三倍体牡蛎性腺发育的组织学研究

报道了三倍体牡蛎性腺发育的组织学研究结果。三倍体牡蛎性腺发育与二倍体同步,可分为增殖期,生长期,成熟期,排放期和休止期,但产生的成熟雌,雄配子数明显少于二倍体。实验中所发现的染色体条数不足３０条的非整倍体个体,没有成熟配子形成。雌,雄同体现象普遍存在于三倍体中,雌,雄配子可产生同一滤泡内,也可产生于不同滤泡。生殖细胞由生殖嵴形成。     

杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系的建立及应用

为研究杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus的形成机制,探寻其产业化生产的有效途径,通过对GISH的多项试验参数进行优化,建立杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系,并对天然四倍体泥鳅(4n=100)与大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus(2n=48)正、反杂交后代进行GISH分析。结果表明:杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系中,探针DNA在温度为105℃、持续时间为2 min时,片段化后探针DNA片段长度为500¹000 bp;封阻DNA在温度为110℃、持续时间为10 min时,片段长度为1001000 bp;封阻DNA在温度为110℃、持续时间为10 min时,片段长度为100⁵00bp;标记后的探针DNA与片段化后的封阻DNA混合比(P/B)在1∶25和1∶50时均可以得到较好的杂交信号;以大鳞副泥鳅全基因组DNA为探针DNA、天然四倍体泥鳅全基因组DNA为封阻DNA,与二者正、反交后代进行基因组原位杂交试验,结果显示,来源于亲本大鳞副泥鳅24条染色体在着丝点处均有杂交信号,无杂交信号染色体50条,来源于亲本泥鳅。该研究结果不仅为杂交三倍体泥鳅后代的鉴定提供了最直观的证据,也为中国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体并能产生2n的配子提供了分子细胞遗传学基础数据,对泥鳅三倍体育种研究具有一定的指导意义。     

利用天然四倍体泥鳅生产全三倍体泥鳅的初步研究

2008～2009年利用从湖北省引进的天然四倍体(雄)泥鳅与当地的二倍体(雌)泥鳅杂交,进行全三倍体泥鳅培育的初步研究。结果表明,杂交组(2n×4n)平均受精率、孵化率、成活率分别为54.69%、80.64%、56.64%;对照组(2n×2n)分别为76.23%、82.97%、79.44%。早期胚胎染色体倍性鉴定结果表明,杂交组后代染色体数为71~75条,视为100%三倍体。6月龄时对其杂交后代进行流式细胞仪检测,均为100%三倍体。研究结果表明,利用湖北省洪湖市四倍体泥鳅与当地的二倍体泥鳅杂交能产生100%全三倍体泥鳅,这种生物杂交的方法操作简单、方法可靠,是生产全三倍体泥鳅的最佳途径。     

杂交三倍体泥鳅×二倍体泥鳅杂交后代胚胎染色体组构成的研究

为探讨杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus配子染色体组的构成,以杂交三倍体泥鳅(3n)与二倍体泥鳅(2n)为研究对象,配制2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交组合,对杂交后代的胚胎染色体进行银染(Ag-NORs)、CMA_3/DA/DAPI三重荧光染色和染色体荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)等方面的研究。结果表明:两个杂交组合的杂交后代胚胎染色体有丝分裂中期分裂相中最高银染点数均为3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;在2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交后代胚胎染色体有丝分裂中CMA3阳性部位有3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;将核糖体5.8S+28S r DNA定位在杂交后代胚胎染色体上,两种杂交组合均可检测到3簇杂交信号,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域。研究表明,杂交三倍体泥鳅无论雌雄与二倍体泥鳅杂交所产生的后代染色体组构成均为3套染色体组,进而可推测,杂交三倍体泥鳅无论雌雄均可产生(1.5~2)n的配子,该结果为三倍体泥鳅配子染色体组成提供了细胞遗传学证据。     

杂交三倍体(4n♀×2n♂)泥鳅染色体组核型多态性研究

以杂交三倍体泥鳅(4n♀×2n♂)为研究对象,初步分析对不同发育阶段(胚胎、六月龄及十二月龄)染色体核型。结果表明,胚胎阶段整三倍体(3n=75)染色体数目为3n=75,核型公式:14M+9SM+52T,NF=98;亚三倍体(3n75)染色体数目为3n=73,核型公式:13 M+6 SM+54 T,NF=92;超三倍体(3n75)染色体数目为3n=77,核型公式:18 M+7 SM+52 T,NF=102。六月龄阶段整三倍体染色体数目为3n=75,核型公式:15 M+5 SM+55 T,NF=95;亚三倍体染色体数目为3n=73,核型公式:13M+6SM+54T,NF=92;超三倍体染色体数目为3n=76,核型公式:14 M+6 SM+56 T,NF=96。十二月龄阶段整三倍体染色体数目为3n=75,核型公式:16 M+6 SM+53T,NF=97;亚三倍体的染色体数目为3n=72,核型公式:13M+6SM+53T,NF=91;超三倍体的染色体数目为3n=77,核型公式:13M+6SM+58T,NF=96。研究表明,杂交三倍体(4n♀×2n♂)泥鳅不同发育阶段染色体核型整倍体及非整倍体均表现出多态性。结论为杂交三倍体泥鳅染色体组不稳定性研究提供细胞遗传学依据。     

