实时荧光定量PCR检测IL-8mRNA在大肠癌的表达

目的:探讨大肠癌组织IL-8 mRNA表达及其临床意义.方法:用实时荧光定量PCR检测56例大肠癌组织及癌旁正常组织IL-8 mRNA表达,分析IL-8mRNA表达与大肠癌临床病理因素之间的关系.结果:癌组织和癌旁正常组织IL-8 mRNA表达有显著差异(1.106±0.420 vs 0.792±0.374,P＜0.05).癌组织IL-8 mRNA表达与淋巴结转移、组织学类型、血管侵犯、肝转移及肿瘤病理分期密切相关,与肿瘤部位、肿瘤大小、及患者的性别和年龄等无关.结论:IL-8高表达同大肠癌生物学行为密切相关,可能与大肠癌的发生、发展及预后有关.     

实时荧光定量PCR检测多房棘球蚴感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因方法的建立

目的 建立多房棘球蚴(泡球蚴)感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因(Serpina3g)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测方法及与常规RT-PCR检测方法的比较.方法 肉眼直视下肝脏穿刺注射100 μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型,3个月后将小鼠处死,Trizol法提取肝脏总RNA,反转录获得cDNA.依据Serpina3g的编码基因(NM_009251)保守序列,通过Primer 5软件设计定量引物,以β-actin作为内参.以健康小鼠肝脏获得的cDNA依次10倍梯度稀释制备标准品(1×10~2～1×10~6 pg),利用SYBR Green RT-qPCR方法检测Serpina3g基因,然后根据cDNA浓度与循环值(Ct)的线性关系,绘制标准曲线,确定RT-qPCR检测的最佳条件和重复性;并将RT-qPCR结果与常规RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果进行特异性、灵敏度和定量等方面的比较.结果 筛选出Serpina3g基因定量引物,最佳退火温度为56.4℃;RT-qPCR无非特异性扩增,标准品及样品熔解温度均在80.5℃,熔解峰单一;标准曲线斜率为-2.833(效率),相关系数r=0.996;5个不同梯度的样本(1×10~2-1×10~6pg)重复检测5次均为阳性,变异<5%;mRNA检出限为1×10~2 pg,总RNA在1×10~2～1×10~6 pg内均可以进行扩增;常规RT-PCR方法mRNA检出限仅为1×10~6 pg.结论 成功建立了小鼠源Serpina3g的PT-qPCR检测方法,在特异性、灵敏度、重复性和定量方面优于常规RT-PCR.     

人POT1基因实时荧光PCR相对定量法的建立

目的：建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人POT1基因的方法。方法：依据人POT1基因及参照基因TBP基因序列设计引物,以人类乳腺癌细胞系MCF-7总RNA逆转录合成的cDNA为模版,以TBP基因为参照基因,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测POT1基因的表达。结果：POT1和TBP基因熔解曲线为单峰,无杂峰及二聚体。POT1基因及参照基因TBP基因扩增效率相同（直线斜率0．0171〈0．1）。POT1基因批内变异与批间变异分别为1.3％和2.1％;TBP基因批内变异与批间变异分别为1．2％和2．6％。结论：建立了SYBR Green Ⅰ实时定量检测人类POT1基因的方法,该方法简单快速,经济,灵敏度高,特异性和重复性好,可用于人类POT1基因的定量分析。     

实时荧光定量PCR技术检测食管鳞癌c-myc mRNA的表达

目的 探讨c-myc mRNA表达与食管鳞癌发病的关系.方法 采用实时荧光定量PCR法检测24例食管鳞癌患者食管鳞癌组织和正常食管鳞状上皮组织、癌旁食管鳞状上皮组织中c-myc mRNA的表达.结果 食管鳞癌组织与癌旁食管鳞状上皮组织c-myc基因的表达量相近,二者均明显高于正常食管鳞状上皮组织(P<0.05).结论 c-myc基因在食管鳞状上皮癌变过程的早期阶段起重要作用.     

