应用PCR技术检测鹿流行性出血病病毒

对PCR (包括PCR/化学发光杂交检测、抗体亲和捕获套式PCR检测、原位PCR检测、PCR/RFLP检测 )检测在最近几年鹿流行性出血病病毒 (EHDV ,包括EHDV 1 ,EHDV 2等 )临床诊断的应用和研究成果进行了论述 ,认为该技术为EHD的诊断、流行病学调查、疫情监控及防制等提供了一种更灵敏、特异和快速的方法     

鹿流行性出血病RT-LAMP检测方法的初步建立

本实验应用反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）建立了一种快速、灵敏、特异的检测鹿流行性出血病病毒（EHDV）的方法。针对EHDV-VP7基因,在基因的保守区域设计两对特异性引物,通过优化反应温度、Mg2＋浓度等,建立了EHDV RT-LAMP检测方法。实验结果表明,建立的EHDV RT-LAMP检测方法的灵敏度是普通荧光RT-PCR方法的1 000倍,且能区分EHDV、AKV和VSV病毒。     

鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了更好的研究鹿流行性出血病病毒(EHDV)的生物学特性和建立EHDV免疫学检测方法,本研究用纯化的EHDV免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,获得了2株(1A5和8H6)能够稳定分泌抗EHDV单抗的杂交瘤细胞株.其细胞培养上清效价分别为1∶256和1∶512,腹水效价分别为1∶1 024 000和1∶2 048 000;McAb 1A5和8H6 的相对亲和力分别为0.9 mg/L和0.7 mg/L.间接ELISA结果显示,2株单抗仅与EHDV反应,不与蓝舌病病毒、赤羽病病毒、水疱性口炎病毒、小反刍兽疫病毒和BHK细胞反应,表明2株单抗特异性良好.这2株单抗的获得为研究EHDV生物学特性和建立EHDV检测方法奠定了基础.     

鹿流行性出血病病毒高通量液相芯片检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血病病毒(EHDV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中EHDV的VP7基因进行序列分析,设计EHDV特异性探针并用生物素标记,与荧光编码微球偶联后与病毒VP7基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip200)检测荧光信号建立了EHDV快速高通量液相芯片检测方法。检测结果显示,该法具有较好的特异性,不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度为100个TCID50。建立了快速检测EHDV的液相芯片技术,为进一步搭建EHDV快速高通量检测平台奠定了基础。     

鹿布鲁菌分型实时荧光定量PCR检测方法的建立

鹿布鲁菌病主要是由牛型、羊型和猪型布鲁菌引起的,其他感染型少见,本研究依据布鲁菌的特异性基因BruAB20168、BMEII0466、BR0952上的部分高度保守片段设计猪型、牛型、羊型引物和探针,用于检测并区分鹿源布鲁菌的种型,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到pUC57载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布氏菌各分型荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线敏感性可知该方法的最低检测浓度分别可达到12、9、8copies/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。     

鹿流行性出血病病毒双抗夹心ELISA方法的建立

为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,用纯化的抗EHDV特异性单克隆抗体包被ELISA板,用兔抗EHDV IgG作为夹心抗体,IgG作为夹心抗体建立EHDV双抗夹心ELISA方法,并对该方法的特异性和敏感性进行了试验.用ELISA分别检测EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、水疱性口炎病毒(VSV)、赤羽病病毒...     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R²值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%～0.43%,组间变异系数为0.67%～0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪流行性腹泻病毒株FJ473395的M基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出182 bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物Tm在85～85.5℃之间,灵敏度为5.875拷贝/μL,特异性和重复性较好。本试验建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断,并定量分析PEDV感染程度奠定了基础。     

鹿布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究依据布鲁氏菌的特异性基因Omp25c的部分片段作为靶基因,设计探针引物,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到PGEM-T载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线可知该方法的最低检测浓度可达到36拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。     

鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达

根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。     

TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用

根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒Ⅳ基因序列,设计了一对特异性引物和探针,扩增长度为186bp的片段。以克隆Ⅳ基因的质粒作为阳性标准品,建立了一种快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法在10^9-10^1copies／μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10copies／μL的质粒DNA,以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板时,均检测不到荧光信号,而重复性实验中其变异系数均小于2％,表明此方法具有很好的特异性和重复性。应用此方法对采集的60份,陆床样品进行检测,其阳性检出率为92％,而用常规RT-PCR方法进行检测,阳性检出率仅为80％。表明荧光定量RT-PCR方法的敏感性明显高于常规PcR检测方法。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品.结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=1.000,具有良好的线性关系...     

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的建立

依据非洲猪瘟病毒(ASFV)的vp73基因保守序列,设计了特异性引物与TaqMan探针,扩增片段69bp,建立了ASFV实时荧光PCR检测方法。与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对,结果显示,本文建立的方法与OIE两种检测方法的特异性相当,灵敏度与OIE荧光PCR方法相当,但比普通PCR方法高出至少10倍。标准定量曲线显示,本文方法最低检测限可达10 copies/μL病毒DNA(相关系数为0.993046)。重复性试验的批内CV值为0.61%～1.14%,批间CV值为1.37%～3.14%,表明本文方法的重复性和稳定性良好。可见,本文建立的基于vp73基因的ASFV实时荧光PCR检测方法具备快速、准确、灵敏的特点,将为检验检疫部门防御ASFV传入我国提供更多技术支持。     

牛白血病病毒LUX^TM实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

采用LUXTM新型荧光PCR技术原理,设计并合成1对单标记LUXTM荧光引物.建立了LUXTM荧光PCR和RT-PCR方法,可快速检测牛白血病病毒(BLV)前病毒DNA和病毒RNA.结果显示所建立的LUXTM荧光PCR/RT-PCR体系可特异检测牛白血病病毒核酸,而对蓝舌病、牛病毒性腹泻-粘膜病、水泡性口炎、口蹄疫、牛流行热、牛传染性鼻气管炎等病毒核酸以及牛结核分支杆菌、大肠杆菌、健康动物组织核酸扩增均呈阴性反应.敏感性实验表明LUXTM荧光RT-PCR对RNA前病毒的检测敏感性达0.49 ng/μL,荧光PCR对pTblv-gp51重组质粒的检测敏感性可达0.138拷贝,比OIE规程的巢式PCR方法高104倍以上.采用该方法从血清学阳性临床牛血清中检出BLV阳性样品.     

基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

为建立快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究以PEDV的N基因为靶基因,基于双启动寡核苷酸引物(DPO),经过条件优化,建立了检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,DPO引物的有效退火温度范围较宽(45℃~65℃);在测试的10种病毒中仅PEDV为阳性扩增结果,其余病毒为阴性结果,特异性较强;对PEDV质粒标准品的检测限可达1.64×10^1拷贝/μL,敏感性较高;组内、组间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。利用该方法对采集的272份临床仔猪腹泻样品(粪便、小肠组织)进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品39份,阳性率为14.34%,与常规RT-PCR方法检测结果的阳性符合率为92.31%;本研究建立方法检测的阳性样品经PEDV N基因测序鉴定,确实均为PEDV阳性样品。本研究建立的基于DPO引物检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法为PEDV的准确检测和流行病学调查提供技术支持。     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

实时荧光定量PCR检测伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列(EF552427),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的细胞中提取DNA,进行PCR扩增.将鉴定正确的gE基因片段克隆入pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒.以该阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线.对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序.经临床应用表明,该荧光定量PCR方法的建立为猪伪狂犬病病毒的早期诊断并定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础.