UGT1A1基因多态性与新生儿高胆红素血症的相关性

目的观察尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1 A1 (UGT1A1)基因的单核苷酸多态性与新生儿高胆红素血症的相关性。方法随机选取2014年9月至2016年9月在昆明市儿童医院新生儿病房住院的新生儿高胆红素血症患儿样本300例为观察组,同时随机选取无高胆红素血症的对照组样本300例。抽取静脉血2 mL,进行测定血清总胆红素值,另外,抽取静脉血2～3 mL提取基因组DNA,采用Sequenom-特定SNP位点分型检测对样本进行UGT1A1位点:rs34993780;rs35350960;rs873478;rs34946978;rs4148323检测。分析病例组与对照组之间的UGT1A1遗传多态性。结果 UGT1A1位点:rs34993780; rs873478;rs34946978;rs4148323位点检出的病例组等位基因突变率高于对照组,统计学分析,差异有统计学意义(P<0.05)。而UGT1A1rs35350960位点的等位基因突变频率为病例组1.5%和对照组1%,等位基因频率比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。结论云南省新生儿UGT1A1rs34993780;rs873... 更多     

重组腺相关病毒载体在心血管疾病基因治疗中的应用

腺相关病毒体是一种有DNA缺陷的非致病性细小病毒,重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,具有安全性好、宿主范围广等优点.rAAV已成为基因治疗研究的热点,特别是在心血管疾病机制探讨和治疗研究中应用广泛.在过去几十年里,rAAV在高血压、心力衰竭、动脉硬化和心肌梗死等心血管疾病基因治疗中成果显著.     

HSV1-TK基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的:构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-TK)基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,制备重组腺相关病毒rAAV2/HSV1-TK,并检测HSV1-TK基因在转染晶状体上皮细胞中的整合和表达,为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础.方法:用基因重组技术构建含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,并通过PCR和酶切鉴定;将该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选出携带该质粒的载体细胞株BHK-21/TK,在辅助病毒的参与下包装成重组病毒rAAV2/HSV1-TK;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和高效液相色谱(HPLC)法检测重组病毒rAAV2/HSV1-TK的纯度,用斑点杂交法检测重组病毒的滴度;重组病毒rAAV2/HSV1-TK转染兔晶状体上皮细胞N/N1003A,用PCR和RT-PCR检测HSV1-TK基因的整合和表达.结果:经PCR和酶切鉴定重组质粒pSNAV2.0-TK构建成功;成功制备了重组病毒rAAV2/HSV1-TK,病毒滴度达1×1012v.g./mL;重组病毒转染N/N1003A细胞后,PCR和RT-PCR检测显示HSV1-TK基因在细胞中整合并且有效表达.结论:成功构建了含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒,制备了高滴度重组病毒rAAV2/HSV1-TK,HSV1-TK基因在转染该病毒的晶状体上皮细胞中可有效表达.     

表达ROG的重组腺相关病毒载体的构建及高滴度病毒的制备

目的:观察三叉神经痛(trigeminal neuralgia,TN)患者痛支神经的有髓纤维脱髓鞘处是否有河豚毒素不敏感型(tetrodotoxin-resistant,TTX-R)hNav1.8通道蛋白的异常表达,探讨其与三叉神经痛的关系.方法:以6例原发性TN第三支痛经保守治疗无效行手术治疗患者的下牙槽神经为研究对象,以舌颌颈联合根治术患者的耳大神经、下牙槽神经为阴性和正常对照,以鼠脊神经为阳性对照,运用免疫组化的方法观察hNav1.8通道蛋白在TN患者痛支神经与对照神经标本超微结构中的表达.结果:hNav1.8通道蛋白在TN患者痛支神经的有髓纤维脱髓鞘处有大量表达,鼠脊神经轴突内有少量表达,而正常下牙槽神经及耳大神经中无表达.结论:hNav1.8通道蛋白在TN患者痛支有髓纤维脱髓鞘处的异常表达可能与TN的发病有关.     

