线粒体融合素基因-2对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖与化疗敏感性的影响

背景与目的:线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,mfn2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,mfn2过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖.本研究探讨外源性mfn2对人乳腺癌细胞MCF-7增殖以及化疗敏感性的影响.方法:将含有mfn2 cDNA的质粒在阳离子聚合物的介导下体外转染MCF-7细胞,Western blot法检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,细胞计数及MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7细胞周期分布及喜树碱处理前后细胞凋亡的变化.结果:转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP.MTT实验提示转染mfn2 cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,DNA直方图显示细胞停滞于S期,转染mfn2 cDNA组S期细胞比率为(42.7±1.3)%,高于转染空质粒组的(17.2 2.0)%和空白对照组的(19.6±1.7)%(P＜0.05).mfn2基因转染后诱导的细胞凋亡率从(3.6±0.6)%升高到(16.0±0.3)%;加入喜树碱4 h后转染mfn2基因的细胞凋亡率为(69.6 4.3)%,高于转染空质粒组的(31.0±1.8)%和空白对照组的(23.4 2.8)%(P＜0.05).结论:转染mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,增强MCF-7细胞对喜树碱的敏感性.     

干扰NBS1表达抑制肝癌HepG2细胞增殖并促进凋亡

目的:探讨干扰NBS1基因表达对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。方法:应用Lipofectamine 2000将NBS1特异性小干扰RNA（siNBS1）转染至肝癌细胞HepG2中,以空载脂质体作为对照组。采用RT-PCR及Western blot法检测NBS1基因表达情况,采用CCK-8法检测转染质粒后siNBS1对HepG2细胞增殖能力的影响,采用流式细胞术检测siNBS1对HepG2细胞凋亡的影响。结果:不同浓度siNBS1（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L）均能抑制HepG2细胞中的NBS1基因在mRNA水平上的表达（P＜0.05或P＜0.01）。最高浓度siNBS1（50 nmol/L）能抑制NSB1蛋白产物的表达水平（P＜0.05）。CCK-8实验显示,转染不同浓度siNBS1的HepG2细胞与对照组相比,细胞活力明显减弱（P＜0.05或P＜0.01）,转染48 h后增殖率下降最为显著;流式细胞检测结果显示,细胞凋亡的比率在转染后明显升高（P＜0.05或P＜0.01）,并随浓度增加而更为显著。结论:干扰NBS1基因的表达可以明显抑制HepG2细胞的增殖,并促进癌细胞凋亡。     

水泡口炎病毒基质蛋白与细胞凋亡

水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)是弹状病毒科的原型病毒,为有包膜的负链RNA病毒.研究表明,它可以在肿瘤细胞中复制,可诱导肿瘤细胞凋亡,具有抗肿瘤的作用.同时,研究表明VSV病毒诱导细胞凋亡的作用与其基质蛋白(matrix protein)的作用是相关的,基质蛋白参与有全病毒相关的诸多作用,包括引起细胞病变、诱导细胞凋亡的作用.水泡口炎病毒基质蛋白诱导肿瘤细胞凋亡对于病毒在肿瘤生物治疗的研究具有重要意义,本文就水泡口炎病毒基质蛋白的研究近况进行综述.     

小RNA干扰降低COX-2表达对乳腺癌细胞趋化和侵袭能力的影响

目的探讨利用小RNA干扰技术降低COX-2表达对高度恶性乳腺癌MDA-MB-231细胞趋化和侵袭能力的影响。方法应用合成的小RNA干扰质粒转染MDA-MB-231细胞株,采用反转录－聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2 mRNA的表达。通过趋化运动实验检测细胞的运动能力;体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力。结果限制性内切酶的酶切结果和DNA测序结果显示成功构建了干扰质粒pSUPER-siCOX-2,转染后的细胞株分别命名为MDA-MB-231/pSUPER-basic（对照组）和MDA-MB-231/pSUPER-siCOX-2（实验组）。转染后48 h,与MDA-MB-231/pSUPER-basic细胞相比,MDA-MB-231/pSUPER-siCOX-2细胞的COX-2 mRNA表达水平下降(P<0.01);COX-2减低的乳腺癌细胞的趋化运动能力比对照组细胞降低(P<0.01);COX-2减低的乳腺癌细胞侵袭并穿透Matrivgel膜基质的细胞数量比对照组细胞少(P<0.01)。结论利用siRNA干扰技术降低COX-2表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞株的趋化和侵袭能力具有明显的抑制作用。     

降调ACSS2对非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡和迁移的影响

背景与目的：代谢水平的改变是肿瘤细胞生长的主要特征之一,有研究证实,乙酰辅酶A合成酶2(cytosolic acetyl-CoA synthetase 2,ACSS2)在肿瘤细胞的代谢中起着至关重要的作用。本研究拟通过RNA干扰技术抑制非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549细胞中ACSS2的表达,探讨ACSS2对A549细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法：设计并合成针对ACSS2的特异性干扰片段ACSS2-siRNA及与ACSS2没有同源性的阴性对照,瞬时转染NSCLC A549细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time lfuorescent quan-titative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测ACSS2 mRNA的表达情况,四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)实验检测转染组与对照组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果：通过转染体外合成的干扰片段ACSS2-siRNA,NSCLC A549细胞中ACSS2 mRNA呈显著低表达。ACSS2-siRNA干扰组的细胞较对照组增殖活性明显减弱,凋亡增加,迁移能力减弱。结论：降调ACSS2表达能显著抑制A549细胞增殖、迁移能力,促进凋亡尤其是早期凋亡明显增加。     

