高效液相层析法纯化人胎盘谷胱甘肽硫转移酶

足月分娩的新鲜胎盘组织制成匀浆后,经高速离心、超速离心,谷胱甘肽(GSH)Sepharose 6B亲合层析,Amicon pM-10膜超过滤及高效液相层析,最终经SDS-PAGE鉴定,结果呈现单一亚基区带,其亚基分子量为25000。 根据我们现有高效液相设备条件,用ODS柱代替RadulovicL等报道的特异阴离子柱,用磷酸盐洗脱液代替含谷胱甘肽、二硫苏糖醇及氯化钾的梯度洗脱液,从人胎盘组织成功地制备了谷胱甘肽硫转移酶(GST)纯酶,全过程在15min内完成,保留时间及主峰面积的重复性均较理想,7次实验结果的变异系数为0.2％,最终纯化578.9倍。本研究为各种形式GST的纯化制备提供了一个新的、重复性好、分辨率高及回收理想的简易方法。     

人胎盘谷胱甘肽S-转移酶的纯化和性质

将人胎盘组织粗匀浆经105000×g超速离心后,用S-已基谷胱甘肽-琼脂糖-6B亲和层析一步纯化法获得电泳纯的人胎盘GST(简称GST-π)。其比活性较粗匀浆高194.7倍,回收率为50％。再经DE_(52)交换柱进一步纯化,用KCl浓度梯度洗脱后为单一锐峰,等电聚集电泳呈一条带,等电点(pI)为4.60。GST-π经TSKgel-G3000SW柱高效液相层析,也为单一对称锐峰,测得其分子量为45.2kD;在SDS-PAGE电泳也为单一区带,测得其亚基单位的分子量为22.5kD。GST-π氨基酸组成分析可检出十六种氨基酸,其中以谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸及甘氨酸含量较高。 GST-π酶动力学研究证明GST-π以GST和CDNB为底物时km值分别为0.16mmol/L和0.55mmol/L,经测定表明,GST-π的最适作用pH值为7.5,在pH6.5—9的范围内较为稳定,体外GST-π在温度超过25℃对容易失活。以GST-π为抗原,得到兔抗人GST-π抗血清,其效价为1:32,与人肝GSTs不发生免疫交叉反应。     

谷胱甘肽硫转移酶基因表达的调控

催化内源性或外源性亲电子化合物与谷胱甘肽(GSH)结合的谷胱甘肽硫转移酶(GST)超基因家族是一族解毒功能蛋白.其基因的表达通过不同的机制受多种物质的调控.根据最近文献资料,对调控谷胱甘肽硫转移酶基因表达的基因结构、调控机制及氧化应激对谷胱甘肽硫转移酶基因表达的调控作用等作一简要综述.     

西藏登山队员谷胱甘肽硫转移酶基因多态性与低氧反应敏感性关系的研究

目的：考察西藏登山队员谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）基因多态性与高原低氧反应敏感性之间的关系。方法：采用高原-平原对照法,通过多重PCR和PCR—RFLP技术检测西藏登山队员和平原汉族人群体内谷胱甘肽硫转移酶基因多态性。结果：GSTT1缺失基因型频率在西藏登山队员和平原汉族人群中有显著性差异（P〈0．05）,OR=1．86（95％CI=101～3．39）;GSTP1-105变异基因型频率差异非常显蓍（P〈0．01）,OR=2．19（95％CI=1．16～4．13）．其等位基因A和G在两组人群中有显著性差异（P〈0．01）。而GSTM1缺失基因型无显著性差异（P〉0．05）,OR=0．78（95％CI=0．43～1．42）。结论：GSTT1和GSTP1-105基因型可能与高原低氧反应敏感性有关。     

离子交换高效液相层析法测定腺苷酸环化酶活性

用离子交换高效液相层析（ＨＰＬＣ）分离并同步测定脑组织腺苷酸环化酶（ＡＣ）反应生成的ｃＡＭＰ,从而直接测定ＡＣ活性。１００℃加热１ｍｉｎ终止ＡＣ反应后,混合物在０℃放置２ｈ。在此期间,反应体系中残留的ＡＴＰ水解酶将反应混合物中大部分剩余的ＡＴＰ水解除去。用二氯甲烷抽提除去罂粟碱等干扰物质,使混合物中的ｃＡＭＰ同蓁物质在Ｓｈｉｍ－Ｐａｋ ＷＡＸ－１阴离子交换ＨＰＬＣ术上基线分离,并可定量测定,用此方     

