温度对克氏原螯虾肠道菌群结构的影响

采用高通量测序技术,利用16S rRNA序列信息,研究了不同养殖温度条件下克氏原螯虾肠道菌群的多样性.测序结果显示:15℃、19℃、23℃、27℃、31℃养殖水温下,变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门为肠道主要菌门,丛毛单菌属和鞘脂单胞菌属为主要菌属.养殖水温不同,肠道优势菌群所占比例不同,丛毛单菌属在水温15℃处理组占比最...     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒和虾虹彩病毒检测及分析

2020年检测安徽省滁州、安庆和合肥的20个稻田养殖的200只克氏原螯虾(Procambarus clarkii)鳃组织中白斑综合征病毒和虾虹彩病毒,结果发现白斑综合征病毒阳性检出率为97.5％,病毒含量达106拷贝/mg的检出率与克氏原螯虾死亡率呈正相关.虾虹彩病毒阳性检出率为13％,只在滁州的3个和合肥的2个稻田的养殖虾中检出.     

浙江省4个地区克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的检测分析

随着市场需求的日益增大,克氏原螯虾的养殖规模不断扩大,但克氏原螯虾养殖业却深受白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的威胁。本次研究主要调查浙江省4个地区克氏原螯虾的WSSV携带情况和WSSV阳性感染率与季节温度变化的相关性。本研究检测了4—8月浙江省4个地区螯虾WSSV阳性感染率和阳性螯虾的血淋巴、鳃、肠的病毒拷贝数。综合4个地区每月实验数据,发现在2026 ℃时,4个地区的螯虾WSSV阳性率都可达60%以上,4—6月为WSSV发病的高危时期,到8月随着水温超过26 ℃螯虾WSSV阳性率显著下降。检测发现在鳌虾的血淋巴、鳃、肠中病毒最低的拷贝数为10³,最高的拷贝数为10¹⁰,这说明病毒会长期潜伏感染,等待温度及其他条件合适时再大量复制。本研究将为在克氏原螯虾养殖过程中防治WSSV提供科学依据。     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区序列分析

白斑综合征已给安徽省克氏原螯虾产业带来了巨大的经济损失。为了解安徽省白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)分子流行病学,2016年4—8月在安徽省6个市采集9个养殖的克氏原螯虾样本进行WSSV套式PCR检测,扩增病毒可变区ORF94、ORF75和ORF125,将获得序列进行比较分析。结果显示,9个样本均在第1轮PCR扩增中获得阳性结果,其ORF94的重复单元(repeat unit,RU)数量为2、4、7、8和12,2RUs为常见基因型,ORF75的组合RUs总数为3、6、9、10和11,9 RUs为常见基因型,排列顺序为45、102、45、102、3×45、102和45,ORF125的RUs为5~9,其中7 RUs和6 RUs为常见基因型。     

LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的比较

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是克氏原螫虾(Procambarus clarkii)养殖生产中危害最大的病原之一,也是其他一些要经济虾类的主要病害,但是目前没有相应的有效治疗药物.为了减少WSSV对克氏原螯虾的危害,及早发现病原,以便采取相应措施将损失降到最小程度,笔者开展了以环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测克氏原螯虾WSSV的研究,并且与灵敏度非常高的巢式PCR检测法进行了比较.结果表明,用LAMP法可以快速、灵敏、特异性地检测克氏原螫虾WSSV,其灵敏度与巢式PCR相比,高出约500倍,且不需要专用的PCR仪,是检测WSSV的一种理想方法.该结果也为其他虾类的WSSV检测提供了重要参考.     