应用实时荧光定量PCR检测结直肠癌与癌旁组织中miRNA-221的差异表达状况

目的分析结直肠癌与毗邻癌旁组织中miRNA-221差异表达状况。方法常规抽提30例结直肠癌及对照癌旁组织中总RNA,应用实时荧光定量PCR方法检测标本中miRNA-221的表达状况。结果与癌旁组织相比,结直肠癌组织中miRNA-221表达明显上调（P〈0．01）。结论实时荧光定量PCR是一种较精确的miRNA定量检测方法;miRNA-221可能通过转录后基因沉默机制促进结直肠癌的发生发展。     

鼠尿液中弓形虫B1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中弓形虫B1基因序列,设计1对引物和1条TaqMan探针。从感染弓形虫小鼠尿液提取弓形虫总DNA,先用普通PCR扩增获得目的基因产物,将纯化的回收产物与pMD18-T载体连接,测序证实为目的片段后,制备系列浓度参照品。再优化实时荧光定量PCR反应体系,并对体系的灵敏度、重复性、线性、特异性和参照品稳定性进行评价。其灵敏度为104拷贝/ml;批内变异系数为2.42%,批间变异系数为4.18%,线性为103～107拷贝/ml,特异性为100%,参照品稳定。该法检测鼠尿样弓形虫DNA具有方便、灵敏、特异和重复性好等优点。     

实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体的诊断价值

目的探讨实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体的诊断价值。方法对呼吸道感染的186例患者的痰液分别采用实时荧光定量PCR技术和基因测序检测,以评价实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体感染的准确性。结果实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的灵敏度为100.0%,特异度为93.1%,阳性预期值为80.8%,阴性预期值为100.0%,准确率为94.6%。结论实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体具有较高的可靠性,适用于临床快速诊断肺炎衣原体感染的相关疾病。     

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。     

检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)方法。方法根据贝氏柯克斯体特异的23SrRNA插入基因序列设计引物和探针,以克隆的23SrRNA插入基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体,检出结果均为0。用荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体感染的小鼠脾脏标本,脾脏中贝氏柯克斯体的感染量与感染过程具有相关性。结论本研究建立的检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合样本中微量贝氏柯克斯体DNA的检测,其定量检测可用于动物实验中的贝氏柯克斯体感染程度的分析。     

实时荧光定量PCR检测五日热巴通体

目的 采用TaqMan-MGB探针建立检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）方法。方法 根据五日热巴通体特异的16-23S rRNA间隔区序列设计引物和探针，以克隆的16-23S rRNA间隔区基因片段作DNA模板，建立了检测五日热巴通体实时荧光定量检测方法。结果 建立的定量标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．996）；与普通PCR相比较，荧光定量PCR检测的灵敏度约为它的200倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌，检出结果为阴性。实时荧光定量PCR检测五日热巴通体实验感染小鼠血、脾脏、肝脏和肺组织DNA样本，脾脏和肝脏样本中检出较高水平五日热巴通体DNA，血和肺部检出的目的DNA的水平较低。结论 本研究建立的检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR法具有很高的检测灵敏度和特异性，可用于临床患者血样本的检测，作五日热的早期诊断。     

实时荧光定量PCR方法检测幼兔粪便双歧杆菌的实验研究

目的:应用实时荧光定量PCR技术对实验幼兔粪便内双歧杆菌进行定量分析．方法:依据双歧杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,以常规PCR产物经克隆后的质粒 DNA为标准品,经光谱定量、梯度稀释后制备标准曲线．抽提正常对照组和双歧杆菌喂饲组幼兔粪便内的细菌基因组DNA,用实时荧光定量PCR技术定量分析样品中双歧杆菌数量．结果:两组幼兔粪便内双歧杆菌测定结果均成阳性,双歧杆菌喂饲组0．05 g湿粪内菌量的对数值较对照组显著升高(6．37±0．58 vs 5．18 ±0．98,P=0．004)．结论:实时荧光定量PCR方法可正确定量实验兔粪便内双歧杆菌数量．     

联合应用激光微切和实时定量RT-PCR检测单个胰岛的基因表达

在显微镜下用紫外激光微切机将单个胰岛从胰腺切片中切下，提取RNA后逆转录成cDNA并在实时定量RY—PCR中得到有效的扩增，其表达量与细胞数量成正比。     

尖锐湿疣患者荧光定量PCR检测结果分析

目的探讨尖锐湿疣患者疣体中人乳头瘤病毒(HPV)分型、基因含量及其意义。方法采用荧光定量PCR技术(FQ-PCR)检测尖锐湿疣患者疣体中HPV-DNA含量及其型别。结果169例尖锐湿疣患者经FQ-PCR检测后168例(99.41%)阳性,其中HPV6/11型阳性150例(88.76%),平均1.2×107拷贝/ml;HPV16/18型阳性13例(7.69%),平均2.3×106拷贝/ml;HPV6/11和HPV16/18型同时阳性5例(2.96%),平均1.0×107拷贝/ml;4型均阴性1例(0.59%),定量为0×10拷贝/ml。结论HPV6/11型是尖锐湿疣发病的主要型别,尖锐湿疣患者疣体中HPV-DNA含量与其是否复发无明显关系,FQ-PCR可作为尖锐湿疣早期诊断的指标。     