杂交三倍体泥鳅×二倍体泥鳅杂交后代胚胎染色体组构成的研究

为探讨杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus配子染色体组的构成,以杂交三倍体泥鳅(3n)与二倍体泥鳅(2n)为研究对象,配制2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交组合,对杂交后代的胚胎染色体进行银染(Ag-NORs)、CMA_3/DA/DAPI三重荧光染色和染色体荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)等方面的研究。结果表明:两个杂交组合的杂交后代胚胎染色体有丝分裂中期分裂相中最高银染点数均为3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;在2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交后代胚胎染色体有丝分裂中CMA3阳性部位有3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;将核糖体5.8S+28S r DNA定位在杂交后代胚胎染色体上,两种杂交组合均可检测到3簇杂交信号,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域。研究表明,杂交三倍体泥鳅无论雌雄与二倍体泥鳅杂交所产生的后代染色体组构成均为3套染色体组,进而可推测,杂交三倍体泥鳅无论雌雄均可产生(1.5²)n的配子,该结果为三倍体泥鳅配子染色体组成提供了细胞遗传学证据。     

两种泥鳅杂交及人工诱导大鳞副泥鳅雄核发育的染色体变化

当泥鳅自交时，其后代染色体数为2n＝100；如果泥鳅卵子与大鳞副泥鳅精子授精，其染色体来源于两种泥鳅，染色体数为2n＝74，未发现有染色体丢失现象。当泥鳅卵子经紫外线辐射后与大鳞副泥鳅精子授精，如果不进行二倍化处理，86％的胚胎染色体完全来源于父本大鳞副泥鳅，为雄核发育单倍体n＝24，经过二倍化处理后所获得的二倍体为大鳞副泥鳅雄核发育纯合二倍体，染色体数为2n＝48。     

团头鲂倍间杂交三倍体性腺发育的多态性观察初报

于5月份团头鲂正常繁殖期前夕,以初次性成熟(二足龄)二倍体团头鲂为对照样本, 同龄同池培育的同源倍间正交三倍体、同源倍间反交三倍体、异源倍间杂交三倍体为实验样本,分别取性腺,石蜡切片,镜检发育状况.发现团头鲂三倍体的性腺可归纳为三种情况:(1)性腺发育程度很低,表现为雄性二足龄三倍体的性腺外观细小,生殖细胞处于精原细胞水平.(2)性腺发育出现异常,表现在性腺外观畸形,有卵巢单侧不发育,有精巢大部分为细线,局部增粗等情况,还有发现外观无异常,但切片观察为雌雄嵌合体.(3)性腺发育无异常,表现为性腺外观没有异常,切片观察也能观察到各期典型的生殖细胞.     

团头鲂倍间杂交三倍体性腺发育的多态性观察初报

于5月份团头鲂正常繁殖期前夕,以初次性成熟(二足龄)二倍体团头鲂为对照样本, 同龄同池培育的同源倍间正交三倍体、同源倍间反交三倍体、异源倍间杂交三倍体为实验样本,分别取性腺,石蜡切片,镜检发育状况.发现团头鲂三倍体的性腺可归纳为三种情况:(1)性腺发育程度很低,表现为雄性二足龄三倍体的性腺外观细小,生殖细胞处于精原细胞水平.(2)性腺发育出现异常,表现在性腺外观畸形,有卵巢单侧不发育,有精巢大部分为细线,局部增粗等情况,还有发现外观无异常,但切片观察为雌雄嵌合体.(3)性腺发育无异常,表现为性腺外观没有异常,切片观察也能观察到各期典型的生殖细胞.     

