莲多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶是一类普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,由核基因编码能与铜相结合的金属蛋白酶。它是许多果蔬等农产品酶促褐变的主因,也在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用。用RT—PCR方法,从中国莲（Nelumbo nucifera）幼叶RNA中成功扩增出ppo的部分序列,经克隆测序,得到长度在978-1057bp的序列共7个,编码326～352个氨基酸。与其他物种PPO进行比较,其核苷酸序列相似性为83％-85％,氨基酸序列相似性为84％99％。莲ppo的成功克隆为抑制莲藕的酶促褐变,提高莲的抗虫抗病性等的研究打下了良好的基础。     

莲查尔酮合酶基因的克隆及序列分析

查尔酮合酶(chalconesynthase,CHS)是植物花色素苷等类黄酮化合物生物合成途径中的一个关键酶,而这些类黄酮化合物在花瓣中的含量可以改变花的颜色,所以CHS在植物中的表达量直接影响花的颜色。用RT-PCR方法,从中国莲(Nelumbonucifera)幼叶RNA中成功扩增出chs外显子2的部分序列,经克隆测序,得到长度在844bp￣936bp的序列共7个,编码282￣312个氨基酸。在GenBank中与黑核桃,山茶花,红杜鹃等其它物种CHS进行比较,其核苷酸序列相似性为82%￣83%,氨基酸序列相似性为86%￣97%。莲chs的成功克隆为莲的花卉基因工程研究等打下了良好的基础。     

莲瓣兰大雪素AP1MADS-box基因的克隆和系统发育分析

随着植物中越来越多的MADS-box基因被克隆出来,人们对经典的ABC模型进行了改进和完善,提出花发育的ABCDE模型,通过RT-PCR和RACE技术从莲瓣兰大雪素花器官中克隆得到AP1同源基因AP1a和AP1b的cDNA全长:AP1a基因全长为1 054 bp,其开放阅读框为744 bp;AP1b基因全长为944 bp,其开放阅读框为516 bp.从莲瓣兰大雪素中得到2个AP1同源基因,说明在大雪素中AP1出现基因松弛,所以出现多个拷贝.通过序列比对以及系统发育分析表明,莲瓣兰AP1a基因与春兰具有很高的相似度,达到99.1％,莲瓣兰AP1b基因与萼脊兰具有中等程度的相似度,达75.8％,但从大雪素花器官提取的同源基因AP1a和AP1b的相似度很低,仅为65.4％.这表明AP1基因在不同品种植物间具有保守性,而在同一个物种中又存在着功能的分化.     

青花菜BoMYB基因的克隆与序列分析

通过培养青花菜幼苗并提取DNA,以所得DNA为模板克隆青花菜MYB基因,并对该基因进行测序。测序后,利用生物信息学手段进行序列分析,包括寻找同源序列、同源序列蛋白质翻译比对、分析翻译所得蛋白质的理化性质和二级结构,预测结构域和构建系统发育树。从青花菜中克隆得到的BoMYB基因,其编码263个氨基酸,蛋白序列中具有2个SANT结构域。对比在拟南芥中的研究推测,该基因可能在渗透胁迫响应中起作用。系统发育分析结果表明,BoMYB与欧洲油菜的MYB聚为一组,它们与拟南芥的MYB处于不同分支。对BoMYB基因的克隆与序列进行分析,为探究青花菜MYB基因的表达、功能及抗逆机理研究奠定了基础。     

三河马生长激素基因的克隆与序列分析

为进一步探明三河马遗传分化,参考牛(M57764)、羊(AF002110)、猪(M17704)、人(J03071)和鼠(X12630)等哺乳动物GH基因序列,设计一对特异引物,用PCR方法从三河马基因组中扩增出一条长约2kb的DNA片段。PCR产物经pGEM-Teasy载体转化感受态DH5α株大肠杆菌,获得重组克隆子。DNA测序表明:三河马生长激素基因DNA序列长1923bp,含完整的5个外显子和4个内含子,与猪、狗、牛、羊的GH的cDNA序列同源性分别为94.47%,92.63%,90.06%和90.37%。其cDNA所编码氨基酸与猪、狗、牛、羊同源性分别为97.21%,96.74%,88.84%和88.37%,表明该基因在进化过程中是保守的。     