池塘和稻田养殖克氏原螯虾肠道微生物对比分析

为探究池塘和稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道微生物组成的差异,采用16SrRNA高通量测序方法分析了对两种养殖模式下克氏原螯虾肠道的微生物多样性和群落结构.结果显示,所有样品共检出2 007个种水平上的分类操作单元(operational taxonomic units,OTU),归属于37个门,其中池塘养殖克氏原螯虾的肠道微生物有1 260个OTU,稻田养殖克氏原螯虾的肠道微生物有1 840个OTU,两种模式下克氏原螯虾的肠道微生物共同的OTU有1 093个;两种模式下的肠道微生物优势菌均为厚壁菌门,其中池塘模式中占比67.40％,稻田模式中占比为32.69％;对两种模式的克氏原螯虾肠道微生物进行Alpha多样性分析显示,池塘养殖克氏原螯虾肠道微生物多样性的Shannon、ACE和Chao指数均低于稻田养殖克氏原螯虾肠道微生物的指数,差异均达到极显著的水平;物种差异分析显示,在门水平上有21个门差异达到显著水平,其中有12个门差异达到极显著水平;在OTU水平上,有364个OTU差异达到显著水平,其中有106个OTU差异达到极显著水平.研究表明,池塘和稻田养殖克氏原螯虾肠道微生物在物种组成上、多样性上都存在明显差异,针对两种模式的养殖管理应有所区分,由于池塘模式下肠道微生物多样性较低,因此,需要更多地注重虾类健康状况动态,加强管理.     

稻田养殖克氏原螯虾研究

开展了稻田养殖克氏原螯虾的研究。结果表明:稻田养殖克氏原螯虾是可行的,并可获得较好的养殖效益。     

白斑综合征病毒在养殖克氏原螯虾中感染流行研究

2007年,在从南京采集的患病养殖克氏原螯虾样品超薄切片中发现大量类似对虾白斑综合征病毒(WSSV)颗粒,结合初步的流行病学调查、人工回感实验及PCR检测结果确定导致此次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原为WSSV。利用建立的特异性引物PCR方法,在江苏省内扬州邵伯湖、淮安白马湖、盱眙、南京禄口等多处养殖克氏原螯虾体内均检测到该病毒,且在鳃、心肌、神经、肝脏、肠道、肌肉等多处组织中被检出;未检测到另外两种常见对虾病毒:桃拉病毒(TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)。     

黄芪多糖对克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的效果研究

研究了基础饲料中添加不同浓度的黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的效果。用添加0%、0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖的基础饲料作为药饵,投喂20 d后,对各组经PCR检测WSSV呈阴性的健康克氏原螯虾进行WSSV病毒悬液腹节背部注射攻毒试验,当添加0%黄芪多糖的阳性对照组中死亡率达到100%时,添加0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖实验组的死亡率分别为(86.67±13.33)%、(91.11±7.70)%、(73.33±17.64)%。为了评价黄芪多糖对克氏原螯虾各器官组织的影响,对其鳃、肝胰腺、心肌组织进行病理组织切片观察,结果发现:添加0%黄芪多糖的阳性对照组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺、心肌组织出现细胞排列无序、细胞破裂、核仁皱缩等明显的病理变化;而添加0.8%黄芪多糖的实验组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺组织未见明显病变,心肌组织核仁出现一定程度的皱缩,但细胞尚未破裂。研究表明:与阳性对照组相比,添加0.8%的黄芪多糖可提高26.67%的存活率,对克氏原螯虾抗WSSV感染有很好的提高效果,可望在生产中收到良好的经济效益。     

白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究

【目的】研究经双乙烯亚胺(BEI)灭活的白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂保护克氏原螯虾Procambarus clarkii抗WSSV感染的效果,以期为白斑综合征的防治提供有效的免疫方法。【方法】应用BEI对WSSV和WSSV超声破碎液进行灭活,通过口服和注射分别对克氏原螯虾进行免疫,再对其进行抗WSSV感染的效果研究。【结果】WSSV在BEI处理24 h可以被完全灭活,通过口服途径用灭活制剂免疫克氏原螯虾7 d后攻毒,克氏原螯虾死亡率显著下降,且口服免疫的效果要好于注射免疫。【结论】经BEI灭活24 h的WSSV灭活制剂对克氏原螯虾是安全的,口服免疫后可以显著降低克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的死亡率。图2表3参19     

