小鼠腭裂相关基因的克隆及基因表达的意义

目的：筛选外克隆正常组小鼠腭突与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因，探讨它们在腭裂发生过程中表达的意义。方法：建立C57BL／6N小吸腭裂模型，分别提取胚胎12d的正常组及维甲酸处理组小鼠腭突组织中的mRNA，利用PCR的改良消减杂交技术，筛选并克隆小鼠腭突正常发育时期与腭裂形成过程中差异表达的基因及测序。结果：共获得差异表达的基因40个，2个为新基因。结论：克隆的新基因及fau基因对能对腭突间充质细胞的生长、分化具有重要的调控作用。     

脉冲电场联合野生型p53基因诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡

背景:在前期研究基础上,设想将基因电转染作为脉冲电场治疗恶性肿瘤的辅助方法。目的:探讨脉冲电场联合抑癌基因野生型p53基因诱导人宫颈癌hela细胞发生凋亡及相互作用。方法:采用空质粒及含有野生型p53的质粒转染Hela细胞得到Hela-vector、Hela-p53细胞,将Hela细胞、Hela-vector和Hela-p53细胞分别施加固定脉宽100μs、频率1Hz、脉冲数8个、电场强度为1500V/cm的脉冲电场处理。结果与结论:相同参数脉冲电场作用于各组细胞12h后,MTT结果显示Hela-p53组细胞吸光度明显低于Hela组(P<0.05);流式细胞仪及RT-PCR检测结果显示Hela-p53组的早期凋亡率和p53mRNA表达较Hela组明显增加;Westernbolt及激光共聚焦显微镜结果显示与Hela组比较,Hela-p53组细胞Bax蛋白表达明显上升,而Bcl-2蛋白则明显下降,Casepase-3相对荧光强度明显增强。表明野生型p53基因对宫颈癌Hela细胞生长有明显的抑制作用,野生型p53基因可以提高脉冲电场诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的作用。     

转染p21基因对宫颈癌Hela细胞转移的影响

目的探讨p21基因转染对宫颈癌细胞系Hela细胞迁移和侵袭的影响。方法 Lipofectamine2000脂质体介导将pc DNA3.1(+)-p21转染宫颈癌Hela细胞,稳定筛选后用RT-PCR检测转染细胞的p21 mRNA的表达。根据转染的不同实验分为空白组、空载体转染组及p21转染组。细胞迁移和侵袭的测定分别采用细胞划痕实验与Transwell小室实验。结果 RT-PCR发现空白组与空载体转染组细胞的p21基因mRNA无表达,p21转染组细胞p21 mRNA高表达;3组细胞0 h划痕宽度差异无统计学意义(P>0.05),48 h后p21转染组的划痕宽度明显变窄,小于空白组及空载体转染组(P均<0.05),空白组及空载体转染组划痕宽度比较无统计学差异(P>0.05)。Transwell小室实验结果表明,48 h后p21转染组的穿透细胞数明显少于空白组及空载体转染组(P均<0.05),空白组及空载体转染组穿透细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 p21能够明显的抑制宫颈癌细胞的迁移与侵袭。     

p62基因沉默对宫颈癌Hela细胞生长和药物敏感性的影响

目的探讨p62基因沉默对宫颈癌Hela细胞生长和对顺铂敏感性的影响。方法选取宫颈癌Hela细胞株,随机分为对照组、空白shRNA组和p62-shRNA组,其中空白shRNA组转染空白慢病毒载体,p62-shRNA组转染沉默p62表达的慢病毒载体,采用RT-PCR检测各组p62 mRNA表达,CCK法检测各组细胞增殖以及在不同顺铂浓度下细胞存活情况,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果 p62-shRNA组p62 mRNA相对表达量为(0.241±0.096),明显低于对照组和空白shRNA组(P0.05);p62-shRNA组培养24h、48h、72h细胞OD值明显低于对照组和空白shRNA组(P0.05);p62-shRNA组细胞凋亡率为(23.20±2.91)%,明显高于对照组和空白shRNA组(P0.05);0.05mg/L、0.5mg/L和5mg/L顺铂作用下,p62-shRNA组细胞存活率分别为(60.11±3.10)%、(34.38±2.91)%和(22.10±3.00)%,明显低于对照组和空白shRNA组(P0.05)。结论 p62基因沉默可抑制宫颈癌Hela细胞增殖,促进细胞凋亡,增加对顺铂的敏感性。     