冠心病外周血白细胞PRKCB1 mRNA表达量与血管硬化危险因素及病变程度的相关性研究

目的 检测冠心病患者外周血白细胞蛋白激酶Cβ （PRKCB1）基因表达,分析其与冠心病类型、冠脉血管病变程度及动脉硬化危险因素血脂、高敏C-反应蛋白（hs-CRP）的关系.方法 纳入冠心病患者38例,其中稳定型心绞痛（SAP）10例、急性冠脉综合征（ACS）28例,另选健康对照组20名,进行血脂、hs-CRP水平、血细胞参数及PRKCB1 mRNA表达的检测分析.结果 SAP组和ACS组高密度脂蛋白胆固醇水平均较健康对照组显著降低（P＜0.05）,而甘油三酯水平高于健康对照组（P＜0.05, P＜0.01）,总胆固醇水平三组比较差异无统计学意义（P＞0.05）,SAP组和ACS组低密度脂蛋白胆固醇水平较健康对照组升高,ACS组升高差异有统计学意义（P＜0.05）.入院24 h后,与健康对照组相比,SAP组和ACS组患者hs-CRP水平升高,ACS组升高差异有统计学意义（P＜0.05）.SAP组和ACS组中性粒细胞计数均较健康对照组不同程度升高,ACS组升高差异有统计学意义（P＜0.05）.单核细胞计数和单核细胞百分比SAP组和ACS组均较健康对照组有升高趋势（P＞0.05）.冠心病患者PRKCB1 mRNA表达水平与健康对照者相比差异有统计学意义（P＜0.05）,且ACS组低于SAP组;PRKCB1 mRNA表达和血管病变支数呈负相关,单支、双支和三支血管病变组依次降低, 以三支血管病变组降低明显（P＜0.01）.结论 PRKCB1 mRNA表达与动脉粥样硬化危险因素明显相关,因冠心病的不同类型而有所差异,且与冠脉血管病变程度呈负相关.     

肝癌相关基因表达的荧光定量PCR检测及分子诊断指数的建立

目的:研究肝细胞癌相关基因表达,建立肝癌分子诊断指数,以期能更准确的诊断肝癌.方法:采用实时荧光定量PCR检测40例肝细胞癌患者癌组织和配对的癌旁2 cm及手术切缘组织、10例肝硬化组织、10例正常肝脏组织中11个基因的表达,以管家基因G3PDH为对照,2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量,挑选出特异性好且与正常肝、肝...     

石蜡包埋组织实时荧光定量聚合酶链反应检测在结核病诊断中的价值

目的探讨石蜡包埋组织实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测结核分枝杆菌DNA在结核病诊断中的价值。方法275例组织标本行常规组织病理学检查、抗酸染色,并对石蜡包埋组织应用实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA。结果275例FQ-PCR检测结核分枝杆菌DNA阳性211例(76.7%),病理诊断为结核183例(66.5%),抗酸染色阳性23例(8.4%)。病理诊断为结核者FQ-PCR阳性率为93.4%,抗酸染色阳性者FQ-PCR阳性率95.7%。结论实时荧光聚合酶链反应技术敏感性高、其与组织病理学相结合可以提高诊断率。     

Expression levels of asparagine synthetase in blasts from children and adults with acute lymphoblastic leukaemia

L-asparaginase is active in the treatment of acute lymphoblastic leukaemia (ALL) through the depletion of serum asparagine. Here we report that median asparagine synthetase (AS) mRNA levels were higher in acute myeloid leukaemia (AML) than ALL blasts in both children and adults, with intermediate levels in normal peripheral blood mononuclear cells (NPBMC). NPBMC versus child ALL (Tukeys multiple comparison test, P < 0.05); child ALL versus child AML (P < 0.001) and adult ALL versus adult AML (P < 0.01) were all significant and support the hypothesis that selectivity to treatment with l-asparaginase is due, at least in part, to lower AS expression.     

基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立一种方便快捷的检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法。方法根据GenBank公布的微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对引物,通过质粒DNA和卵囊检测标准曲线的绘制及特异性和重复性的研究,建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法,进而对奶牛粪便进行检测。结果建立的Real-time PCR法对检测微小隐孢子虫具有很高的特异性,质粒DNA和卵囊的检测阈值分别达到1个拷贝和10个卵囊,奶牛粪便阳性率为25.93%（21/81）,高于普通PCR检测率20.99%（17/80）。结论建立的Real-timePCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于微小隐孢子虫的快速定量检测。