小鼠干扰素-γ基因克隆及其腺病毒载体的构建

目的 构建含有小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)基因的腺病毒载体,为探索IFN-γ在肝纤维化治疗中的作用研究奠定基础.方法 从含有mIFN-γ 基因的质粒载体pORF5-mIFN-γ 中PCR扩增出mIFN-γ 基因片段,双酶切将该基因克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV中,限制性内切酶PmeⅠ线性化pAdTrack-CMV-mIFN-γ,转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌株BJ5183细胞,同源重组.卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd-mIFN-γ,内切酶PacⅠ线性化重组子,用磷酸钙法转染细胞株AD-293进行包装,收集病毒进行鉴定.结果 PCR后测序获得mIFN-γ基因,全长468 bp,与GenBank中发表的mIFN-γ 基因核苷酸序列完全一致.经酶切和PCR证实各中间过程载体均含有目的 基因.包装的病毒Ad-mIFN-γ在转染的4～6 d观察到荧光产生,8～11 d荧光逐渐增加,12 d收集病毒液.蛋白酶K裂解重组腺病毒,经PCR和Western blot方法鉴定,证实携带有目的 基因mIFN-γ.结论 大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便地构建出含有目的 基因的腺病毒载体pAd-mIFN-γ,重组子能够在AD-293细胞中进行包装和扩增,病毒包装的成功为进一步研究mIFN-γ 基因治疗小鼠肝纤维化提供了一个良好的转导载体.     

小鼠IFN-γ基因佐剂对分泌型柯萨奇病毒B3 VP1核酸疫苗免疫作用的影响

目的: 构建小鼠IFN-γ真核表达质粒,观察其对分泌型柯萨奇病毒B3(CVB3)核酸疫苗的影响. 方法: 以RT-PCR扩增小鼠IFN-γ基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3/mIFN-γ,检测其在cos-7细胞内的表达;将分泌型pcDNA3/sVP1, pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ肌注免疫小鼠,每2 wk注射1次,共3次,每次免疫后13 d取血测血清抗体水平. 末次免疫后2 wk,以500 TCID50的CVB3腹腔内感染,观察小鼠的存活情况. 结果: 成功构建了pcDNA3/mIFN-γ并能有效表达;pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数的增加而提高,但两组小鼠抗体滴度和生存率无显著性差异;混合质粒注射组血清的病毒滴度明显低于pcDNA3/sVP1组,且心肌病理损伤明显减轻. 结论: IFN-γ作为基因佐剂,在一定程度上增强了分泌型 CVB3 VP1基因疫苗的免疫保护作用.     

淫羊藿素诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为神经细胞

目的:采用淫羊藿素(icaritin,ICT)改变小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)体外培养微环境,论证ICT提高ES细胞体外定向分化为神经细胞的效应。方法:采用拟胚体培养法,评价ICT对ES细胞体外定向分化为神经细胞的诱导作用;并利用RT-PCR法和免疫荧光法鉴定神经细胞特异基因和蛋白表达谱。结果:ICT在10-7mol/L浓度时,对ES细胞定向分化为神经细胞表型呈现最佳诱导效应,在分化d8 8时,分化率高达80%(P<0.001),并呈良好的量效和时效关系。分化神经表型者表达神经元特异性微管蛋白(β-tubulin Ⅲ)基因和神经胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因,同时伴有神经前体细胞特异性标志蛋白(nestin)及β-tubulin Ⅲ和GFAP特异性蛋白阳性表达。结论:应用拟胚体培养微环境调控法,ICT可诱导小鼠ES细胞定向分化为神经细胞,并与神经发育依赖性特异基因和蛋白表达呈正相关。     

特异性标记胚胎干细胞分化的成血管细胞

克隆小鼠flk1基因启动子和增强子,构建成血管细胞特异性表达GFP载体,并转染小鼠胚胎干细胞(ES).将ES分化形成胚胎体(EB),观察EB中GFP表达,收集第4天的EB细胞进行流式细胞分析和分选,以获得GFP+细胞进行血细胞集落形成实验,以确定GFP标记细胞造血分化潜能.结果显示,成功构建成血管细胞特异性表达GFP载体;转染的ES形成的EB中可见绿色荧光细胞.流式细胞分析结果发现,转基因组EB中的GFP+细胞(27.5%)与对照组EB中FLK1+细胞(28.1%)比较差异无统计学意义;GFP+和FLK1+细胞形成集落数比较差异无统计学意义.表明对ES分化产生的成血管细胞实现了特异性标记,为后续研究ES体外造血分化的分子机制奠定了基础.     