氯丙嗪单独及与顺铂联合对人宫颈癌Hela细胞生长影响的研究

目的：探讨氯丙嗪及其与抗癌药物顺铂联合应用对人宫颈癌Hela细胞体外生长的抑制作用，以期为药物治疗宫颈癌寻找更加完善的途径。方法：选取人宫颈癌Hela细胞为研究对象。实验分三组，即氯丙嗪、顺铂、氯丙嗪与顺铂联合组。分别处理Hela细胞48小时。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测氯丙嗪和顺铂及两者联合应用对Hela细胞的生长抑制作用。结果：分别用氯丙嗪、顺铂及联合用药处理细胞48h后，氯丙嗪在浓度为10^-7mol／L、10^-6mol／L、10^-5mol／L、10^-4mol／L时对Hela细胞的抑制率分别为22．74％、41．69％、51．39％、67．45％，与对照组（加入等量培养液）比较，差异有非常显著性（P〈0．01）；顺铂在浓度为0．2μmol／L、0．5μmol／L、1．0μmol／L和2．0μmol／L时对Hela细胞的抑制率为43．88％、48．59％、61．49％和71．52％；两者合用可大大提高对Hela细胞的抑制作用，抑制率分别为49．70％、63．52％、70．42％、76．15％，与单纯应用氯丙嗪或顺铂比较差异有非常显著性（P〈0．01）。结论：氯丙嗪能抑制Hela细胞的生长，且氯丙嗪对顺铂有协同作用，从而丰富了临床上宫颈癌治疗。     

20(S)-人参皂苷Rg3对人宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的作用

目的 观察20（S）-人参皂苷Rg3（SPG-Rg3）对人宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的作用及其可能作用机制.方法 采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法观察SPG-Rg3对Hela细胞的杀伤作用,并计算其半抑制浓度（IC50）.采用流式细胞术检测SPG-Rg3作用后Hela细胞的细胞周期及细胞凋亡情况.结果 SPG-Rg3浓度为20～400 μg/mL时,SPG-Rg3对细胞增殖的抑制率随其浓度的增高而增大,作用强度呈浓度依赖性,二者呈正相关（r=0.922 5,P〈0.05）.SPG-Rg3对Hela细胞的IC50为85.1 μg/mL.经SPG-Rg3作用48 h后,SPG-Rg3实验组Hela细胞处于S期的细胞数与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）;SPG-Rg3实验组处于G2/M期的细胞数明显少于对照组（P〈0.01）.SPG-Rg3实验组Hela细胞于G1期峰前出现显著的凋亡峰,且凋亡细胞数与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）.结论 SPG-Rg3能杀伤体外生长的Hela细胞,并诱导其凋亡.     

宫颈癌相关基因甲基化研究

DNA甲基化属于表观遗传修饰的一种,是真核细胞DNA最普遍的修饰方式,可以通过影响基因突变、表达调控、细胞增殖等调节基因转录活性和表达。研究发现基因启动子甲基化的程度直接影响基因的转录活性,并且呈负相关。由于肿瘤的形成从本质上讲就是细胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活所致,所以异常的DNA甲基化在致癌作用上扮演了重要角色。     

重组人血小板生成素基因的COS—7细胞及在小鼠体内的转移与表达

为了观察重组血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因在COS-7细胞及在小鼠体内的表达,应用DNA重组技术构建了含TPO基因的真核表达质粒pcd2/TPO,用脂质体法将其转染COS-7细胞,用裸质粒DNA直接注射加电脉冲的方法将pcd2/TPO质粒转移到小鼠骨骼肌中.用RT-PCR及ELISA法检测到TPO基因在COS-7细胞的瞬时表达,MTT法显示其有刺激TPO依赖细胞系增殖的活性.RT-PCR及免疫组织化学染色可检测到TPO基因在转基因小鼠骨骼肌的表达,ELISA法定量检测转基因组小鼠血清TPO浓度为(1 185±264)ng/L,明显高于正常小鼠的TPO浓度(250±76)ng/L.本实验实现了TPO基因在小鼠体内和COS-7细胞的转移,为今后TPO基因治疗的研究奠定了实验基础.     

