采用蛋白质组分析高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞的影响

目的研究腹透液中葡萄糖对人腹膜间皮细胞（HPMCs）分泌蛋白质影响，并采用蛋白质组学方法分析其对腹膜纤维化和腹膜功能的影响。方法采用胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离HPMCs，第3代用于实验。实验分组：对照组（F12培养基）和高糖组（F12培养基＋4％葡萄糖），分别观察24h和48h。经二维凝胶电泳（2-DE）分离人腹膜间皮细胞总蛋白，每组重复3次，PDQuest图象分析软件比较对照组和高糖组平均凝胶，求差异蛋白质。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定部分差异蛋白质。结果获得12块经2-DE分离的分离胶，每组3块。通过PDQuest图象分析软件发现24h高糖组与对照组比较有27种蛋白质表达有差异（P〈0．05）；48h高糖组与对照组比较有50种蛋白质的表达有差异（P〈0．05），表达上调有22个蛋白质斑点，表达下调有55个蛋白质斑点；对其中23个差异蛋白质斑点进行了肽质指纹图分析，鉴定出23种蛋白质，其中有2个点为同一蛋白质。这些蛋白质涉及到高糖对HPMCs的细胞骨架、糖代谢、黏附、细胞因子、抗氧化剂、表面活性剂等物质的调节。结论高糖导致腹膜纤维化是多因素、多途径，要防止腹膜透析腹膜纤维化保护腹膜透析效能．最好避免过多使用高糖透析液。     

高糖对大鼠腹膜间皮细胞中P21WAF1基因表达的影响

目的研究细胞周期调控蛋白p21WAF1在高糖对腹膜间皮细胞增殖抑制中的作用.方法用流式细胞仪技术及半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定不同浓度的葡萄糖对体外培养的大鼠腹膜间皮细胞细胞周期分布和p21WAF1mRNA表达的影响.结果在高糖的培养条件下,大鼠腹膜间皮细胞出现细胞肥大,胞核增多,细胞分裂停止,且大多数间皮细胞的细胞周期停滞于G1期.在静止期的间皮细胞几乎无p21WAF1mRNA的表达,在高浓度葡萄糖刺激下p21WAF1mRNA明显增加,且随着浓度增高而表达增高,且含糖浓度为3.86%时p21wAF1的表达比含糖为1.38%时明显增高(P＜0.05).在和含糖浓度为3.86%、1.38%组渗透压相同的甘露醇组也几乎无p21wAF1mRNA的表达.结论p21wAF1可能在高糖对间皮细胞的抑制作用及G1期阻滞中起重要的调节作用.     

川芎嗪对慢性腹膜透析大鼠腹膜功能及间皮细胞形态的影响

目的 探讨不同剂量的川芎嗪对高糖透析液作用下慢性大鼠腹膜透析（腹透）模型腹膜间皮细胞的形态和功能的影响及它们之间的关系。方法 ４０只ＳＤ大鼠随机分为４．２５％腹透液（ＨＧ组）、４．２５％腹透液＋４０ｍｇ／Ｌ川芎嗪（ＨＧＬ组）、４．２５％腹透液＋１６０ｍｇ／Ｌ川芎嗪（ＨＧＨ组）、对照组。除对照组外,余３组每天分别腹腔内注入２０ｍｌ含不同剂量川芎嗪的４．２５％透析液［０（ＨＧ）、４０ｍｇ／Ｌ（ＨＧＬ）     

生脉液拮抗乳酸盐腹膜透析液对人腹膜间皮细胞的损伤

目的研究生脉液对乳酸盐腹膜透析液(L-PDS)致腹膜间皮细胞增殖及损伤作用的影响.方法采用胰蛋白酶-EDTA消化法,从人腹膜组织中分离间皮细胞,并建立体外人腹膜间皮细胞(HPMC)培养模型.以四甲基偶氮多胍(MTT)法测定HPMC增殖程度,采用自动生化分析仪检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平示细胞损伤程度.以不同内容的培养液及不同时间进行观察,分为单纯培养液对照、不同浓度葡萄糖L-PDS、不同浓度生脉液加L-PDS.结果与单纯培养液对照组相比,L-PDS致HPMC培养液中LDH水平明显增高,并显著降低MTT渗入量(P＜0.01);而3种浓度(1.5%、2.5%和4.25%)葡萄糖腹膜透析液(腹透液)间差异无显著性意义.在与2.5%L-PDS作用45 min后,1 mg/ml浓度的生脉液能显著降低LDH水平[(7.21±1.32)U/L对(15.87±4.16)U/L,P＜0.05],提高MTI渗入量(吸光度A值0.201±0.053对0.123±0.036,P＜0.01);而100μg/ml浓度生脉液只能显著降低LDH水平[(8.16±2.05)U/L对(15.87±4.16)U/L,P＜0.001],对MTT渗入量无明显改变.上述作用240 min后,两种浓度生脉液引起LDH水平及MTI渗入量的变化差异均无显著性意义.结论生脉液能拮抗乳酸盐腹透液对HPMC的损伤及抑制作用.     

