精氨酸合成途径关键酶基因的过量表达及其对L-精氨酸合成的影响

由CarAB、ArgD、ArgJ三个基因分别编码的氨基甲酰磷酸合成酶、乙酰鸟氨酸转氨酶、鸟氨酸乙酰基转移酶是L-精氨酸合成途径的关键酶。以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为出发菌株,利用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌的穿梭质粒pEC-XK99E-p’、PEC-T18mob2,分别对精氨酸生物合成途径的关键酶基因CarAB、ArgD、ArgJ进行单个基因表达、对ArgD、ArgJ基因进行串联表达以及对CarAB、ArgD、ArgJ三个基因进行共表达,分别得到过量表达菌株14067-pEC-CarAB、14067-T18-ArgD、14067-T18-ArgJ、14067-T18-ArgDJ、14067-pEC-CarAB-T18-ArgDJ。检测上述三个基因单独表达,串联表达及共表达对L-精氨酸产量的影响。摇瓶发酵实验证明,这五株菌产精氨酸的能力较出发菌株ATCC14067分别提高了1.61、1.14、1.19、1.28、2.91倍。产量最高的共表达菌株14067-pEC-CarAB-T18-ArgDJ,通过实时荧光定量PCR检测,表明CarA、CarB、ArgD、ArgJ基因的表达量分别是ATCC14067的2.50、5.60、3.59、4.70倍。这表明过量表达基因CarAB、ArgD、ArgJ可以有效提高精氨酸的产量。     

谷氨酸棒杆菌苏氨酸脱氨酶基因敲除及对L-亮氨酸发酵的影响

L-异亮氨酸是L-亮氨酸发酵的主要副产物,L-异亮氨酸的积累对L-亮氨酸的发酵及提取均产生不利影响。采用基因重组技术敲除L-亮氨酸产生菌-谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TGL8207的苏氨酸脱氨酶基因ilvA,构建了ilvA缺失株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)TGL8207 ilvA。发酵结果显示:ilvA基因缺失对TGL8207 ilvA的生长影响很小。与供试菌比较,TGL8207 ilvA的L-亮氨酸产量和糖酸转化率分别提高了8.4%和1.9%。     

L-亮氨酸发酵工艺条件的研究

研究了能积累L-亮氨酸的黄色短杆菌TL0412的菌体生长规律，并讨论了葡萄糖、玉米浆以及蛋氨酸等几个主要的营养物质对其积累L-亮氨酸的影响，确定了较优的发酵备件，种龄36h，接种量为10％，在此条件下72h摇瓶产酸可达19．4％。在上述基础上，研究了不同温度、溶氧、pH值对菌株TL0412积累L-亮氨酸的影响，采用10L罐实验64h可积累29．47％亮氨酸。     

L-亮氨酸高产菌TGL8207的定向选育及其发酵过程研究

以谷氨酸棒杆菌TG95为出发菌株,通过原生质体紫外诱变、原生质体融合和硫酸二乙酯诱变,定向选育L-亮氨酸产生菌TGL8207.该菌株在未优化条件下摇瓶发酵72 h,产L-亮氨酸27.2 g/L,并且菌株的遗传标记和产酸能力十分稳定.研究了温度、pH和溶氧对菌株TGL8207积累L-亮氨酸的影响.采用10 L罐补料分批发酵64h,L-亮氨酸产量达44.5 g/L,糖酸转化率达22.8%.     

两种不同来源富马酸酶酶学性质比较

目前L-苹果酸已经工业化生产,但仍存在苹果酸产生菌株来源有限和产量不高等问题,为了拓展苹果酸产生菌的种类及酶活性,通过基因工程手段分别利用pETDuet-1为载体在宿主细胞Escherichia coli BL21 (DE3)中重组表达了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(E.coli)来源的富马酸酶,并对两者的酶学性质以及催化效率进行了比较.结果表明:两种来源的富马酸酶均构建成功,谷氨酸棒状杆菌来源的富马酸酶(fumCc)最适温度和pH分别为30℃和8.0,大肠杆菌来源的富马酸酶(fumCe)最适温度和pH分别为40℃和7.0;酶动力学分析表明,fumCc酶催化效率(Kcat/Km)是fumCe的3.8倍.0.1g菌体细胞在10 mL转化体系中催化1.5 g富马酸钠,在各自的最适条件下反应6h,L-苹果酸的产率分别为85％和34％.     