不同倍性泥鳅杂交后代染色体数目组成的研究

以泥鳅 Misgurnus anguillicaudatus 为研究对象,通过染色体计数法,对二倍体泥鳅与天然四倍体泥鳅正交(2n×4n)、反交(4n×2n)杂交后代的早期胚胎、6月龄及12月龄阶段的染色体数目进行了统计分析.结果表明:早期胚胎正、反杂交后代的染色体数目为67～81、67～82,在良好的中期分裂相(100、100个)中,染色体数目为75的整三倍体众数百分比最高(22％,20％),此外还有大量染色体数目＜75的亚三倍体(37％,51％)和染色体数目＞75的超三倍体(41％,29％);6月龄正、反杂交后代的染色体数目为68～79、66～80,在良好的中期分裂相(58、63个)中,整三倍体(3n=75)众数百分比最高(26％,41％),此外还有大量亚三倍体(34％,49％)和超三倍体(40％,10％);12月龄正、反杂交后代的染色体数目为68～82、69 ～83,在良好的中期分裂相(71、50个)中,三倍体(3n=75)众数百分比最高(28％,54％),此外还有大量亚三倍体(48％,20％)和超三倍体(24％,26％).研究表明,二倍体泥鳅与天然四倍体泥鳅正、反杂交后代均出现大量能存活的非整三倍体个体,并随养殖时间的延长,非整三倍体率呈下降趋势.     

泥鳅cyp19a1基因克隆及其在倍性间的表达差异

克隆并分析泥鳅cyp19a1a的全长cDNA和5′侧翼序列,用qRT-PCR技术比较cyp19a1a在二倍体、四倍体泥鳅组织间和倍性间的表达差异。结果发现,泥鳅cyp19a1a的cDNA全长1 905 bp,包括29 bp的5′TR、301 bp的3′UTR和1 575 bp的ORF序列,其氨基酸序列中存在I-螺旋区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区等重要功能域。用hiTAIL-PCR克隆获得2 040 bp的5′侧翼序列,在该序列上预测到典型元件TATA-box,以及C/EBPβ、SRY、ER、CREB、GR等转录因子结合位点。12月龄四倍体泥鳅的体长、体质量均显著高于二倍体,但性腺发育明显滞后于二倍体。cyp19a1a和cyp19a1b分别在二倍体、四倍体泥鳅的性腺和脑中的表达量最高。倍性间比较结果显示,cyp19a1a在四倍体各组织中的表达均高于二倍体(除精巢外);cyp19a1b在四倍体雌鳅脑中的表达量显著高于二倍体,但在四倍体雄鳅脑中的表达量显著低于二倍体。综合分析上述结果,四倍体中相对较高的cyp19a1a表达可能与其性腺所处发育时期有关,较晚的性成熟有利于泥鳅将更多能量...     

Microsatellite Analysis of Genetic Diversity Between Loach with Different Levels of Ploidy

We used microsatellite markers to investigate the genetic parameters of three different polyploidy populations of Misgurnus anguillicaudatus from Honghu City, Hubei Province. Polyacrylamide gel electrophoresis banding patterns of diploid（2n）, triploid（3n） and tetraploid loaches（4n） were analyzed with Pop Gen software. A total of 68 alleles were obtained from seven microsatellite loci and the polymorphism information content（PIC） indices were all above 0.5. The average expected mean heterozygosity values（He） were 0.8420, 0.7186 and 0.8521; the average observed mean heterozygosity values（Ho） were 0.9674, 0.9785 and 0.8928; and the HardyWeinberg P values were 0.3078, 0.3151 and 0.3762, for diploid, triploid and tetraploid individuals, respectively. The results indicated that the three populations were highly polymorphic, with no deviations from Hardy-Weinberg equilibrium observed at all the seven microsatellite loci. This indicated a high level of genetic diversity within the populations. A cluster analysis diagram showed that the shortest genetic distance was between diploid and tetraploid loaches and they shared a close phylogenetic relationship. The triploid and tetraploid individuals had the most distant phylogenetic relationship.     

斑马鱼CYP11a1基因在不同性腺发育时期的表达

采用实时荧光定量PCR技术,分析了斑马鱼Danio rerio的CYP11a1基因在成鱼4个组织和性腺发育3个时期的表达情况。结果表明:CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和脑组织中均有表达且存在差异,在脑中表达量最低(P0.05),在卵巢、精巢、肌肉中的表达量分别为脑中表达量的204.7倍、38.9倍、17.0倍;CYP11a1基因在3个卵巢发育时期的表达量表现为先降低后升高的趋势,其在卵巢成熟期的表达量最低(P0.05),在卵巢成熟前期、卵巢成熟后期的表达量分别为卵巢成熟期表达量的1.7倍、1.5倍;CYP11a1基因在3个精巢发育时期的表达量表现为先升高后降低的趋势,在精巢成熟期表达量最高(P0.05),分别为精巢成熟前期、精巢成熟后期表达量的6.5倍、13.4倍。研究表明,尽管CYP11a1基因在卵巢和精巢发育过程中的表达规律不同,但CYP11a1基因在一定程度上与斑马鱼的性腺发育相关,其可能在促进斑马鱼精子成熟中发挥一定作用。     