脂多糖对人腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白-1表达的影响

目的：研究脂多糖（lipopolysaccbaride，LPS）对人腹膜间皮细胞（HPMC）葡萄糖转运蛋白1（GLUT-1）表达的影响。方法：胰蛋白酶消化法进行FIPMC的原代培养及传代；免疫组化法（ABC）用于GLUT-1的鉴定和半定量分析：采用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）检测GLUT-1的mRNA表达；己糖激酶法用于葡萄糖浓度的测定，计算出培养液内葡萄糖的减少量作为细胞对糖的净利用。结果：（1）体外培养的HPMC细胞角蛋白用间接免疫荧光染色为绿色荧光．此为HPMC的特征；（2）LPS可以使正常糖浓度下（0、1％）FIPMC GLUT-1的蛋白和mRNA的表达增加（P〈0．05），呈时间和浓度依赖，并伴有细胞对葡萄糖净利用增加，其中作用24h后，浓度为100μg／ml的LPS使GLUT-1的蛋白和mRNA表达最大（P〈0．01），而100μg／ml组LPS作用24h后，GLUT-1的蛋白和mRNA的表达最大（P〈0．01），作用36h有所下降；（3）高糖条件下（4．25％），LPS可以使GLUT-1的蛋白和mRNA表达增加，与高糖组和正常对照相比有统计学差异（P〈0.05）。结论：LPS可以使HPMC GLUT-1表达和葡萄糖摄取增加，这种作用在高糖条件下更为显著。这为研究和防治腹膜炎时腹透失超滤提供了线索。     

透明质酸合成酶-2在人腹膜间皮细胞透明质酸合成及胞外基质形成中的作用

目的 明确哪一种透明质酸合成酶是人腹膜间皮细胞合成透明质酸及形成细胞外基质/胞衣样结构的主要酶。方法 分离培养人腹膜间皮细胞,以半定量RT-PCR法检测其3种透明质酸合成酶HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA水平表达情况。明确正常培养人腹膜间皮细胞主要表达HAS-2mRNA和微量HAS-3 mRNA后,设计HAS-2的反义寡核苷酸序列,以脂质体介导法将其转入正常培养的人腹膜间皮细胞。转染前(0 h)、转染后8、24、48 h以RT-PCR法观察HAS-2 mRNA表达情况,并以微粒排除法观察细胞衣样结构面积变化。结果 转染后8和24 h,HAS-2 mRNA表达分别下降58％和89％(P均<0.05);转染后48 h HAS-2 mRNA表达已部分恢复至正常表达的25％水平(P<0.05)。相应地,转染后24 h以微粒排除法观察人腹膜间皮细胞细胞外基质/胞衣样结构面积与细胞体面积比值,亦明显减少至几乎完全消失。作为对照的正义序列和逆转序列则无该作用。结论 HAS-2是正常培养人腹膜间皮细胞合成透明质酸以及细胞外基质/胞衣样结构形成的关键酶。     

高糖对人腹膜间皮细胞整合素表达的影响

目的:研究高糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)整合素表达的影响,探讨腹膜透析中腹膜间皮细胞层完整性损伤的机制.方法:采用人腹膜间皮细胞株HMrSV5为研究对象.观察高浓度葡萄糖对HPMC细胞膜表面整合素表达及基质黏附性的改变,并采用免疫荧光技术观察高糖对细胞Actin微丝骨架的影响.结果:(1)高糖致细胞脱落呈时间依赖效应;(2)高糖引起细胞膜上β1整合素的表达明显减低;(3)高糖使Actin微丝骨架解体;(4)高渗透压组未见上述效应.结论:高糖使β1整合素表达下降,微丝骨架解体,从而损害细胞-基质间黏附的形成,造成腹膜间皮完整性的损害.     