牦牛MSTN基因分子克隆及序列分析

设计特定引物对牦牛MSTN基因PCR分段扩增并克隆和测序,利用分子生物学软件进行序列拼接,获得牦牛MSTN基因序列(GenBank登录号EU926670).该基因由3个外显子和2个内含子组成,CDS序列全长为1 128 bp(GenBank登录号EU926671),由375个氨基酸组成.外显子大小分别为373,374,381 bp,内含子大小分别为1 843,2 028 bp.牦牛与普通牛的MSTN基因编码区中,在417位发生一次碱基转换(C→T),但未造成氨基酸改变.不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的相似性,牦牛与普通牛、绵羊、猪、人、狗、小鼠、马、兔子、鸡、猩猩各物种间核苷酸相似性大小分别为99.9％,96.5％,94.3％,89.1％,91.9％,91.3％,93.6％,91.7％,82.0％,92.0％.牦牛与普通牛MSTN氨基酸序列相似性最高,为100％;而与绵羊、猪、小鼠、人、狗、马、兔子、鸡、猩猩各物种间相似性大小分别为93.3％,95.5％,92.5％,94.1％,93.3％,94.9％,94.4％,88.0％,94.4％.生物信息学软件分析发现:牦牛MSTN基因编码蛋白的理论分子量约为42.6 kDa,PI值为6.14,Leu的含量最高(9.9％),其次是Lys(7.2％).牦牛MSTN基因编码蛋白二级结构以β折叠为主,属于跨膜蛋白,跨膜区位于AA6-AA23之间;具有一个分泌信号肽结构,其氨基酸序列MQKLQICVYIYLFMLIVA具有TGF-β家族的特征.     

白菜型油菜DFR基因的克隆与序列分析

By using RACE (rapid amplification ofcDNA ends) based homologous cloning strategy, we have successfully isolated the genomic and full-length cDNA sequences of a gene encoding typical DFR (dihydroflavonol-4-reductase) from black-seeded Brassica campestris L. var. oleifera DC.. The gene, designated BcDFR here, is 1 722bp in length and harbors 5 introns with typical splice sites of plant DFR genes. BcDFR cDNA is 1311bp in length with a 1 158bp ORF as well as a 25bp 5‘ UTR and a 128bp 3‘ UTR. The encoded BcDFR protein is 385 aa with a calculated Mw of 42.85kD and a pI value of 5.55. The nucleotide and amino acid sequences of this gene share extensive homologies to plant DFR genes of wide origins especially high similarities to Cruciferous DFR genes. Sequence analyses such as phylogenetic analysis, conserved domain search and substrate specificity region detection all indicated that BcDFR gene is a quite potentially biofunctional gene. Its cloning enables us to further dissect the possible relatedness between DFR gene and Brassica seed coat color traits and to create transgenic novel yellow-seeded rapeseed germplasm through antisense- or RNAi-suppression of DFR gene expression in black-seeded elite cultivars.     

猪Reg3基因的克隆与序列分析

在猪的肠道组织中克隆Reg3基因,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E.coliJM109,检测阳性克隆、测序并进行序列分析.结果表明:克隆的猪Reg3基因与人、绵羊、马的同源性分别为83.7%,82.3%,82.2%;克隆了猪Reg3全长基因并注册GenBank注册...     

百子莲开花相关基因ApVIN3的克隆及表达分析

研究以百子莲(Agapanthus praecox ssp. orientalis)茎尖组织为材料,利用RACE (cDNA末端快速扩增)方法,获得百子莲VIN3基因c DNA全长序列,命名为ApVIN3,GenBank登录号为KJ472789。序列分析表明,百子莲ApVIN3基因cDNA全长1 943 bp,其中开放阅读框为1 680 bp,编码559个氨基酸,5’非编码区(5’UTR)和3’非编码区(3’UTR)分别为88和175 bp。ApVIN3编码一个具有C4HC3 (cys4-His-cys3)保守序列结构的PHD-finger蛋白,与二穗短柄草(XP＿003573553.1) VIN3蛋白有很高的相似性。实时荧光定量分析表明,ApVIN3在百子莲茎尖中的表达量受温度调控的影响,其表达量随着低温时间的延长逐渐上升。ApVIN3可能在百子莲成花诱导过程中发挥着重要的作用。     

花生NBS-LRR类基因P9的克隆与序列分析

为探索花生NBS-LRR类基因在花生抗病中的分子作用机制,本研究以花生品种‘Z525’为试验材料,采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,克隆了花生叶片中的P9基因。结果表明,获得一个长度为3557 bp的序列,该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF),ORF的长度为3195 bp(93 bp^3287 bp),编码1064个氨基酸(120.4 kD),等电点pI为5.92。序列分析表明,该基因编码的蛋白与花生中假定的抗性蛋白RPP13-like及花生二倍体野生种Arachis duranensis和Arachis ipaensis推测的抗病蛋白At3g14460、RPP13-like高度相似;P9蛋白属于NBS-LRR家族,具有典型的NB-ARC和LRR-3两个保守结构域,推测该基因参与花生抗病调控过程。蛋白质亚细胞定位预测表明该基因编码的蛋白主要位于叶绿体中,可能少量分布于细胞核中,推测该基因可能主要作为叶绿体蛋白参与细胞的抗氧化、抗衰老等抗逆过程,其次作为转录因子参与转录调控作用。本研究克隆了P9基因的全长cDNA序列,并对该基因序列、结构和功能等方面进行了分析,为进一步研究花生抗病分子机制提供理论基础,同时为花生抗病品种的选育提供理论支持。     