含谷胱甘肽硫转移酶基因工程菌表达条件研究

将重组谷胱甘肽硫转移酶 (GST)大肠杆菌表达株BL2 1(DE3 )PGEX 作为研究对象 ,进行了生长及表达条件的优化研究 ,分析比较了不同培养条件对菌体生长的影响以及诱导剂的添加量对产物表达量的影响。     

昆虫谷胱甘肽S-转移酶分离纯化的新方法

谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ,ＧＳＴ）是一类具有多种生理功能的同功酶．从蜡螟幼虫（Ｇａｌｅｒｉａｍｅｌｏｎｅｌａ）的提取液中分离纯化谷胱甘肽Ｓ－转移酶的基本方法如下：首先将冷冻的蜡螟幼虫在磷酸缓冲液中匀桨,经１００００ｇ和１０００００ｇ分级离心;取上清液通过ＱＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５离子交换柱层析除去部分色素和杂蛋白;然后采用谷胱甘肽－琼脂糖凝胶亲和层析（ＧＳＨ－ＱＴ４）,四溴酚酞二磺酸盐－琼脂糖凝胶亲和层析（ＢＳＰ－ＱＴ４）,铜离子－琼脂糖凝胶螯合层析（Ｃｕ２＋－ＱＴ４）及ＰＢＥ９４－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＰＢＥ９４）聚焦层析等层析技术进一步分离纯化．将上述方法获得的色谱峰以ＣＤＮＢ和ＤＣＮＢ为底物检测生物活性．具有生物活性部分的蛋白质,通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其分子量．实验结果表明,采用ＧＳＨ－ＱＴ４亲和层析法获得的活性峰,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱上呈现出两条带,分子量为２４ｋＤ,２４．５ｋＤ左右;Ｃｕ２＋－ＱＴ６螯合层析法分离的活性峰,呈现出一条带,分子量为２４ｋＤ左右;ＰＢＥ９４－聚焦层析法分离获得三个活性峰：第一色谱峰,呈现出一条带,分子量为２３ｋＤ左右     

人胎盘谷胱甘肽转硫酶分离纯化的简易方法

谷胱甘肽转硫酶(GST,EC2.5.1.18.)广泛存在于哺乳动物各组织中,催化GSH与化学物质的亲电子基团结合,最终形成硫醚氨酸排出体外,在体内解毒功能上起重要作用。 胎盘型GST(又称GST_x)为酸性蛋白质,p14.8,分子量47000,由两个亚基组成,在正常成人肝中仅含少量。实验证明,在大鼠增生性肝损害时胎盘型GST水平显著升高,故可做为化学性肝癌的一种指标。     

中华稻蝗谷胱甘肽S-转移酶的分离纯化

采用硫酸铵沉淀法和GSH-agarose亲和层析法,对中华稻蝗Oxya chinensis(Thunberg)5龄若虫谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)进行了分离纯化.结果表明:经硫酸铵沉淀,饱和度在60%-80%下沉淀中GSTs比活力较高,饱和度90%时比活力达到最高...     

植物谷胱甘肽转移酶

植物谷胱甘肽转移酶廖祥儒,万怡震,朱新产（西北农业大学园艺系,陕西杨陵７１２１００）关键词谷胱甘肽转移酶谷胱甘肽转移酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓ－ｆｅｒａｓｅ,ＧＳＴ,ＥＣ２．５．１．１８）专一催化谷胱甘肽（ＧＳＨ）巯基与其他化合物的亲电...     