构建携带人/鼠IFN-γ重组腺病毒体外转染人脐带间充质干细胞的实验研究

目的 构建人/鼠干扰素（IFN-γ）的重组腺病毒,体外转染人脐带间充质干细胞（human umbilical mesenchymal stem cells, HUMSCs）,为研究IFN-γ在预防和治疗移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)中的作用提供实验依据。方法 采用PCR法从含有人/鼠IFN-γ基因的质粒中扩增出目的基因片段IFN-γ,然后定向克隆到穿梭质粒载体pDC316中,构建pDC316-IFN-γ,经酶切、PCR及测序鉴定后,再将IFN-γ定向克隆至腺病毒骨架载体,从而构建携带IFN-γ的重组腺病毒载体,并转染人胚肾细胞系293细胞,进行重组腺病毒(Ad-IFN-γ)的包装、生产和纯化;用半数组织培养感染量（50% tissue culture infective dose, TCID50）法检测重组腺病毒滴度。将Ad-IFN-γ及空病毒（Ad-null,作为载体阴性对照）分别转染HUMSCs,在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用Western blot与ELISA法鉴定IFN-γ蛋白的表达。结果 成功构建了携带IFN-γ的重组腺病毒,鼠IFN-γ（Ad-mIFN-γ）的滴度为1.0×10¹⁰ IU/mL,人IFN-γ(Ad-hIFN-γ)的滴度为1.6×10¹⁰ IU/mL, Ad-GFP的滴度为1.0×10⁹IU/mL。Ad-IFN-γ转染HUMSCs后24 h开始观察到绿色荧光,72 h时该荧光表达更强;Western blot和ELISA法均证实HUMSCs表达IFN-γ蛋白。结论 成功构建了携带人/鼠IFN-γ基因的重组腺病毒载体,并证实其可有效转染HUMSCs。     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs).方法 运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,Mlu Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切反应及测序分析加以鉴定.将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度.将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测.结果 构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经Mlu Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致.三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度为0.1×109～1×109TU/mL.pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞.结论 成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性.     

小鼠巨噬细胞转染Rv0901基因后活性的改变

目的 将重组结核分枝杆菌Rv0901基因的重组质粒pcDNA3.1-Rv0901转染小鼠腹腔巨噬细胞,研究结核分枝杆菌Rv0901基因在结核分枝杆菌感染巨噬细胞的过程中所起的作用.方法 制备小鼠腹腔巨噬细胞,分别将pcDNA3.1、pcDNA3.1-Rv0901质粒DNA与绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA混合,以脂质体转染的方式共转染小鼠腹腔巨噬细胞.转染后72 h,分别收集细胞用流式细胞仪检测GFP的表达和细胞凋亡的发生情况,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测质粒的转染情况.收集转染72 h后的细胞培养液上清,检测细胞NO、IFN-γ的释放水平.结果 pcDNA3.1和pcDNA3.1-Rv0901转染的巨噬细胞中均检测到了GFP的表达,转染后的巨噬细胞RT-PCR能扩增出Rv0901的目的 片段,pcDNA3.1-Rv0901转染巨噬细胞后细胞的凋亡率高于空载体对照组[(56.4±2.0)% vs (19.9±1.5)%,P＜0.05], pcDNA3.1-Rv0901转染巨噬细胞后细胞培养液上清中NO和IFN-γ的释放量高于空载体对照组[NO:(40.4±3.0) μmol/L vs (27.5±3.2) μmol/L, IFN-γ:(2.11±0.031) ng/mL vs (0.62±0.025) ng/mL,P均＜0.05].结论 pcDNA3.1-Rv0901转染小鼠巨噬细胞后使巨噬细胞的凋亡增加,NO和IFN-γ的释放量增加,提示结核分枝杆菌Rv0901基因可能导致巨噬细胞的活性增强,与结核分枝杆菌感染巨噬细胞的机理有关.     

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a(mWnt3a)与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达.方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreenl.构建pLVX-Wnt3a-IRES-Zs-Greenl慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组(GFP-NSCs组)和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照.免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达.结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108TU/mL.Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性.Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7d,Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组(P＜0.01).结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs.     