川芎嗪抗腹膜间皮细胞损伤的实验研究

目的：观察含川芎嗪腹透液体外对腹膜间皮细胞活力,细胞增殖的影响。方法：分离,培养大鼠腹膜间皮细胞,用细胞计数法,四唑氨蓝（MTT）法,乳酸脱氢酶（LDH）法检测腹膜间皮细胞活力,细胞增殖能力。结果：培养的腹膜间皮细胞暴露于常规使用的4．25％高糖透析液30min后,间皮细胞数量显降低,MTT法示OD值显低于正常对照组,LDH释放增加,提示间皮细胞活力降低,增殖受到显抑制,加入低剂量川芎嗪后,间皮细胞数,MTTOD值较之单纯高糖透析液组均显增高,LDH显降低,但随着剂量的加大,川芎嗪的上述作用减低乃至消失,结论：适当剂量的川芎嗪能对抗常规腹透液引起的间皮细胞抑制和损伤,从而具有保护间皮细胞的作用。     

神经酰胺在葡萄糖腹膜透析液诱导的腹膜间皮细胞凋亡中的作用

目的 观察葡萄糖腹膜透析液(PDS)对人腹膜间皮细胞(PMC)凋亡的影响和细胞内神经酰胺在PMC凋亡中的作用,初步探讨神经酰胺信号通路是否参与高浓度PDS诱导的PMC凋亡.方法 PMC分别在正常对照、1.5％ PDS、4.25％ PDS条件下培养,以4.25％甘露醇作为高渗对照.高压液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)检测细胞内神经酰胺的变化.Annexin - FITC- PI双染流式细胞术检测细胞凋亡.Western印迹法检测bax、p53、bcl-2蛋白表达.结果 (1)PDS可上调PMC细胞内神经酰胺表达,正常对照组、高渗对照组对细胞内神经酰胺均无明显影响.酸性鞘磷脂酶抑制剂地昔帕明可显著抑制高浓度PDS诱导的神经酰胺生成[(56.08±12.24)μg/L比(91.25±15.89) μg/L,P＜0.01].(2)与1.5％ PDS组相比,4.25％PDS可显著诱导PMC细胞凋亡[(26.65±6.21)％比(4.04±1.86)％,P＜0.01],上调bax、p53蛋白表达(P＜0.01),下调bcl-2蛋白表达(P＜0.05).地昔帕明可明显抑制高浓度PDS诱导的PMC细胞凋亡,bax、p53上调以及bcl-2下调(均P＜0.05),外源性神经酰胺则可明显逆转地昔帕明的此类作用(P＜0.05).正常对照组、高渗对照组对细胞内神经酰胺表达及细胞凋亡均无明显影响.结论 细胞内神经酰胺增加可能参与了高浓度PDS诱导的PMC凋亡.     

高糖对人腹膜间皮细胞局部内皮素系统表达的影响

目的:研究高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)局部内皮素系统表达的影响,并应用非特异性内皮素受体拮抗剂即ETA/ETBR拮抗剂PD142893进行干预,探讨高浓度葡萄糖透析液导致腹膜受损的机制.方法:以人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)为研究对象,采用放免法检测不同时间(12 h、24 h和48 h)、不同浓度(50、100、150、200、250 mmol/L)的葡萄糖、甘露醇作用下HPMC分泌的ET-1水平.采用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测局部内皮素系统ET-1、ETAR、ETBR及ECE的基因表达.采用ELISA检测不同浓度ET-1、葡萄糖作用下IL-1β水平,并在此基础上加入PD142893,观察IL-1β的变化.结果:(1)正常HPMC分泌低水平的ET-1,高浓度的葡萄糖可诱导HPMC分泌 ET-1增加,呈时间和剂量依赖.高浓度的甘露醇作用下,HPMC分泌的ET-1与正常对照组相比未见明显差异.(2)正常HPMC表达完整的ET-1、ETAR、ETBR、ECE mRNA.高糖作用下ET-1、ETAR、ETBR mRNA表达增强,而高糖对ECE mRNA的表达无明显影响.(3)ET-1、高糖刺激HPMC分泌IL-1β,呈剂量依赖.PD142893可明显减少高糖诱导的IL-1β的分泌.结论:正常HPMC存在局部内皮素系统,高浓度葡萄糖诱导其表达增加,高浓度葡萄糖透析液导致腹膜受损可能部分通过内皮素途径,内皮素可能是导致CAPD患者腹膜纤维化的重要因素.     