雌激素受体基因对泥鳅雌雄和倍性生长差异的表达调控作用

为探讨雌激素受体基因与鱼类雌雄及倍性生长差异之间的相关性,选取雌性生长快于雄性、且四倍体生长快于二倍体的泥鳅为研究对象,首先克隆泥鳅雌激素受体基因,获得ERα（1 821 bp）、ERβ1（1 008 bp）和ERβ2（1 197 bp）的cDNA序列,氨基酸序列比对发现泥鳅ERs分别与鲤科鱼类相应亚型具有较高的同源性。采用qRT-PCR检测ER基因在二倍体泥鳅性成熟前后5个关键时期的表达情况及二倍体、四倍体相关组织间的差异表达。结果显示,3个基因在雌雄个体性成熟前后脑、肌肉、肝脏和性腺组织中均存在差异表达,其中ERα 在泥鳅雄性个体脑、肌肉和性腺组织中的表达量显著高于雌性（P<0.05）,而在雌性肝脏组织中的表达量普遍高于雄性（P<0.05）;ERβ1和ERβ2在精巢组织中的表达量一直处于较高水平。泥鳅倍性间的比较结果显示,3个ER基因在泥鳅二倍体脑组织中的表达量显著高于四倍体的表达量,且雄性的表达量均高于雌性,其中〖JP2〗ERα表达差异最为显著。本研究结果表明,无论是针对倍性生长差异还是雌雄生长差异,ERα均表现为在生长较慢（二倍体、雄性）个体脑组织中有相对高表达,推测脑组织中ERα 基因对鱼类个体生长速度具有一定抑制作用。     

8 羟基喹啉对泥鳅胚胎的毒性

在泥鳅胚胎发育的胚盘隆起期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期和仔鱼孵出期,分别用不同浓度(1.00×10-4、5.00×10-5、2.50×10-5、1.25×10-5、6.25×10-6mol/L)的8-羟基喹啉进行处理,以胚胎的孵化率及畸形率、仔鱼死亡率及体长的变化等为指标,探讨水体中8-羟基喹啉对鱼类胚胎及仔鱼的毒性作用。结果表明,随着8-羟基喹啉浓度增加,分别在胚盘隆起期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期开始处理时,泥鳅胚胎的孵化率较对照组显著减低,分别减少至83.5%、74%、61%、79%,畸形率较对照组显著增加,分别增加至58%、72%、61%、71%;在仔鱼孵出期开始处理时,泥鳅仔鱼死亡率由3%逐渐增加至100%;处理组的仔鱼体长短于对照组,且有剂量效应关系。因此,8-羟基喹啉对泥鳅胚胎及仔鱼的发育有明显的抑制、致畸、致死作用,表现出明显的毒性作用。     

泥鳅二倍体和四倍体及其正反交F_1的胚胎发育特征观察

为泥鳅多倍体育种及新品种的培育提供参考,在水温为(26±0.5)℃条件下,对泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)二倍体、四倍体及其正反交F1的胚胎发育过程及发育特征进行观察比较。结果表明:二倍体、四倍体、正交F1和反交F1受精卵分别经过26.18h、25.78h、26.52h和26.72h孵化出膜,其发育过程和发育时序基本相同,受精发育经过卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期、孵化出膜期等阶段,各发育分期除发育时间不同外,其发育特征和发育分期没有明显差异。二倍体、四倍体初孵仔鱼体长分别为(2.56±0.121)mm和(3.145±0.277)mm,仔鱼形态差别不大;正交F1仔鱼和二倍体仔鱼的形态特征基本相同,反交F1和四倍体仔鱼基本相同。     

雌雄泥鳅不同组织同工酶特异性表达分析

应用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳方法研究了泥鳅雌雄成体的肝脏、心脏、脑、性腺、肌肉、血液等6种组织中EST、SOD、G6PDH、ALP、ADH等5种同工酶的表达情况。结果表明,泥鳅5种同工酶不仅存在不同程度的组织差异,而且雌雄个体间也存在较大的差异。大部分同工酶在肝脏和卵巢中表达活性较高,且同工酶类型较多;雌雄个体间存在EST-5两条雌性特异性条带,可作为泥鳅雌雄个体的生化遗传标记,也可为泥鳅性别决定机制的研究提供线索。     

黑龙江泥鳅、北方泥鳅和泥鳅的形态差异分析

运用3种多元分析方法,对黑龙江泥鳅MIsgurnus mohoity、北方泥鳅Misgurnus bipartitus和泥鳅Mis-gurnus anguillicaudatus的11个形态参数进行了综合分析。聚类分析结果表明：北方泥鳅和泥鳅聚类,亲缘关系较近,与黑龙江泥鳅群体的亲缘关系较远。主成分分析结果表明：主成分1的总方差贡献率为50.430%,主成分2的为20.880%,主成分3的为10.381%,累积贡献率为81.691%。判别分析结果表明：建立的3种泥鳅的判别函数,判别准确率P1为71.4%~100%,判别准确率P2为71.4%~100%,综合判别率为80.8%。