基因敲除降低L-缬氨酸发酵中亮氨酸和异亮氨酸含量的研究

黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)是L-缬氨酸生产的重要菌株,但缬氨酸发酵中常出现亮氨酸、异亮氨酸含量超标的问题.本研究敲除编码黄色短杆菌亮氨酸和异亮氨酸合成的关键基因,自主构建得到了工程菌株MH-1000-△ilvA、MH-1000-△leuA和MH-1000-△ilvA△leuA.对这些工程菌株进行摇瓶发酵和50 L罐发酵,结果表明,工程菌株有效地降低了L-缬氨酸发酵液中L-亮氨酸和L-异亮氨酸的含量,对于缬氨酸的高纯度生产具有一定的实际意义.     

原生质体融合选育L-亮氨酸高产菌的研究

以黄色短杆菌TQ5 35 1(Met- +Ile- + 2 TAr+SGr)和TQ5 35 6(Met- +Ile- +α ABr+ β HLr)为亲株 ,采用原生质体融合技术 ,定向选育出一株L 亮氨酸高产菌TQ980 6(Met- +IleL + 2 TAr+SGr+α ABr+ β HLr) ,该菌株经 5L罐分批发酵 64h产L 亮氨酸2 2 7g/L。     

全局调控因子Lrp的表达强化谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸

作者研究发现全局调控因子Lrp的表达能促进谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸,但对菌体生长有一定影响。RT-PCR分析发现:Lrp的表达能提高L-缬氨酸合成相关基因ilv A、ilv BN、ilv C、ilv D及转运相关基因brn FE的转录水平,这也许是L-缬氨酸产量提高的原因。实验还发现:表达含有点突变(Arg39Trp)的Lrp可以进一步提高谷氨酸棒状杆菌L-缬氨酸的产量,而且对菌体生长的影响也减小;这种效果在lrp-brn F间隔区域存在突变的L-缬氨酸生产菌VWB-1中更加明显。在VWB-1中共表达lrp1和brn FE基因,5 L罐发酵L-缬氨酸产量达到42.1 g/L,比对照提高了48.9%。     

苯丙氨酸生物合成关键酶基因pheA与aroF协同表达

目的:优化L-苯丙氨酸生物合成通路上的关键酶基因pheA、aroF的蛋白表达,构建高产L-苯丙氨酸的工程菌株。方法:通过设计酶基因的间隔调控序列,分别构建重组质粒pZE12-RBS-AF和pZE12-AF,SDS-PAGE观察蛋白表达量,转入营养缺陷菌MGΔ中构建工程菌,并发酵培养。结果:工程菌MGΔpZE12-AF苯丙氨酸的产量比工程菌MGΔpZE12-RBS-AF高1倍,实现了L-苯丙氨酸生物合成关键酶基因pheA和aroF协同,匹配表达。结论:调整串联酶基因之间的间隔调控序列可实现苯丙氨酸合成酶基因的协同表达,提供了一种新的提高苯丙氨酸工程菌产量的方法。      

苯丙氨酸生物合成关键酶基因pheA与aroF协同表达

目的:优化L-苯丙氨酸生物合成通路上的关键酶基因pheA、aroF的蛋白表达,构建高产L-苯丙氨酸的工程菌株。方法:通过设计酶基因的间隔调控序列,分别构建重组质粒pZE12-RBS-AF和pZE12-AF,SDS-PAGE观察蛋白表达量,转入营养缺陷菌MGΔ中构建工程菌,并发酵培养。结果:工程菌MGΔpZE12-AF苯丙氨酸的产量比工程菌MGΔpZE12-RBS-AF高1倍,实现了L-苯丙氨酸生物合成关键酶基因pheA和aroF协同,匹配表达。结论:调整串联酶基因之间的间隔调控序列可实现苯丙氨酸合成酶基因的协同表达,提供了一种新的提高苯丙氨酸工程菌产量的方法。     

酵母菌合成酯类化合物关键酶基因的研究进展

酯类化合物是发酵食品的重要香气成分之一,酵母发酵是酯类化合物产生的主要来源。在分析酵母菌酯类生物合成途径的基础上,对合成途径中的关键酶基因,包括脂肪酶/酯酶基因、醇酰基转移酶基因和醇脱氢酶基因及其酶作用进展作了综述。     

鲜切果蔬酶促褐变关键酶的研究进展

新鲜果蔬经过切割处理后,产生的机械伤害会刺激诱导表面组织发生酶促褐变反应,而使鲜切产品的感官品质下降、货架期显著缩短。鲜切果蔬的外观色泽变化主要是由酶促褐变引起的,起主要作用的关键酶有:多酚氧化酶(PPO),过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等。本文就近几年有关鲜切果蔬酶促褐变发生中一些关键酶的作用机理进行了综述,为鲜切果蔬酶促褐变的控制和质量保持提供理论参考。      