细胞周期抑制蛋白p27在慢性腹膜透析大鼠腹膜间皮细胞肥大中的作用

目的探讨含糖腹膜透析(腹透)液作用下慢性腹透大鼠模型腹膜间皮细胞的形态与p27表达的关系.方法 30只SD大鼠随机分为4.25%腹透液组(高糖组)、林格氏液组(林格组)和对照组3组8周后进行细胞印片,并用IBAS 2.0图像分析系统进行形态学分析,免疫组织化学方法检测p27表达水平.结果与对照组和林格组相比,高糖组细胞密度显著减少(P＜0.01),表面积明显增大(P＜0.01)与对照组(22 4±0.99)和林格组(2.52±1.25)相比,高糖组间皮细胞p27的表达显著增多(1O.43±3.78,P＜0.01).腹膜间皮细胞p27的表达上调与高糖诱导的间皮细胞的肥大呈显著的正州关(r=0.998,P＜0.O1).结论 D27的表达上调可能是长期腹膜透析高糖诱导间皮细胞肥大的可能机制之一.     

间皮细胞在CAPD患者宿主腹膜防御中的作用

ＣＡＰＤ诱发腹膜炎是临床常见并发症，间皮细胞作为构成腹膜的主要细胞群体，在腹膜炎症时直接与细胞接触。本文针对间皮细胞参与腹膜炎症的活化、直接抗菌防御及通过抗原提呈参与腹膜抗感染免疫等功能作一综述。阐明间皮细胞在ＣＡＰＤ患者宿主腹膜防御中的作用。     

过氧化氢对人腹膜间皮细胞产生IL-8、MCP-1的影响

目的：研究不同浓度的过氧化氢对培养的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMC)产生趋化蛋白—百介素—8(IL—8)、单核细胞趋化蛋白—1(MCP—1)的影响以及高糖环境下、抗氧化剂丙酮酸存在时过氧化氢作用的改变。方法：分别在不同浓度的葡萄糖环境下，用不同浓度外源性小剂量过氧化氢、丙酮酸刺激细胞，用半定量PT—PCR方法测IL—8、MCP—1基因水平，用ELISA方法测定IL—8表达。结果：(1)亚毒剂量的过氧化氢可以使HPMC表达IL—8增加，但对MCP—1 mRNA的影响不大。且高糖环境下，外源性过氧化氢能够使HPMC产生更多的IL—8。(2)加入丙酮酸后，IL—8的表达下降，而MCP—1的表达未见明显的改变。结论：(1)外源性小剂量的过氧化氨可使HPMC产生IL—8增加，且高糖环境使之作用增强，可能增加透析液的生物不相客性。(2)丙酮酸能够对抗氧化应激，对HPMC具有保护作用。     

尿酸对腹膜间皮细胞(HPMC)增殖、损伤的影响

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腹膜透析液对腹膜间皮细胞凋亡与增殖的影响

目的　探讨PD 2腹膜透析液 (腹透液 )在体内对腹膜间皮细胞凋亡和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法　在正常二级SD大鼠上建立腹膜透析模型 ,用不同浓度的PD 2腹透液灌注腹腔 ,二次 /天 ,2 0ml/次 ,生理盐水作对照。透析第 8周后杀检 ,取腹膜用LSABkit和TUNELkit作免疫 凋亡双重染色。结果　腹透液显著诱导腹膜间皮细胞凋亡 ,以高渗糖腹透液尤为显著 ,不同浓度腹透液对PCNA影响则不同 ,透析液诱导的凋亡与PCNA表达之间无相关性 ,但与腹透液浓度正相关 ,PCNA表达则与腹透液浓度负相关。结论　腹透液可诱导腹膜间皮细胞凋亡 ,并影响PCNA表达 ,其作用与腹透液浓度不同而异。     

线粒体呼吸链在高糖腹膜透析液诱导人腹膜间皮细胞层高通透性中的作用

目的 研究线粒体呼吸链在高糖腹膜透析液（PDS）诱导人腹膜间皮细胞（HPMC）通透性升高中的作用,探讨高糖PDS导致腹膜高通透状态的分子机制。 方法 体外培养HPMC,用不同浓度葡萄糖PDS加或不加抗氧化剂谷胱甘肽,培养24 h。采用跨细胞电阻（TER）技术测定HPMC通透性的变化;免疫荧光及Western印迹观察claudin-1的表达;线粒体活性氧（ROS）荧光探针检测细胞线粒体ROS的生成;线粒体呼吸链酶复合物活性检测试剂盒检测复合物Ⅰ~Ⅳ的活性变化。 结果 各组细胞的TER值均随时间的延长而下降,4.25% PDS组TER值24 h内从（34.7±1.5） Ω&#8226;cm2下降至（4.3±1.4） Ω&#8226;cm2;高糖PDS使细胞间连接蛋白claudin-1的表达显著下调,葡萄糖浓度越高作用越明显;同时高糖PDS导致线粒体呼吸链酶复合物Ⅲ活性较对照组下降89.2%（P < 0.01）,进而使线粒体ROS产生增加。谷胱甘肽可逆转上述指标的变化。 结论 高浓度葡萄糖PDS通过抑制线粒体呼吸链酶复合物Ⅲ的活性,引起HPMC的氧化损伤,进而导致腹膜间皮细胞层的高通透性增高。     