增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

目的:研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况. 方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞,持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况,并计算转染效率. 应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定,50 mL/L胎牛血清诱导细胞分化后,应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力. 结果:荧光显微镜观察显示转染后24 h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达,转染后72 h,大部分细胞表达绿色荧光蛋白,转染效率可达90%. 经传代培养8 wk后,表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70%～75%. 免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性,50 mL/L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞. 结论:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞,并可在细胞中长期稳定地表达,绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植.     

外源性人分化抑制因子3在A549／DDP细胞中的表达及意义

目的:Id 蛋白即分化抑制因子(Id),在人类多种肿瘤中异常表达,并参与肿瘤细胞的增生、分化和凋亡等.文中旨在探讨人分化抑制因子3(Id3)基因体外转染在人肺腺癌细胞顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达及意义. 方法:构建人Id3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体Id3/pEGFP,采用脂质体介导的转染技术将Id3融合基因(Id3-EGFP)导入A549/DDP细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内EGFP的表达情况;半定量RT-PCR检测Id3表达的改变;MTT法观察Id3对细胞的增殖抑制情况. 结果:成功构建人Id3/pEGFP真核表达载体并转染A549/DDP细胞,倒置荧光显微镜下转染的A549/DDP细胞发出强绿色荧光,转Id3/pEGFP质粒的细胞其荧光主要表达于细胞核;RT-PCR结果显示Id3 mRNA在转染后的A549/DDP细胞能有效表达;MTT法结果表明,与对照组相比,转染Id3重组质粒的细胞增殖被抑制. 结论:转染的Id3/pEGFP融合基因在A549/DDP细胞能有效表达,外源性Id3基因能抑制该细胞的增殖.     

代谢型谷氨酸受体4在ES细胞体外分化为心肌细胞中的表达研究

目的:探索代谢型谷氨酸受体4(metabotropic glutamate receptor 4,mGluR4)在小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)体外分化为心肌细胞中的表达情况。方法:采用悬滴培养法,体外诱导ES细胞分化为心肌细胞,分别以维甲酸(retinoic acid,RA)和溶剂二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)作为阳性对照和阴性对照;利用免疫荧光法和流式细胞术,鉴定ES细胞衍生心肌细胞团中心肌特异性蛋白α-actinin/Troponin-T和mGluR4共表达情况;用Western Blot法,考察ES细胞定向分化为心肌细胞过程中mGluR4蛋白表达水平;同时观察了小鼠胚胎心脏发育过程中mGluR4基因和蛋白表达变化。结果:ES细胞及其分化来的早期心肌细胞团均表达mGluR4,随着心肌细胞逐渐成熟,mGluR4蛋白表达水平下调。流式细胞术结果显示,贴壁分化11 d的细胞团中mGluR4与心肌特异性蛋白Troponin-T共表达细胞比率仅为(3.00±1.00)%。同时,小鼠胚胎心脏发育过程中mGluR4基因和蛋白表达也呈下降趋势,直至成体小鼠心脏中不表达mGluR4蛋白。结论:ES细胞体外分化为心肌细胞过程中mGluR4有表达并呈下调趋势,与小鼠体内心脏发育过程中mGluR4表达情况基本一致。     

pcDNA3.1/ SjDLC 和pcDNA3.1/mIFN-γ重组质粒构建及表达

目的 构建日本血吸虫动力蛋白轻链DNA疫苗和小鼠干扰素真核表达质粒,研究其在HeLa细胞及动物体内的表达。方法设计特异性引物,PCR扩增获取动力蛋白轻链(SjDLC)与干扰素-γ(IFN-γ)基因,克隆于pcDNA3.1真核质粒,经双酶切及测序鉴定。将两种重组质粒分别转染至HeLa细胞,Western blot鉴定其表达。真核质粒经左腿股四头肌免疫小鼠,在末次免疫2周后,PCR法检测小鼠肌组织内SjDLC和IFN-γ基因,免疫组织化学法检测基因的表达,MTT法检测T细胞增殖水平。结果PCR和双酶切能检测到280 bp的SjDLC基因及480 bp的IFN-γ基因;Western blot显示在12 kDa和19 kDa处有阳性反应条带,与SjDLC和IFN-γ分子量大小一致,两种基因能在HeLa细胞中表达。PCR及免疫组化显示两种基因能在小鼠肌肉组织中存在和表达。MTT法显示两种质粒均能刺激T细胞增殖。结论成功构建pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA 3.1/ mIFN-γ真核质粒,两种质粒能在HeLa细胞和动物体内表达。     