谷氨酸棒杆菌生产L赖氨酸的培养优化和产酸特性研究

在5L发酵罐中利用优化培养基进行了谷氨酸棒杆菌连续培养生产L-赖氨酸的研究。相同发酵条件下,优化培养基和原始培养基中的菌种生物量分别达到8.0g/L和9.3g/L,最快生长速率分别为0.53g/L/h和0.72g/L/h。发酵48h后,优化培养基中的L-赖氨酸浓度、产酸总量和糖酸转化率分别为20.8g/100mL、588.2g和0.713g酸/g糖,和原始培养基相比分别提高了6.1%、2.3%和12.2%。优化培养基显著降低了L-赖氨酸生产的原料消耗,提高了生产效率。      

谷氨酸棒杆菌3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶基因的克隆与过量表达

本实验对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) AS10111及其亚硝基胍诱变获得的丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型、抗3- 甲基色氨酸突变菌株JLC1 中3- 脱氧- α- 阿拉伯庚酮糖酸-7 磷酸合成酶(DS)基因进行克隆和序列分析,将突变体来源DS 基因构建pZ8-1-DSM 重组质粒,在谷氨酸棒杆菌突变株JLC1 中进行表达,重组菌株JLC1(pZ8-1-DSM)DS 酶活力分别是宿主菌和野生型菌株DS 酶活力的5.9 和7.3 倍,色氨酸产量达到14.90g/L,较宿主菌提高了65%。这表明通过在谷氨酸棒杆菌中过量表达3- 脱氧- α- 阿拉伯庚酮糖酸-7 磷酸合成酶基因可以有效提高该酶活力和色氨酸的产量。     

枯草芽孢杆菌胺氧化酶基因的克隆与表达

以细菌型豆豉工业发酵菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2为材料,根据NCBI中菌株B. subtilis 168的胺氧化酶（AMO）基因序列设计同源引物,克隆获得菌株B. subtilis BJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。测序结果显示,YobN基因开放阅读框（ORF）长为1 437 bp,编码478个氨基酸,分子质量为53.79 ku,与菌株B. subtilis 168同源性达98%。目的基因克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-YobN/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,浓度为1.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）22 ℃诱导5 h,表达量最高达1.30 mg/mL。该研究为AMO活性的研究奠定了基础,对豆类发酵食品中生物胺的控制具有重要意义。     

制备L-亮氨酸螯合钙的新工艺及其生物利用度的研究

采用单因子静态实验,考察了温度、NaOH和亮氨酸的摩尔比、L-亮氨酸浓度、树脂量对利用离子交换法制备L-亮氨酸螯合钙新工艺的影响,并测定了25℃下的离子交换动力学曲线。结果表明:交换可在室温下进行;NaOH与亮氨酸适宜的摩尔比1:1～1.3:1;L-亮氨酸浓度应控制在0.3 mol/L以下;适宜的树脂用量应满足树脂中钙与溶液中亮氨酸的摩尔比1:2;交换平衡时间为15 min。根据最佳工艺条件设计制备L-亮氨酸螯合钙的新工艺流程。采用小鼠对L-亮氨酸螯合钙和葡萄糖酸钙进行药动学和药效学实验对比,结果表明:L-亮氨酸钙的生物利用度比葡萄糖酸钙要高,其相对生物利用度是葡萄糖酸钙的175.3%,并具有缓释、药效时间长、不需要消耗胃酸等特点;L-亮氨酸螯合钙能显著性增加大鼠股骨重量,饲料中添加兼有促进小鼠体重增长的作用。     

谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢阻断工程菌的构建

采用反向代谢工程的策略,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032野生型为出发菌株,利用无抗性标记的同源重组方法,敲除了编码葡萄糖pts系统关键转运蛋白基因ptsG、ptsH-ptsI和葡萄糖转运系统关键转运蛋白基因abc、abc2和iolt1,得到了5株逐次敲除了相应基因的突变株。结果表明:当以葡萄糖为唯一碳源培养时,CGΔptsG菌株的葡萄糖的消耗是野生型的50%,菌体OD值为1.473;CGΔptsH-ptsI菌株的葡萄糖的消耗是野生型的39.5%,菌体OD值为1.226;CGΔabc菌株的葡萄糖的消耗是野生型的36%,菌体OD值为1.092;CGΔabc2菌株的葡萄糖的消耗是野生型的26.2%,菌体OD值为0.486;CGΔiolt1葡萄糖的消耗和菌体生长OD值为0,实现了谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢的阻断,说明ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1所编码的转运蛋白具有葡萄糖转运功能。     

谷氨酸棒杆菌的氨基酸输送系统的存在、功能及其在氨基酸生产上的重要性

主要介绍了谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中各种氨基酸输送系统及其基因、底物、特性和在氨基酸生产上的应用.