尿酸对腹膜间皮细胞(HPMC)增殖、损伤的影响

with various concentrations (200 ～ 1000 umol/L) uric acid increased the level of LDH at dose -dependent and time -dependent manner in HPMC. Conclusions The results indicate that uric acid may inhibit proliferation of HPMC and led to HPMC damage in vitro.     

高糖对基质金属蛋白酶2及其抑制剂在人腹膜间皮细胞中表达的影响

目的 研究高糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)基质金属蛋白酶2(MMP2)及其组织抑制剂(TIMP)1、TIMP2基因及蛋白表达的影响,以及对人腹膜间皮下细胞外基质(ECM)降解的可能作用。方法 利用腹膜透析(腹透)患者腹透流出液标本原代培养HPMC并进行传代,采用半定量RT-PCR方法研究高糖高渗对HPMC的MMP2、TIMP1、TIMP2基因表达的影响。利用免疫组织化学(组化)及Zymography方法检测HPMC的MMP2、TIMP1、TIMP2蛋白表达。结果 HPMC存在MMP2、TIMP1、TIMP2基因及蛋白表达,4.25%葡萄糖显著上调HPMC的TIMP1基因表达(P<0.01),高渗对HPMC的TIMP1基因表达无明显影响(P>0.05),高糖高渗对HPMC的MMP2、TIMP2基因表达无明显影响(P>0.05)。结论 HPMC能够通过MMP/TIMP系统影响到腹膜ECM的降解,高糖可能通过诱导HPMC的TIMP1与MMP间表达失衡,在促进腹膜纤维化的进展中发挥一定作用。     

人腹膜间皮细胞中UTB表达的研究

目的：研究人腹膜间皮细胞（HPMC）中尿素转运蛋白（UTB）的表达。方法：收集患者腹膜透析液,采用细胞悬液分离HPMC,并进行HPMC原代及传代培养;免疫组化法鉴定体外培养细胞;抽提HPMCRNA,RT-PCR法扩增基因片段,以人肾髓质为对照,对扩增产物进行测序分析。结果：HE染色及免疫组化鉴定细胞角蛋白和波形蛋白染色均为阳性,细胞第Ⅷ因子相关抗原及白细胞CD45抗原染色均呈阴性,证实培养细胞为HPMC,纯度可达96%以上,RT-PCR扩增产物经电泳检测与预期结果相符243bp,扩增产物测序结果与UTB序列比较结果一致。结论：HPMC中存在UTB表达,本研究有助于进一步了解腹膜透析超滤不充分的机制,为其临床防治提供依据。     

锌离子对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞凋亡的影响

目的：研究锌离子（Zn）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）凋亡的影响,从而为锌离子在腹透相关腹膜炎中的应用提供理论基础.方法：胰蛋白酶消化法培养原代大鼠腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组：（1）对照组; （2） LPS组; （3） ZnSO4组; （4） ZnSO4/LPS组.应用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测RPMC凋亡率,并采用Westen Blot方法检测P-Akt,天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白酶3（caspase3）,天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白酶8（caspase8）蛋白表达;酶联免疫吸附方法（ELISA）检测上清液TNFα,TGF-β1,sFas和d sFasL的表达.结果：与对照组相比,LPS组RPMC凋亡细胞数量和相关凋亡蛋白（caspase3,caspase8）表达升高.与LPS组相比,ZnSO4作用组RPMC凋亡细胞数量和相关凋亡蛋白（caspase3,caspase8）表达明显降低.LPS组上清液中TNFα,TGF-β1,sFas和d sFasL浓度显著高于对照组;ZnSO4作用组上清液中TNFα,TGF-β1,sFas和sFasL浓度显著低于LPS组.与LPS组相比,ZnSO4作用组P-Akt的表达明显升高.结论：ZnSO4可能可以逆转LPS所致的RPMC凋亡,对腹膜透析相关腹膜炎过程中所导致的RPMC损伤具有保护作用,其作用机制可能是通过PI3K/Akt通路而发挥作用.