抑制Bcl-2基因表达增强非小细胞肺癌NCI-H460细胞放射敏感性的研究

背景与目的:Bcl-2基因是一种重要的抑制细胞凋亡的基因,广泛存在于各种肿瘤细胞中.本研究利用短发夹RNA(shRNA)重组质粒抑制Bcl-2基因的表达,观察其对非小细胞肺癌NCI-H460的细胞凋亡和放射敏感性变化的影响.方法:将特异性抑制Bcl-2基因表达的干扰质粒Bcl-2/shRNA稳定转染NCI-H460细胞,获得H460-RNAi细胞,同时设转染含无义序列Neg-shRNA质粒的H460-Neg细胞及未转染的H460细胞为对照组,采用Western blot法,观察Bcl-2基因在蛋白表达水平的变化;X射线照射后,采用细胞形态学及克隆形成实验,检测RNA干扰对NCI-H460细胞凋亡和放射敏感性的影响.结果:H460-RNAi细胞的Bcl-2蛋白表达较对照组明显降低(P<0.05);H460-RNAi细胞的凋亡率[(10.8±0.7)%]明显高于对照组(P<0.05),4 Gy X线照射48 h后的凋亡率[(24.9±1.4)%]明显高于对照组(P<0.05)及未照射组(P<0.05):H460-RNAi细胞的存活参数D0、Dq、N和SF2值分别为0.97、0.75、2.18和0.26,均低于其余两组,而H460细胞组与H460-Neg细胞组比较差异无统计学意义(分别为1.39、1.39、2.72、0.52和1.21、1.28、2.87、0.46).结论:Bcl-2/shRNA重组质粒可以有效抑制非小细胞肺癌NCI-H460细胞的Bcl-2基因的表达,增强NCI-H460的细胞凋亡及放射敏感性.     

人脑髓鞘碱性蛋白对H2O2诱导人肺癌细胞YTLMC-90凋亡的抑制作用

背景与目的：人脑髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）广泛分布于神经系统及多种非神经组织之中,而且在肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤细胞中均检查到MBP的表达。但MBP与癌细胞侵犯神经组织的活性是否相关、与肺癌细胞的生物学行为是否相关尚未见报道。本研究主要探讨MBP对过氧化氢（H2O2）诱导人肺癌细胞YTLMC-90凋亡的影响。方法：实验分为MBP cDNA微基因pSVCEPMBPCAT转染组（试验组）、空质粒pSVCEPCAT转染组和未转染组（对照组）。将含人1型胶原al链（COLⅠA1）基因启动子和增强子元件、并在其3’端接MBP cDNA的微基因,转染YTLMC-90细胞,并驱动MBP异位表达：采用MTT法检测细胞增殖,吖啶橙荧光染色显微镜和电镜观察细胞形态及其超微结构的改变;琼脂糖凝胶电泳检测染色质DNA断裂。结果：200μmol／L H2O2作用24h后、转染组、未转染组和空载体pSVCEPCAT转染组YTLMC-90细胞的生长抑制率分别为36．67％、84．00％和78．67％（P〈0．001）;对照组YTLMC-90细胞普遍可见凋产细胞特有的形态学及生物化学改变,如胞核固缩、染色质断裂,DNA电泳呈梯状条带;而MBP cDNA微基因转染的YTLMC-90细胞未发现上述凋亡特征。结论：MBP促进YTLMC-90细胞增殖和拮抗H2O2诱导的凋亡,明显减少H2O2对YTLMC-90的细胞毒作用。     

RNA干扰沉默ERK2基因体外诱导HepG2细胞凋亡的实验研究

目的：探讨RNA干扰技术对肝癌HepG2细胞ERK2基因表达的抑制作用及对HepG2细胞凋亡的作用.方法：实验分siRNA干扰质粒转染组、阴性质粒对照组和HepG2细胞空白对照组.应用DNA重组技术,制备针对ERK2基因的重组质粒pAAV-ERK2-siRNA-GFP,通过脂质体转染HepG2细胞.MTT细胞增殖实验,TUNEL法细胞凋亡染色及流式细胞仪凋亡细胞法检测体外诱导HepG2细胞凋亡的作用.结果：成功构建ERK2-siRNA重组质粒.MTT细胞增殖实验,TUNEL法细胞凋亡染色及流式细胞仪凋亡细胞检测法显示该重组质粒在体外能够有效抑制HepG2细胞生长,诱导HepG2细胞凋亡.结论：构建ERK2-siRNA重组质粒能抑制HepG2细胞增殖并诱导HepG2细胞凋亡,为肝癌治疗提供新思路.     