一种改进的对虾白斑综合征病毒提纯方法

对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白在提纯的过程中易脱落,用传统的密度梯度离心方法不易获得完整的病毒粒子,对传统的蔗糖密度梯度离心方法加以改进后,可以获得大量完整的病毒粒子.用患白斑综合征病毒病的中国对虾鳃制备WSSV粗提液,感染螯虾(Cambarus proclarkii),选取25%的蔗糖溶液用作病虾鳃的匀浆液,然后经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,大量完整的病毒位于46% ～52% 蔗糖梯度之间,病毒粒子末端带有很长的尾;而病毒裸露的核衣壳位于40%～46%蔗糖梯度之间;在57%～62%之间观察到较多完整病毒粒子和少量细菌.实验结果表明改进的病毒提纯方法较好,可得到大量完整的带嚢膜的病毒颗粒.     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白.将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶NdeⅠ、Xho Ⅰ酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a(+)表达载体上.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后成功地构建了VP28基因原核表达载体pET-28a-VP28.转化菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示含有与预期大小一致的约30 ku蛋白带,主要以包涵体形式表达.采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95％的大肠杆菌重组蛋白VP28.该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量.实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14 μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45％.这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合征奠定了基础.     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶Nde I、Xho I酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a( )表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后,证实成功地构建了 VP28 基因原核表达载体pET-28a-VP28。转化菌经 IPTG 诱导,SDS-PAGE 显示含有与预期大小一致的约30kDa蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95%的大肠杆菌重组蛋白VP28。该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量。实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45%。这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合症奠定了基础。     

维生素C对白斑综合征病毒(WSSV)侵染后红螯光壳螯虾血淋巴免疫机能的影响

为探讨维生素C(VC)对白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)侵染后红螯光壳螯虾Cherax quadricarinatus血淋巴免疫机能的影响,在基础饲料中添加不同水平的VC(0(对照)、100、200、400、800、1 600、3 200 mg/kg),投喂初始体质量为(20.31±2.09)g的红螯光壳螯虾8周,在养殖的第2、4、6、8周测定各组的相关免疫指标,养殖试验结束后在0、400、800 mg/kg VC添加组进行WSSV攻感染试验,测定WSSV侵染后血细胞总数、吞噬活性,以及血淋巴中溶血活性、凝集活性、抑菌率的变化,并分析凝集素基因(C-lectin)表达量的变化。结果表明:WSSV侵染后,红螯光壳螯虾血细胞总数及小颗粒细胞、透明细胞2种类型的血细胞数量均显著减少(P<0.05),而大颗粒血细胞数量则显著增加(P<0.05),至96 h时,800 mg/kg VC添加组血细胞总数显著高于对照组(P<0.05);血淋巴溶血活性、凝集活性和抑菌率随着WSSV侵染时间的延长,各组均呈先升高后降低的趋势,至96 h时,800 mg/kg VC添加组血淋巴凝集活性和抑菌率显著高于对照组(P<0.05);红螯光壳螯虾C-lectin基因在血细胞中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),至96 h时,试验组血细胞中的C-lectin基因表达量均保持在较低水平,且800 mg/kg VC添加组基因表达量显著高于对照组和400 mg/kg VC添加组(P<0.05)。研究表明,VC能在一定程度上增强红螯光壳螯虾的免疫机能,当添加量为800 mg/kg时,能显著增强血细胞及血淋巴的免疫活性,对红螯光壳螯虾防御WSSV侵染起到一定的免疫保护作用。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31与该病毒侵染的相关性

白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体.根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp.通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFAST BAC HTB上.重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带.用Ni2 柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验.中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能起着重要作用.     

宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的检测与分析

为了解浙江宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的流行情况,为科学防控该病提供参考依据,应用PCR方法对2004～2008年采自宁波地区对虾养殖场的1201份南美白对虾样品进行WSSV检测。结果表明,1201份样品中有364份样品呈阳性,总阳性率为30.31%;2004～2008年的WSSV年平均阳性检出率均较高,且呈不规律变化,其中以2006年南美白对虾白斑综合征发病最严重,阳性感染率达42.66%,但2006～2008年WSSV的年平均阳性检出率呈下降趋势。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31与该病毒侵染的相关性

白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体.根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp.通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFAST BAC HTB上.重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带.用Ni2 柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验.中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能起着重要作用.     

VP28蛋白鸡源抗WSSV卵黄抗体的制备及性能分析

为了研制鸡源抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）卵黄抗体（IgY）,利用WSSV毒株及其衣壳蛋白VP28制备成2种不同的疫苗,并分别免疫接种健康蛋鸡群,使鸡群产生不同的IgY,经病毒中和试验证实,2种IgY均有明显的抗WSSV效果,其中WSSV粗提液1∶1000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY对南美白对虾的保护率为61.7%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为48.3%;而WSSV粗提液1∶10000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为85.0%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为75.0%.