莲藕克隆构型与环境的关系

对莲〔Nelumbo nucifera Gaertn〕在水田及鱼塘的克隆生长格局进行了研究,调查了三个或三个以上的品种莲的叶片大小、叶柄高度、节间长度、分枝角度、分枝节位、结藕节位等参数。结果表明,莲根茎分枝类型为单轴型,新生的次生根茎交替着水平伸向上级根茎的两侧,分枝角度62.6~98.7°,品种之间存在差异。不同品种莲叶柄高度、叶柄粗度、根状茎节间长度、根状茎节间粗度随着植株生长越来越大,与以前报道并不一致。主枝结藕节位可作为判断莲藕熟性的指标之一。莲克隆构型在不同品种、不同生长环境之间有明显差异。     

荷花NnMADS6基因的分离与表达分析

为了研究MADS-box E类基因在荷花花器官发育中的作用,以荷花‘重瓣一丈青’(Nelumbo nucifera'Chongban yizhangqing')品种为试验材料,利用RT-PCR克隆获得AGL6-like基因,命名为NnMADS6。序列分析表明,NnMADS6基因全长770 bp,含有1个726 bp的开放读码框(ORF),编码241个氨基酸,C-末端包含典型SEP/AGL6基序。氨基酸序列比对发现Nn MADS6与红花木兰MawAGL6、腊梅ChpAGL6、黑种草NidAGL6、无油樟AmtMADS6、烟草NitMADS6和拟南芥AtAGL6同源性分别为83.5%、81.5%、81.2%、80.9%、73.4%和59.1%,进一步系统进化树分析显示NnMADS6基因聚在AGL6分支中基本被子植物类群,说明该基因属于MADS-box家族AP1/AGL9亚家族AGL6分支同源基因。表达模式分析显示,无论在单瓣型材料或重瓣型材料,NnMADS6基因主要集中在花芽、萼片、花瓣和心皮中表达,花瓣中表达量最高。本研究结果表明,NnMADS6基因在花器官发育尤其在花瓣形成中有调控作用。     

山东莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)种质资源的RAPD鉴定和遗传多样性分析

山东莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)栽培历史悠久,在中国北方具有重要影响。但是,山东莲藕种质资源研究一直没有开展。为收集和保存莲藕种质资源,本研究从山东省8个种植面积较大的地区采集了76份莲藕材料,并利用RAPD分子标记对这些材料进行了遗传相似性分析,共鉴定出38份种质资源。遗传多样性指数分析显示,38份种质资源的Nei's多样性指数(H)平均值为0.26,Shannon信息指数(I)平均值为0.41。研究数据表明,山东莲藕种质资源相对丰富,但要建立高质量的种质资源圃,仍需要加强种质资源的引进。     

日本“肯定列表制”对中国莲藕出口的影响

笔者通过分析比较了日本“肯定列表制”和中国无公害蔬菜规定的农业化学品的残留限量标准。得出：“肯定列表制”对莲藕等蔬菜的农业化学品的残留限量标准种类多，要求严格，对中国莲藕等蔬菜产品的对日出口增加了难度。“肯定列表制”实施3个多月来，中国的莲藕的出口量和创汇额与2005年“肯定列表制”实施前同期相比分别下降了约7.7%和6.6%。对照“肯定列表制”，中国的无公害标准简单，欠具体，农民和莲藕加工出口企业在生产和加工中对“肯定列表制”的认识和重视不够，原料基地建设不能满足加工出口的需要等是中国莲藕生产和加工中存在的主要问题。按“肯定列表制”的要求完善中国的莲藕标准化生产体系，引导农民按标准组织生产，帮助企业建立生产基地，提高莲藕产品的深加工程度，拓展日本以外的出口市场等，是促进中国莲藕出口的有效途径。     

猪嵴病毒CH441株VP1基因的克隆与序列分析

为了深入研究嵴病毒(sw Ko V)主要结构蛋白基因VP1,根据Gen Bank中已发表的猪嵴病基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒CH441株VP1基因,并对其进行克隆与测序分析。结果表明,sw Ko V CH441株的VP1基因为762 bp,与Gen Bank已发表的嵴病毒属的15株嵴病毒序列的VP1基因相比较,sw Ko V CH441株的VP1基因与其他各毒株VP1基因的核苷酸同源性为81.5%~90.2%,氨基酸同源性为86.6%~96.9%,进化分析显示,sw Ko V CH441株与GS-1株之间的亲缘关系较近。生物信息学分析显示,VP1蛋白理论等电点(p I)为4.40,理论分子质量为26.978 2 k Da;其序列上共发现18个磷酸化位点,分别为Ser(7)、Thr(6)和Tyr(5),而蛋白的磷酸化与信号转导有关,预测该蛋白为一重要的信号转导分子;无信号肽和跨膜区。为进一步开展sw Ko V CH441株VP1基因在遗传变异等方面的研究奠定了理论基础。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1ORF2基因的同源性介于97.3%～99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9%～68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。