基因治疗中的腺相关病毒载体

基因治疗是一种新型疾病治疗手段，它通过载体把正常基因或有治疗作用的基因导人靶细胞，纠正先天基因缺陷或者合成具有治疗作用的蛋白，从而达到治疗疾病的目的。腺相关病毒载体（adeno—associated virus，AAV）具有无神经毒性和低免疫原性等独特生物学优势，在基因治疗的基础研究和临床应用领域倍受重视．被认为是当前基因治疗中最有潜力的病毒载体。     

携带小鼠HVEM的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的 克隆小鼠疱疹病毒侵入介体(HVEM)基因,构建其重组腺相关病毒载体,鉴定目的 基因在真核细胞中表达.方法 用RT-PCR法从小鼠脾脏淋巴细胞克隆出全长HVEM基因,构建携带HVEM基因的穿梭质粒pAAV-IRES-HVEM-hrGFP和辅助质粒pAAV-RC及pAAV-Helper,利用磷酸钙共沉淀法将穿梭质粒共转染入AAV-293细胞中,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒rAAV-HVEM.用氯仿-PEG8000法纯化病毒,实时荧光定量PCR测病毒滴度.RT-PCR检测rAAV-HVEM在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况.结果 成功构建组装重组小鼠HVEM腺相关病毒,纯化后病毒滴度为5×1010 v·g/mL,且在CHO 转导细胞中能有效表达目的 基因.结论 构建的重组腺相关病毒载体rAAV-HVEM 为组织工程相关细胞转基因构建及临床应用提供先进的载体系统,为今后进一步研究HVEM的功能及其在部分疾病基因免疫治疗中的应用奠定基础.     

构建重组人SERCA2a基因9型腺相关病毒载体和病毒包装

目的探讨构建重组人SERCA2a基因9型腺相关病毒载体和病毒包装的方法,并包装出rAAV9-hSERCA2a-EGFP。方法根据细菌内同源重组的方法使用腺相关病毒包装系统,将hSERCA2a基因克隆到腺相关病毒载体中,与腺相关病毒包装质粒pAAV pHelper发生重组,通过脂质体共转染人胚肾293(HEK293)细胞,产生重组腺相关病毒,通过酶切鉴定和DNA测序鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定(采用荧光滴度检测法)。结果酶切鉴定和DNA测序证明重组腺相关病毒载体rAAV9-hSERCA2a-EGFP构建成功,PCR鉴定可见到阳性扩增条带,rAAV9-hSERCA2a-EGFP滴度高达1×1012 vg(virus genomes,vg)/mL。结论本方法成功构建和包装滴度为1×1012 vg/mL携带hSERCA2a基因的rAAV9-hSERCA2a-EGFP。     

腺相关病毒与人α1干扰素基因重组体的构建

目的 构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因重组体。方法 用多聚酶链反应(PCR)方法扩增获得hIFNα1基因；以T-A克隆方法将PCR扩增hIFNα1基因亚克隆到PCR2，1质粒中，产生PCR2．1—hIFNα1；用EcoRI酶切PCR2．1—hIFNα1，后回收hIFNα1基因片断，将此片断连接到pWP8A的EcoRI位点上，构建重组体pWP8A—hIFNα1；pWP8A—hIFNα1转化JM109大肠杆菌扩增，hIFNα1基因经测序鉴定符合Genebank中hIFNα1序列，并用BanH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向。结果 经MR扩增获得567bp hIFNα1基因；构建重组体pWP8A—hIFNα1，经测序证实pWP8A—hIFNα1中的hIFNα1与Genebank中hIFNα1序列相同，用BamH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向正确的重组体pWP8A—hIFNα1。结论 成功构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因的重组体。     

重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs).方法从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI=10^2,10^3,10^4,10^5,10^6,10^7)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况.结果转染后10～14 d,eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%～2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率.在MOI=105的条件下转染后观察了61 d,eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5～0.6)%,33～61 d一直维持在这一水平.结论rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍.     

hTRX-PR39重组腺相关病毒载体的构建

目的 探讨hTRX-PR39融合基因在脑缺血疾病中的治疗作用。方法 将已经构建好的hTRX-PR39融合基因插入到具有相应酶切位点的pSSCMV病毒载体质粒中,得到重组腺相关病毒载体质粒,酶切电泳鉴定。将已构建的重组腺相关病毒载体质粒、腺病毒辅助质粒PFG140和包装质粒pAAV/Ad,三质粒磷酸钙共沉淀法转染293细胞系,通过同源重组获得hTRX-PR39重组腺相关病毒载体, 收集病毒, 斑点杂交（Dot blot）法测定病毒滴度。结果 成功构建重组腺相关病毒质粒pSSCMV/ hTRX-PR39。包装、回收病毒后,Dot blot法测定重组病毒滴度为3.46×(1012~1013)PFU/mL。结论 成功构建pSSCMV/ hTRX-PR39重组腺相关病毒载体,并包装较高浓度的重组病毒。     

Packaging and Functional Identification of Recombinant Adeno-associated Virus Encoding cdc2-siRNA