腺病毒介导mIFN-β基因转染的小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性

目的研究腺病毒(Ad)介导mIFN-β基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性.方法用Ad为载体将mIFN-β基因导入B16细胞,观察mIFN-β基因转染的B16细胞的体外增殖能力及免疫原性的改变.结果当MOI为50～100,即可获得较高的转染效率,达90%±1%,转染细胞能表达分泌mIFN-β并具有生物学活性;AdmIFN-β感染对B16细胞的增殖能力无影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达.结论 Ad载体具有较高的转移效率,并能使其携带的mIFN-β基因有效表达;AdmIFN-β转染的B16细胞的免疫原性显著增强.提示利用Ad载体携带有效的目的基因来治疗肿瘤甚至开发瘤苗是可行的.     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs)。方法运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,MluⅠ、EcoRⅠ双酶切反应及测序分析加以鉴定。将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测。结果构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经MluⅠ和EcoRⅠ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致。三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装后慢病毒测定滴度为0.1×109~1×109TU/mL。pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞。结论成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性。     

绿色荧光蛋白基因在脂肪细胞分化研究中的应用

目的建立人脂肪细胞分化的绿色荧光蛋白活体检测动态模型,为进一步进行脂肪细胞分化及其相关基因表达研究奠定基础。方法用PCR法从培养的人前脂肪细胞总DNA中扩增出过氧化物体酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)基因启动子,将该启动子插入真核细胞表达载体pEGFP-1后转染3T3成纤维细胞及人前脂肪细胞,并诱导脂肪细胞分化。结果在胰岛素、地塞米松及3-异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导下,人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞时表达绿色荧光蛋白基因,而3T3细胞则不能诱导为脂肪细胞及表达绿色荧光蛋白基因。结论脂肪组织特异表达的PPARγ2基因启动子与绿色荧光蛋白基因构成的重组基因转化人前脂肪细胞后,能够用来动态活体检测脂肪细胞分化状态。这一模型的建立为脂肪细胞分化调控的分子机制研究提供一个更加方便的检测途径。     

StarburstTM Polyamidoamine Dendrimers介导的绿色荧光蛋白基因在小鼠体内的表达分布及对恶性疟DNA 疫苗ES312免疫原性的影响

目的研究StarburstTM Polyamidoamine(PAMAM)dendrimers介导绿色荧光蛋白基因在小鼠体内的表达分布及对恶性疟DNA疫苗ES312免疫原性的影响.方法经股四头肌给小鼠注射StarburstTM PAMAM dendrimers与绿色荧光蛋白基因或恶性疟DNA疫苗ES312的复合物.通过流式细胞术、Western blot和间接免疫荧光方法检测绿色荧光蛋白的表达分布和表达量.用ELISA方法检测恶性疟DNA疫苗ES312的免疫原性.结果在注射StarburstTMPAMAM dendrimers/DNA复合物后2 h～7 d内,StarburstTM PAMAM dendrimers携带的绿色荧光蛋白基因的表达在小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉中均能被检测到,在肾总蛋白中所占百分比最高,且各器官管腔内皮细胞中的绿色荧光蛋白表达量较高.小鼠的脑和肾中,在StarburstTM PAMAM dendrimers的存在下,绿色荧光蛋白基因的表达量明显高于裸DNA的表达量.经StarburstTM PAMAM dendrimers携带的恶性疟DNA疫苗ES312诱导的抗体反应水平明显高于单纯裸DNA疫苗所诱导的抗体水平.结论StarburstTM PAMAM dendrimers作为一种低抗原性、非病毒的新型DNA载体,能够明显提高裸DNA在体内的表达水平,诱导产生很强的体液免疫反应.但是,StarburstTM PAMAMdendrimers/DNA复合物在各组织器官中的广泛分布,尤其是透过血脑屏障的能力,已超出疫苗载体的适用范围.作为DNA疫苗载体,要对现有StarburstTM PAMAM dendrimers分子的结构做进一步的修饰.     