KGFR在宫颈癌组织中的表达及对Hela、CaSki细胞增殖的影响

目的:确定角质细胞生长因子受体(KGFR)在正常宫颈组织、宫颈癌组织中有无表达;了解KGFR对Hela、CaSki 细胞增殖有无影响.方法:①采用免疫组织化学方法对正常宫颈组织(22例)和宫颈癌组织(31例)中KGFR的表达进行测定,比较正常宫颈组织和宫颈癌组织中KGFR的表达有无差异;②3H-TdR掺入试验测定KGFR抗体对Hela、CaSki细胞增殖的影响.结果:①正常宫颈上皮细胞无KGFR表达,但宫颈癌上皮细胞中KGFR表达明显,KGFR在宫颈癌上皮细胞中的表达率为71%;在Ⅱa期宫颈癌中KGFR的阳性表达率高于原位癌(P＜0.05),但Ⅰb期宫颈癌与原位癌及Ⅰb期和Ⅱa期宫颈癌中KGFR的表达在统计学上无差异(P＞0.05).宫颈癌出现深部间质浸润时KGFR的阳性表达率高于浅部间质浸润者(P＜0.05);②在加入2μg/ml KGFR抗体后Hela、CaSki细胞的增殖均减弱,与对照组相比存在差异(P＜0.05).结论:KGFR与宫颈癌的增殖、侵袭有关.在宫颈癌的发生发展中KGFR可能起了一定作用.     

小鼠腭裂相关基因的克隆及基因表达的意义

目的:筛选并克隆正常组小鼠腭突与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因,探讨它们在腭裂发生过程中表达的意义。方法:建立C57BL/6N小鼠腭裂模型,分别提取胚胎12d的正常组及维甲酸处理组小鼠腭突组织中的mRNA,利用PCR的改良消减杂交技术,筛选并克隆小鼠腭突正常发育时期与腭裂形成过程中差异表达的基因及测序。结果:共获得差异表达的基因40个,2个为新基因。结论:克隆的新基因及fau基因可能对腭突间充质细胞的生长、分化具有重要的调控作用。     

人OVCA1基因的克隆及其对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的克隆人的OVCA1基因并探讨其对卵巢癌细胞生长的影响。方法从健康人卵巢组织中提取总RNA,采用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增OVCA1基因并克隆。脂质体法将含有OVCA1质粒和空载体分别转染入A2780细胞,G418筛选稳定转染细胞。MTT法检测OVCA1对A2780细胞生长的影响。结果测序证实获得了OVCA1基因;过表达OVCA1的细胞与对照组相比,生长速度明显减慢(P<0.05)。结论得到了OVCA1基因克隆;OVCA1在体外明显抑制卵巢癌细胞系A2780的生长。     

体外合成特异siRNA及其对Hela细胞端粒酶基因表达抑制的研究

目的 针对端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因不同片断合成2条siRNA,比较其对Hela细胞端粒酶基因表达干扰作用的强弱,从而选择出更好的干扰靶位点.方法 用T7RNA聚合酶在体外转录合成siRNA,将合成的2段siRNA转染Hela细胞,对其干扰作用进行分析、鉴定.结果 用2段合成的特异siRNA转染Hela细胞...     