Cyclin dependent kinases （cdks） play an important role in the pathogenesis of multiple neurodegenerative diseases. To explore the possibility of cdks-related gene therapy for neurodegen-erative diseases, we packed recombinant adeno-associated virus （rAAV） encoding cdc2-siRNA. The expressing plasmid pAAV-MCS-EGFP-U6-cdc2-siRNA was constructed by using molecular biological techniques. The rAAV encoding cdc2-siRNA （rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA） was packed by calcium phosphate mediated co-transfection of the plasmid pAAV-MCS-EGFP-U6-cdc2-siRNA, p-RC and p-Helper into AAV-293 cells. DNA sequencing proved the successful construction of U6-cdc2-siRNA in pAAV-MCS-EGFP. Seventy-two h after packaging, the expression of EGFP could be detected in AAV-293 cells. Western blotting revealed that cdc2 gene expression in AAV-293 cells was down-regulated markedly after transfection with rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA, which evidenced the satisfactory silencing effect of this virus. It was concluded that the packaging of rAAV encoding cdc2-siRNA was successful. rAAV encoding cdc2-siRNA could silence cdc2 gene effectively, which might offer a novel means for the treatment of neurodegenerative diseases.     

人对氧磷酶1基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的：构建带有人对氧磷酶1（hPONI）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体,并检测其转染大鼠骨髓内皮祖细胞（EPCs）后hPON1的表达。方法：提取流产胎儿肝脏的总RNA,RT-PCR获得cDNA,设计引物通过PCR获得PON!基因片段,将其与pGEM—TEasy载体连接,将PON1基因片段切下,插入到质粒pAAV—IRES—GFP的多克隆位点,获得质粒pAAV—PON1-IRES—GFP,经酶切和测序鉴定。包装的病毒rAAV—PON1用斑点杂交检测滴度,并用其转染EPCs检测hPON1在mRNA水平的表达。结果：pAAV—PON1-IRES-GFP酶切和测序结果完全正确。斑点杂交检测病毒的滴度为1．7×10^10g／mL,RT—PCR结果显示病毒转染EPCs后存在hPON1的表达。结论：成功构建了pAAV—PON1-IRES—GFP质粒,包装出较高滴度的rAAV—PON1,并且转染EPCs后可以检测到hPON1表达。     

靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用

目的 构建靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体,并应用于肺血管疾病,为后期研究肺血管KLF4基因敲减在肺动脉高压大鼠中的作用及相关分子机制奠定基础。方法 根据大鼠KLF4基因序列,设计针对大鼠特异性的siRNA序列,以pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP作为空白载体,通过酶切技术构建带有GFP荧光标记的KLF4干扰腺病毒载体pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP,行测序分析,并进行病毒扩增、纯化及滴度测定。本研究对长时间（3个月）接触香烟烟雾的大鼠进行气道注入AAV1-KLF4-shRNA的干预治疗,观察大鼠右心室收缩压、平均右心室压等血流动力学指标改变。结果 经测序检测显示,大鼠AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体构建成功。健康对照组、生理盐水模型组、对照病毒模型组、治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压比较,差异均有统计学意义（P <0.05）。结论 对长时间接触香烟烟雾的肺动脉高压模型大鼠应用AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体,能有效改善右心室收缩压和平均右心室压,该载体在相关疾病动物模型中应用有效,为后期顺利开展AAV1-KLF4-s...     

含乙型肝炎表面抗原基因重组腺相关病毒的构建及其基因的表达和功能初步研究

目的构建含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的重组腺相关病毒(rAAV)并观察目的基因的表达和功能。方法采用PCR法从PTHBV-1质粒中扩增HBsAg基因(ayw 亚型);将PCR扩增产物插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNAV-HBsAg;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中,G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK-HBsAg;用具有rAAV包装功能的HSV-1- HSV1-rc/△UL2感染BHK-HBsAg,纯化后得到rAAV-HBsAg;ELISA检测重组病毒表面抗原基因在BHK-21细胞和293细胞中的表达;用rAAV-HBsAg免疫BalB/C小鼠,RIA法检测血清中表面抗体的滴度。结果ELISA法检测到混合细胞系BHK-HBsAg中HBsAg的表达量为(28.6±6.7)ng/5×106细胞;rAAV-HBsAg感染BHK-21细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达,表达量随感染复数的增加而升高;rAAV-HBsAg免疫的BalB/C小鼠能产生表面抗体(抗-HBs抗体)。结论rAAV-HBsAg在体外能表达,免疫动物能诱导体液免疫反应的产生。rAAV-HBsAg有希望成为乙型肝炎候选疫苗,也可以进一步用于探索慢性乙型肝炎的免疫治疗。     