人谷胱甘肽硫转移酶A1在乳酸乳球菌中的表达及活性研究

用RTPCR技术从人肝总RNA中分离扩增了人谷胱甘肽硫转移酶A1基因的cDNA序列,克隆至大肠杆菌表达质粒pET23b,采用蛋白表达筛查法及DNA测序证明该cDNA序列完全正确。重组质粒pET23bhgst转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得高效表达的可溶性hGSTA1产物,其表达量约为大肠杆菌可溶性总蛋白的40%。将hGSTA1cDNA亚克隆至乳酸乳球菌表达载体pMG36e,电穿孔法转化乳酸乳球菌MG1363获得hGSTA1乳酸乳球菌表达株。SDSPAGE及Western杂交分析表明该菌株表达预期大小的hGSTA1融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化获得的hGSTA1蛋白具有较高的谷胱甘肽硫转移酶活性。具hGSTA1酶活性的乳酸乳球菌工程菌可望应用于研制防癌保健乳制品。     

壳聚糖固定化谷胱甘肽硫转移酶的研究

目的：利用壳聚糖固定日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶,并对固定化酶性质及体外催化活性进行研究。方法：利用大肠杆菌BL21(DE3)表达日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶,并从中粗提谷胱甘肽硫转移酶,将其固定在用戊二醛交联的壳聚糖载体上,对游离酶和固定酶的最适pH、温度,游离酶和固定化酶对底物1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和谷胱甘肽(GSH)的亲和力,温度的稳定性进行了研究。结果：固定化酶活回收率可达41．6％,最适pH6．5～7．0,最适温度37℃,对底物(CDNB和GSH)的亲和力略有下降,对温度稳定性大大提高。在体外固定化酶有很好的催化解毒作用。     

东亚飞蝗谷胱甘肽S-转移酶分离纯化

通过硫酸铵沉淀技术和GSH-agarose亲和层析对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)5龄若虫谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)进行了分离纯化。结果表明GSTs活性在硫酸铵各沉淀段均有分布,但在55%～100%沉淀段活性较高,在硫酸铵饱和度为85%时比活力最高,达到420.33μmol/min/mg protein,纯化倍数为18.86。根据硫酸铵粗沉淀谷胱甘肽S-转移酶结果,选择硫酸铵浓度为60%～90%沉淀段进行GSH-agarose亲和层析,纯化后比活力最高达到1365.29μmol/min/mg protein,纯化倍数达到61.25。经SDS-PAGE鉴定,得到的GST为1条带,亚基的分子量约为24kDa。     

昆虫谷胱甘肽S-转移酶蛋白纯化技术研究

昆虫谷胱甘肽S-转移酶蛋白纯化的主要方法是沉淀法、层析法和电泳法。沉淀法是在进行柱层析前常使用的一种方法,但是其纯化倍数较低。层析法纯化倍数较高,但其费用也较高。电泳通常是作为一种辅助方法来使用。利用这些方法,谷胱甘肽S-转移酶蛋白最高纯化倍数为1138倍(马素永等利用层析法和电泳法对亚洲玉米螟谷胱甘肽S-转移酶蛋白进行纯化)。文章讨论了昆虫谷胱甘肽S-转移酶蛋白纯化研究的应用。     

人胎盘谷胱甘肽S-转移酶中巯基的研究

 用巯基试剂5.5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测得人胎盘谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)的总巯基数为每亚基2个,均为表面巯基,,其中一个与DTNB反应快,被修饰后可导致酶活力全部丧失。另一巯基与DTNB反应较慢,可能与酶活力无关。用在12℃测定剩余巯基和Stallcup-Koshland作图法求得DTNB修饰快反应和慢反应巯基的速度常数分别为44056和162min~(-1)(mol/L)~(-1)。底物谷胱甘肽的衍生物S-正辛烷谷胱甘肽(S-o-GSH)能保护GST-π能保护的快反应巯基免受DTNB的修饰,使反应速度常数随着S-o-GSH浓度的增高而降低。S-o-GSH也能保护酶被N-乙基马来酰亚胺(NEMI)修饰失活,但不能保护慢反应巯基被DTNB修饰。另一底物2,4-二硝基氯苯(CDNB)对NEMI的修饰失活没有保护作用。上述结果提示快反应巯基参与GST-π和谷胱甘肽的结合,是组成活性中心的重要基因。