小鼠Bax的基因克隆及其原核表达

目的 克隆小鼠Bax基因全长编码区,并原核表达小鼠Bax基因全长序列,为从转录水平探讨Bax基因与肿瘤的关系奠定基础.方法 取小鼠骨髓细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从细胞中获得Bax基因,构建重组表达质粒pet28a/Bax;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌ROS,测序鉴定后经IPTG 25 ℃诱导6 h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白,Western blot鉴定.结果 扩增获得的Bax基因CDS区全长579 bp,编码192个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致.成功构建了原核表达载体pet28a/Bax,并在工程菌ROS中获得大量表达.结论 获得了小鼠Bax基因,并成功原核表达和制备出小鼠Bax融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础,并为寻找多种肿瘤性疾病的有效治疗途径提供新思路.     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescen ceprotein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—HPV16 E6。方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP—HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位，用Western blot方法验证其蛋白的表达。结果 表明在空载体pEGFP—C2转染组中，Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP—HPV16 E6转染组中，绿色荧光集中在细胞核中。Western blot的结果确证了pEGFP—HPV16 E6融合蛋白的表达。结论 提示pEGFP—HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及业细胞定位，为HPV16 E6的功能研究提供了线索。     

胚胎干细胞与Nanog基因

目的:胚胎干细胞可塑性强,但只能从胚胎中提取,来源受限使研究阻力加大。Nanog基因的发现为胚胎干细胞的来源提供了一条崭新的途径,文章综述胚胎干细胞与Nanog基因的关系及研究进展。资料来源:应用计算机检索PUBMED2002-01/2006-11期间的相关文章,检索词为"embryonic stem cells,Nanog gene",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库2002-01/2006-11期间的相关文章,检索词为"胚胎干细胞,Nanog基因",并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与胚胎干细胞和Nanog基因研究相关。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到162篇相关文献,35篇文献符合纳入标准,排除的127篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的35篇文献中,分别涉及胚胎干细胞的转录调节、Nanog基因与胚胎干细胞、Nanog基因与p53、Nanog基因与人类等方面的内容。选择其中的30篇作为支持文献。资料综合:胚胎干细胞来源于着床前胚胎的一类未分化的全能性(多能性)干细胞,在一定条件下可以分化为所有功能细胞。一个独特的转录因子网络可能赋予其自我更新,同时抑制分化。通过细胞融合技术,胚胎干细胞能够使一个已分化的细胞重新编排信息而进入具有多潜能的胚胎阶段。调节这一改变的基因应该就在胚胎干细胞中,而Nanog基因可能就是这一候选基因,它具有使未分化的胚胎干细胞产生增殖的能力。Nanog mRNA出现在人和老鼠的多功能干细胞中,但在成人干细胞中却没有。结论:Nanog基因是胚胎干细胞中的多潜能维持因子。通过细胞融合技术,胚胎干细胞能够使一个已分化的细胞重新编排信息而进入具有多潜能的胚胎阶段。     

特异性hTERT-siRNA介导RNAi在Hela细胞中的实验研究

目的:探讨RNA干扰对宫颈癌Hela细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制效应。方法:化学合成靶向于hTERT基因的4个siRNA片段和1个阴性对照小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)片段,分siRNA 1-4、control siRNA和空白对照组共6个组,分别用阳离子脂质体转染法将其导入Hela细胞内,通过RT-PCR和WesternBlot方法分别检测宫颈癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,MTS法检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:siRNA-3组端粒酶活性明显下降,hTERT mRNA表达水平明显下降,hTERT蛋白表达明显下降,细胞凋亡率明显升高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:靶向于hTERT的siRNA能特异性抑制宫颈癌Hela细胞hTERT基因,下调hTERT mRNA及蛋白表达水平,抑制癌细胞生长增殖,促进宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗研究提供实验依据。     

特异性hTERT-siRNA介导RNAi在Hela细胞中的实验研究

目的:探讨RNA干扰对宫颈癌Hela细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制效应.方法:化学合成靶向于hTERT基因的4个siRNA片段和1个阴性对照小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)片段,分siRNA1-4、control siRNA和空白对照组共6个组,分别用阳离子脂质体转染法将其导入Hela细胞内,通过RT-PCR和Western Blot方法分别检测宫颈癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,MTS法检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果:siRNA-3组端粒酶活性明显下降,hTERT mRNA表达水平明显下降,hTERT蛋白表达明显下降.细胞凋亡率明显升高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05).结论:靶向于hTERT的siRNA能特异性抑制宫颈癌Hela细胞hTERT基因,下调hTERT mRNA及蛋白表达水平,抑制癌细胞生长增殖,促进宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗研究提供实验依据.     