miR-125a表达对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响分析

目的 探讨microRNA-125a（miR-125a）对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测人肝癌HepG2细胞及人正常肝细胞7702中的miR-125a水平,同时采用真核表达载体pGenesil-1质粒制备过表达miR-125a的重组质粒pGenesil-miR-125a及表达随机序列的阴性对照pGenesil-NC,根据实验设计将HepG2细胞分为3组：空白对照组、阴性对照组和过表达组,其中空白对照组未进行转染,阴性对照组和过表达组分别成功转染pGenesil-NC和pGenesil-miR-125a,待3组转染24、48、72及96 h后采用qPCR法检测各组的miR-125a水平,噻唑盐比色法检测各组转染24、48、72及96 h的细胞增殖率,分别采用Hoechst染色和流式细胞术检测转染24、48 h后的凋亡指数和caspase-3活化率来评价凋亡情况,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组转染48 h后的细胞周期,同时采用免疫印迹法检测转染48 h后对凋亡相关基因（Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3）表达的影响。结果 HepG2细胞中miR-125a水平为（0.24±0.06）,低于正常肝细胞7702细胞（P<0.05）;与阴性表达组相比,过表达组转染24、48、72及96 h的miR-125a水平升高,增殖率降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与其余两组相比,过表达组转染后的凋亡指数、caspase-3活化率、G0/G1期细胞比例及Bax和Cleaved caspase-3水平均升高,S和G2/M期细胞比例及Bcl-2水平均降低,以上差异有统计学意义（P<0.05）。     

UHRF1高表达对膀胱癌细胞Keap-1/Nrf2通路的调控作用分析

目的探讨与分析泛素样含PHD和环指域1(UHRF1)高表达对膀胱癌细胞Keap-1/Nrf2通路的调控作用。方法分别用针对UHRF1的mimic及对照mimic转染膀胱癌细胞系UMUC3,标记为A组、B组,同时以PBS代替转染试剂的为C组。MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭,qRT-PCR检测mRNA表达,Western blot检测Keap-1/Nrf2通路蛋白表达。结果转染后48 h与72 h,与B组与C组相比,A组UHRF1 mRNA表达量显著增加(P<0.05)。转染后48 h与72 h,与B组与C组相比,A组的细胞增殖抑制率、凋亡率显著降低,细胞侵袭数目显著增加(P<0.05)。转染后48 h,与B组与C组相比,A组的Keap-1、Nrf2相对表达量显著增加(P<0.05)。结论UHRF1高表达能激活膀胱癌细胞Keap-1/Nrf2通路,从而促进细胞增殖与侵袭,抑制细胞凋亡。     

UBE2T基因通过调控ROS抑制结直肠癌细胞凋亡

目的:通过结肠癌细胞实验检测UBE2T对结肠癌细胞凋亡的影响。方法:细胞计数盒（CCK-8）法检测UBE2T基因转染对结肠癌细胞活力的影响；流式细胞仪检测UBE2T转染后对结肠癌细胞凋亡的影响；DCFDA染色流式细胞仪检测UBE2T转染对结肠癌细胞中ROS水平的影响；CCK-8法检测H2O2（增加ROS）对UBE2T基因转染降低结肠癌细胞活力的影响；流式细胞仪检测H2O2对UBE2T基因转染增加结肠癌细胞凋亡率的影响。结果:UBE2T转染能够明显增加结肠癌细胞活力（P＜0.05）；UBE2T基因转染抑制结肠癌细胞凋亡率（P＜0.05）；UBE2T转染减少结肠癌细胞ROS水平；预处理H2O2减弱UBE2T基因转染对结肠癌细胞活力的增加作用（P＜0.05）；预处理H2O2逆转UBE2T基因转染对结肠癌细胞凋亡率的抑制作用（P＜0.05）。结论:UBE2T基因转染能够抑制结肠癌凋亡，其机制是通过调节结直肠癌细胞中ROS水平。     

MINDY2过表达慢病毒质粒的构建及其对肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的:构建能表达MINDY2的慢病毒质粒,并获取稳定过表达MINDY2的A549细胞株,探讨过表达MINDY2对肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法:采用同源重组法构建pLVX-Flag-MINDY2过表达质粒,并通过菌落PCR和测序对重组质粒进行鉴定;在HEK293T细胞中瞬时转染pLVX-Flag-MINDY2质粒,通过Western blot实验检测Flag-MINDY2融合蛋白的表达;重组慢病毒载体包装HEK293T细胞,获取病毒上清液感染A549细胞,嘌呤霉素筛选后利用Western blot实验检测Flag-MINDY2融合蛋白的表达;CCK8实验、Transwell和划痕实验检测过表达MINDY2对A549细胞增殖和迁移能力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡及周期变化。结果:测序结果证明成功构建了MINDY2过表达慢病毒载体;在HEK293T细胞中瞬时转染MINDY2重组质粒,能检测到Flag-MINDY2融合蛋白的表达;Western blot结果显示MINDY2在A549细胞中稳定过表达;CCK8实验表明过表达MINDY2能够抑制A549细胞的增殖;流式细胞术表明...