增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因共表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达.方法 用PCR技术对cDNA-Rb质粒中的目的基因片段进行扩增,使用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切,切胶回收DNA片段.将其连接入pEGFP-C1,构建pEGFP-C1/Rb94真核表达载体并再进行酶切鉴定.将重组质粒用脂质体转染法转染至人视网膜母细胞瘤细胞(HXO-Rb44)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达,Western blot检测Rb蛋白的表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 重组克隆载体内的目的片段序列与Rb94基因序列完全一致.pEGFP-C1/Rb94酶切鉴定结果与预期结果一致.荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现.Western blot检测结果表明Rb94基因得到了有效表达.流式细胞仪检测结果显示,含Rb94基因的细胞凋亡率为(21.17±0.45)%,明显高于其他组(P<0.05).结论 成功构建EGFP和Rb94真核共表达载体,并可在真核细胞中有效表达,Rb94对视网膜母细胞瘤细胞有明显抑制生长作用.     

小鼠胚胎成纤维细胞介导的IL-12抗S-180肿瘤作用

目的：将IL-12重组载体转染入小鼠成纤维细胞,研究探讨转染后的抗肿瘤作用.方法：取小鼠胚胎获得原代成纤维细胞,应用PEI法将IL-12重组载体转染到小鼠胚胎成纤维细胞,同时设对照.建立肉瘤细胞（S-180）荷瘤小鼠模型,分别接种S-180细胞.于注射瘤细胞后定期给予转染后的成纤维细胞瘤体内注射,并设对照组.于致瘤后第21日处死小鼠,测肿瘤质量; ELISA法检测小鼠血清IL-12及γ-干扰素（IFN-γ）的表达; 检测NK（natural killer cells）细胞活性和脾淋巴细胞增殖情况、CD4/IFN-γ、CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的克隆能力.结果：抑瘤率、NK细胞活性及淋巴细胞增生反应、血清IL-12、IFN-γ水平、CD4/IFN-γ及CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率均高于对照组（P〈0.01）.结论：转染后的IL-12重组质粒可进一步增强机体的免疫功能发挥其抗肿瘤的治疗作用.     

肿瘤特异性T细胞受体基因转染诱导记忆性T细胞体外分化的研究

目的 探讨肝癌特异性T细胞受体基因转染对记忆性T细胞体外诱导分化的影响.方法 以肝癌特异性T细胞受体V β7.1转染PBMC,流式细胞术检测目的基因表达.肝癌细胞BEL-7402刺激诱导记忆性T细胞;以流式细胞术检测记忆性T细胞标志性表面分子表达验证记忆性T细胞表型及分化亚群:以Annexin V-PI双染检测肿瘤细胞的凋亡,ELISA检测细胞因子IFN-γ分泌探讨记忆性T细胞免疫功能.结果 TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达.与PBMC对照组相比.TCRVβ37.1转染组CD45RO表达显著上升.以CD45RA及CCR7表达分析记忆性T细胞亚群显示其表型主要为效应型记忆性T细胞.分化后的记忆性T细胞诱导肿瘤细胞凋亡率及IFN-γ分泌显著上升.结论 肿瘤特异性TCR基因转染可促进以效应型记忆性T细胞(TEM)为主的记忆性T细胞分化.TEM将通过诱导凋亡与分泌细胞因子作用发挥其免疫功能.     

表达mIFN-γ的重组链球菌的构建及其对重组Sj-F1链球菌疫苗免疫调节作用研究

目的 构建表达mIFN-γ的重组链球菌,并与重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗进行联合免疫,观察IFN-γ对重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗的免疫调节效应.方法 用PCR法扩增mIFN-γ基因,亚克隆至链球菌重组质粒pGMB1,经PCR、限制性酶切和测序鉴定筛选阳性重组子.将阳性重组质粒转化链球菌载体,经抗生素抗性转化及染色体PCR鉴定筛选阳性重组链球菌.用Streak blot和Westem blot分析鉴定重组链球菌的表达情况.鉴定后的重组mIFN-γ链球菌与重组Sj-F1链球菌疫苗联合应用,经滴鼻接种免疫昆明小鼠,观察诱导产生的减虫和减卵效果.结果 成功构建了分泌mIFN-γ重组链球菌.Streak blot和Westem blot分析表明重组链球菌能分泌mIFN-γ并可稳定遗传.免疫保护性实验表明,重组mIFN-γ链球菌与重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗联合免疫,减虫率和减卵率分别为31.56％和47.48％,与单用重组Sj-F1链球菌疫苗比较减虫率和减卵率均增加.结论 结果表明,重组mIFN-γ链球菌能增强重组Sj-F1链球菌疫苗抗日本血吸虫感染的保护力.