脉冲电场对人宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力的影响

背景：脉冲电场对肿瘤细胞侵袭转移能力是否具有抑制作用尚不十分清楚。目的：探讨不同强度脉冲电场对人宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力的影响及可能的机制。方法：以场强分别为0,500,1000和1500V/cm的脉冲电场作用人宫颈癌Hela细胞后,采用平板克隆形成实验,观察脉冲电场对细胞克隆能力的影响;采用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和转移实验,观察脉冲电场对细胞侵袭和转移能力的影响;采用RT-PCR法检测宫颈癌Hela细胞中基质金属蛋白酶2和RhoC基因mRNA的表达情况。结果与结论：脉冲电场作用后,宫颈癌Hela细胞的克隆能力受到抑制;细胞侵袭和转移能力明显降低;基质金属蛋白酶2和RhoC基因mRNA的表达均明显减弱,且有电场强度依赖性。结果表明,脉冲电场能抑制人宫颈癌Hela细胞的侵袭转移能力,其机制可能与降低RhoC和基质金属蛋白酶2的表达有关。     

克隆并应用计算机软件分析小鼠LASS1基因启动子区的特征

目的:克隆并应用计算机分析小鼠LASS1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控奠定基础。方法:实验于2006-03/07在汕头大学医学院细胞衰老实验室完成。培养EC109细胞株,预测小鼠LASS1基因启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,构建重组质粒pGEM-T-501、pGEM-T-181、pGEM-T-26,并转化JM109感受态菌,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,酶切pGEM-T-501、181、26重组质粒及pGL3-Basic、pEGFP-1载体,制备插入片段和载体,构建重组表达质粒pGL3-501、pGL3-181和pGL3-26及pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26,转化JM109感受态菌。用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①在预测启动子区构建了3种荧光素酶报告基因表达体系及3种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系,分别为pGL3-501(-501bp～ 106bp)、pGL3-181(-181bp～ 106bp)、pGL3-26( 26～ 106)、pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26。②pGL3-501表达载体与pGL3-181表达载体荧光素酶表达活性相近,pGL3-26表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近, 26bp～ 106bp无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-501和pEGFP-181有明显的绿色荧光蛋白表达,pEGFP-26和空载体pEGFP-1无表达活性。结论:-181bp～ 26bp区域含有小鼠LASS1基因转录所必需的基本启动子序列。其中2个SP1保守序列是小鼠LASS1基因启动子所必需的。     

脉冲电场对人宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力的影响

背景:脉冲电场对肿瘤细胞侵袭转移能力是否具有抑制作用尚不十分清楚.目的:探讨不同强度脉冲电场对人宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力的影响及可能的机制.方法:以场强分别为0,500,1 000和1 500 V/cm的脉冲电场作用人宫颈癌Hela细胞后,采用平板克隆形成实验,观察脉冲电场对细胞克隆能力的影响;采用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和转移实验,观察脉冲电场对细胞侵袭和转移能力的影响;采用RT-PCR法检测宫颈癌Hela细胞中基质金属蛋白酶2和RhoC基因mRNA的表达情况.结果与结论:脉冲电场作用后,宫颈癌Hela细胞的克隆能力受到抑制;细胞侵袭和转移能力明显降低;基质金属蛋白酶2和RhoC基因mRNA的表达均明显减弱,且有电场强度依赖性.结果表明,脉冲电场能抑制人宫颈癌Hela细胞的侵袭转移能力,其机制可能与降低RhoC和基质金属蛋白酶2的表达有关.