携带CML28基因的2型重组腺相关病毒的构建及体外转染树突状细胞

 目的 构建携带肿瘤抗原CML28基因的2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV2/CML28）,检测其体外转染人树突状细胞（dendritic cells,DCs）后对DCs的影响和目的基因CML28的表达。方法 将CML28基因克隆到2型重组腺相关病毒载体系统（AAV Helper-Free System）中的真核表达质粒pAAV-IRES-hrGFP,将酶切和DNA测序鉴定后的重组表达质粒pAAV-CML28-hrGFP与AAV Helper-Free System 中的病毒包装辅助质粒pAAV-RC和pHelper以磷酸钙法共转染AAV-293细胞,制备携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28。rAAV2/CML28转染体外培养的DCs,RT-PCR法检测CML28的表达,流式细胞术检测DCs的表面分子和rAAV2/CML28转染DCs的效率。结果 流式细胞术证实构建并包装了rAAV2/CML28,该病毒对DCs的转染效率接近30%,病毒转染DCs检测到CML28的表达以及高水平的HLA-DR、CD80、CD83和CD86表达。结论 成功构建了携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28,该病毒介导目的基因在DCs内表达,DCs的成熟没有因病毒转染受到不良影响,为应用CML28转基因DCs诱导CML28特异性抗肿瘤免疫研究奠定了基础。     

重组腺相关病毒协同重组腺病毒增强目的基因表达的体内试验

目的研究重组腺相关病毒(rAAV)协同重组腺病毒(AdV)在体内增强目的基因表达的强度及时间变化。方法人EB病毒阳性鼻咽癌细胞株C666-1接种于裸鼠皮下,待肿瘤直径达到3 mm左右以rAAV-EGFP 1.5×1011v.g(病毒基因组数,vi-rus genome)、rAdV-EGFP 2.5×108pfu或其等量混合液采用瘤内注射,于注射后第5天、10天分别处死裸鼠,取注射点周围肿瘤组织以10%PBS福尔马林固定,用免疫组化方法检测GFP表达情况,在400×光学显微镜下计数具有代表性的10个视野下的阳性细胞比例及强度,采用SPSS10.0单项方差分析统计结果。结果免疫组化提示瘤内注射病毒后第5天rAAV组开始表达目的基因(1.70±0.48),rAdV组目的基因表达达到高峰(6.00±1.94),联合组表达量与AdV组基本一致(6.90±1.92);第10天rAdV组目的基因表达基本消失(2.00±0.67),rAAV组表达明显升高(8.00±1.15),联合组持续高表达(10.10±1.63),且较rAAV组有显著差异(P=0.001)。结论 rAAV协同rAdV能够显著提高目的基因的表达量,能够使目的基因表达迅速且维持较长时间,可相互弥补两种病毒的不足,是一种值得推荐的基因表达方式。     

Construction of recombinant adeno-associated virus vector co-expressing hVEGF_(165) and hBMP_7 gene

Objective: To construct recombinant adeno-associated virus co-expressing human vascular epithelial growth factor 165(hVEGF165) and bone morphogenetic protein 7(hBMP7),measure the virus titer and verify the recombination. Methods:The AAV helper-free system was used as basis to generate recombinant AAV. The IRES sequence of plasmid pIRES was cut down and subcloned into ITR/MCS containing vector pAAV-MCS to construct recombinant plasmid pAAV-MCSa-IRES-MCSb. The hVEGF165 and hBMP7 gene was amplified by PCR and inserted into upstream MCSa and downstream MCSb respectively. Then,recombinant plasmid pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7,pAAV-RC and pHelper were co-transfected into AAV-293 cells to complete rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 packaging. The GFP labeled rAAV-IRES-GFP was simultaneously packaged by using the parallel plasmid pAAV-IRES-hrGFP. The efficiency of AAV packaging was monitored under fluorescent microscope and recombinant viral particles were harvested from infected AAV-293 cells. The virus titer was measured by infecting AAV-HT1080 cells,and the recombinant AAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by PCR of the exogenous interest genes. Results:Recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by double digestion. GFP expression in AAV-293 could be observed under fluorescent microscope 72 h after transfection and the system provided a high packing ratio of 95%. The recombinant adeno-associated virus has a high titer of 5.5×1011vp/ml,and AAV-HT 1080 was infected at a ratio of 90%. The recombinant virus was confirmed by PCR of exogenous hBMP7 and hVEGF165 gene. Conclusion:Recombinant rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was successfully constructed with a high virus titer,which may offer foundation for in vitro and in vivo experiments of hVEGF165 and hBMP7 co-expression and provide a new method for gene therapy of bone regeneration.